專(zhuān)利名稱(chēng)：雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面h抗原的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及雜交瘤細(xì)胞株及其產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體。
背景技術(shù)：
人的紅細(xì)胞表面有許多抗原分子，它們結(jié)構(gòu)不同，功能多樣。其中，組成血型系統(tǒng)的表面抗原分子(如A、B、O血型抗原)，主要與輸血安全密切相關(guān)。ABO血型抗原基因直接編碼特異性糖基轉(zhuǎn)移酶，進(jìn)而由這些酶合成寡糖性質(zhì)的ABO抗原。A型抗原表位是N-乙酰基半乳糖，B型是半乳糖，O型是H抗原表位，為巖藻糖。H抗原表位是AB血型抗原的前體。
除稀有的孟買(mǎi)(Bombay)型紅細(xì)胞外，H抗原分布在所有的人紅細(xì)胞表面，屬于紅細(xì)胞共同抗原。直接與H抗原相關(guān)的常見(jiàn)表型分為分泌型和非分泌型，H(FUT1)位點(diǎn)基因編碼365個(gè)氨基酸的α-2-L巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，控制造血組織的α-巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性，決定H抗原在紅細(xì)胞膜上的表達(dá)。SE(FUT2)位點(diǎn)基因編碼332個(gè)氨基酸的α-2-L巖藻糖轉(zhuǎn)移酶，控制分泌組織的巖藻糖轉(zhuǎn)移酶活性，決定H抗原在分泌液的表達(dá)。H血型抗原是多糖體，對(duì)干燥和高熱有較強(qiáng)的抵抗力，甚至170℃不被破壞，并有高度耐久性，在法醫(yī)鑒定方面用途廣泛。紅細(xì)胞膜上H抗原寡糖最主要的是2-型前體糖鏈，L-巖藻糖連接于前體糖鏈末端乳糖構(gòu)成H抗原表位。
除了血型抗原外，紅細(xì)胞還具有許多重要的表面分子。其中，CR1分子為I型補(bǔ)體受體，基因定位于人的1號(hào)染色體長(zhǎng)臂32區(qū)。作為調(diào)理素受體，CR1可以增強(qiáng)吞噬細(xì)胞對(duì)補(bǔ)體包被顆粒以及微生物的吞噬作用。CR1結(jié)合免疫復(fù)合物(IC)，隨紅細(xì)胞將其運(yùn)輸?shù)礁闻K，免疫復(fù)合物與紅細(xì)胞分離后，即被單核細(xì)胞所清除。
在紅細(xì)胞表面抗原系統(tǒng)中，具有共同抗原性質(zhì)的分子，不論是血型抗原(如H抗原等)還是表面分子(CR1、血型糖蛋白A等)，在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與治療研究中均日漸受到重視。
1989年，Kemp利用抗紅細(xì)胞表面的共同抗原-血型蛋白A的單克隆抗體(該單抗為非凝集型單克隆抗體，在鹽水介質(zhì)中不能直接使紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng))，建立了自體紅細(xì)胞凝集實(shí)驗(yàn)，該方法以病人自身的紅細(xì)胞作為檢測(cè)系統(tǒng)的指示細(xì)胞，以特異的非凝集型抗人紅細(xì)胞抗體(或抗體片段)與相關(guān)的抗原或抗體形成的雙功能性分子(特異性分別針對(duì)紅細(xì)胞表面抗原和待檢抗原/抗體)作為檢測(cè)試劑(Kemp BE，Rylatt DB，Bundesen PG，Doherty RR，McPhee DA，Stapleton D，Cottis LE，Wilson K，JohnMA.Autologous red cell agglutination assay for HIV-1 antibodiessimplifiedtest with wholeblood.[J]Science.1988，241(4871)1352-1354.)。當(dāng)向待檢者的全血中加入這種檢測(cè)試劑之后，如果血液標(biāo)本中存在相應(yīng)的抗體或抗原，雙功能性分子的一端(抗人紅細(xì)胞抗體)可與血液中的紅細(xì)胞結(jié)合，另一端與血液中游離的抗體或抗原結(jié)合，通過(guò)該分子的橋聯(lián)作用將紅細(xì)胞凝集在一起，呈現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的血液凝集塊。這一方法簡(jiǎn)便、快速、特異性強(qiáng)，敏感性高，國(guó)外已有使用該法對(duì)HIV抗體進(jìn)行檢測(cè)的報(bào)道。
1991年Tailor(Craig ML，Bankovich AJ，Taylor RP.Visualization of thetransfer reactiontracking immune complexes from erythrocyte complementreceptor tomacrophages[J].Clin Immunol，2002，10536-47)構(gòu)建了以紅細(xì)胞表面的共同抗原CR1為基礎(chǔ)的單抗異聚體，這種單抗異聚體能夠?qū)⒓t細(xì)胞與病變細(xì)胞連接到一起，病變細(xì)胞隨紅細(xì)胞的正常生理代謝過(guò)程，被巨噬細(xì)胞所吞噬。單抗異聚體的應(yīng)用，開(kāi)創(chuàng)了以紅細(xì)胞為載體的藥物治療的新領(lǐng)域。
由此可以看出，無(wú)論是作為載體進(jìn)行藥物治療，還是作為指示細(xì)胞進(jìn)行病原體的檢測(cè)，紅細(xì)胞已經(jīng)不單單是氧氣和養(yǎng)分的攜帶者，已經(jīng)并將會(huì)發(fā)揮更大的平臺(tái)作用。但是，這種作用的發(fā)揮，需要一種基于抗紅細(xì)胞表面共同抗原的單抗為基礎(chǔ)的雙功能性分子作為介導(dǎo)物，以橋聯(lián)方式發(fā)揮作用。因此，獲得性能良好的抗紅細(xì)胞單克隆抗體(簡(jiǎn)稱(chēng)單抗)是試驗(yàn)研究的必要條件，而雙功能分子的制備則是成功的關(guān)鍵。
目前，雙功能性分子的制備方法主要包括化學(xué)交聯(lián)法，雜交瘤融合法和基因工程法?；瘜W(xué)交聯(lián)法，即通過(guò)化學(xué)交聯(lián)劑將抗紅細(xì)胞單抗與另外一株單抗連接到一起。雜交瘤法是通過(guò)將抗紅細(xì)胞單抗與另外一株單抗進(jìn)行融合，篩選出能分泌雙功能性分子的雜交瘤細(xì)胞。這兩種方法主要針對(duì)單抗進(jìn)行操作，但化學(xué)交聯(lián)法中化學(xué)交聯(lián)劑的使用易于破壞抗體活性，而雜交瘤融合法中篩選分泌雙功能性分子的雜交瘤細(xì)胞株的難度較大。采用基因工程法制備雙功能性分子，首先需要克隆抗體(抗紅細(xì)胞單抗以及其它單抗)的可變區(qū)基因，然后在體外通過(guò)酶切、連接等手段構(gòu)建雙功能性分子基因，或者引入抗原肽基因，最后將重構(gòu)的基因進(jìn)行表達(dá)，獲得的融合蛋白即為雙功能分子。
抗體可變區(qū)的獲得是基因工程法制備雙功能性分子的關(guān)鍵步驟?？寺』虻囊镌O(shè)計(jì)包括兩種方法RT-PCR法與5’RACE法。RT-PCR法的引物設(shè)計(jì)主要根據(jù)抗體骨架區(qū)或前導(dǎo)肽序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。由于引物的簡(jiǎn)并性，可變區(qū)的N、C末端不能完全忠實(shí)于原序列，某些氨基酸殘基的改變可影響基因工程抗體的結(jié)合活性，導(dǎo)致基因工程抗體的親和力降低。5’RACE法是對(duì)RT-PCR法的一種改進(jìn)，通過(guò)在5’端添加一段polyC，作為上游引物，下游引物則根據(jù)恒定區(qū)設(shè)計(jì)，這樣可以保證克隆到與親本抗體完全一致的可變區(qū)基因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一株可產(chǎn)生抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
本發(fā)明所提供的可產(chǎn)生抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，名稱(chēng)為2E8Z，該細(xì)胞株已于2007年02月08日保藏于北京中關(guān)村的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1942。
由上述雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體，名稱(chēng)為2E8，來(lái)源于小鼠屬小鼠(Mus musculus)，其重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的多肽；輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的多肽。
序列表中的SEQ ID NO1由117個(gè)氨基酸殘基組成，序列表中的SEQ ID NO2由112個(gè)氨基酸殘基組成。
編碼抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8的基因(2E8)，其重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO3的DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO4的DNA序列或編碼序列表中SEQID NO2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。
序列表中的SEQ ID NO3由351個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至351位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。序列表中的SEQ ID NO4由336個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至336位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。
含有本發(fā)明抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8重鏈和/或輕鏈可變區(qū)編碼基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8重鏈和/或輕鏈可變區(qū)編碼基因的中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種將抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接得到的融合蛋白。
所述融合蛋白中的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可通過(guò)柔性肽連接，所述柔性肽可具有序列表中SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQID NO7的氨基酸殘基序列。
序列表中的SEQ ID NO5為柔性肽(Gly4Ser)3，由15個(gè)氨基酸殘基組成；序列表中的SEQ ID NO6為柔性肽(Gly4Ser)2，由10個(gè)氨基酸殘基組成；序列表中的SEQ ID NO7為柔性肽(Gly4Ser)，由5個(gè)氨基酸殘基組成。
具體來(lái)講，所述融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO8；2)序列表中的SEQ ID NO9；3)序列表中的SEQ ID NO10；4)將序列表中SEQ ID NO8-10的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的蛋白質(zhì)。
序列表中的SEQ ID NO8由244個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基(N)端第1-117位為抗體2E8重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第133-244位為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第118-132位為連接肽(Gly4Ser)3序列，將具有SEQ ID NO8所述氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為2E8R3；序列表中的SEQ ID NO9由239個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-117位為抗體2E8重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第128-239位為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第118-127位為連接肽(Gly4Ser)2序列，將具有SEQ ID NO9所述氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為2E8R2；序列表中的SEQ ID NO10由234個(gè)氨基酸殘基組成，自氨基端第1-117位為抗體2E8重鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第123-234位為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的氨基酸殘基序列，自氨基端第118-122位為連接肽(Gly4Ser)序列，將具有SEQ ID NO10所述氨基酸殘基序列的融合蛋白命名為2E8R1。
編碼上述融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO13的DNA序列；4)編碼序列表中SEQ ID NO8-10的DNA序列；5)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO11-13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
所述高嚴(yán)謹(jǐn)條件為雜交后用含0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％ SDS的溶液在65℃下洗膜。
序列表中的SEQ ID NO11由732個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-732位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第397-732位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-396位堿基為連接肽(Gly4Ser)3的編碼序列，將具有SEQ ID NO11所述核苷酸序列的融合基因命名為2E8R3；序列表中的SEQ ID NO12由717個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-717位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第382-717位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-381位堿基為連接肽(Gly4Ser)2的編碼序列，將具有SEQID NO12所述核苷酸序列的融合基因命名為2E8R2；序列表中的SEQ ID NO13由702個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-702位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第367-702位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-366位堿基為連接肽(Gly4Ser)的編碼序列，將具有SEQ ID NO13所述核苷酸序列的融合基因命名為2E8R1。
含有本發(fā)明融合基因2E8R3的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌也均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
擴(kuò)增上述融合基因中任一片段的引物對(duì)也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
本發(fā)明還提供了一種構(gòu)建上述融合基因2E8R3的方法。
本發(fā)明所提供的上述融合基因2E8R3的構(gòu)建方法，可包括以下步驟1)以含有抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為模板，在由序列表中SEQ ID NO14和SEQ ID NO15組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)編碼基因；2)以含有抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的輕鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為模板，在由序列表中SEQ ID NO16和SEQ ID NO17組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的輕鏈可變區(qū)編碼基因；3)以步驟1)擴(kuò)增的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)編碼基因和步驟2)擴(kuò)增的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的輕鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)槟０?，在由序列表中SEQ ID NO14和SEQ ID NO17組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到融合基因。
在上述融合基因的構(gòu)建方法中，步驟1)中的SEQ ID NO14由37個(gè)堿基組成，SEQ ID NO15由60個(gè)堿基組成，其中，SEQ ID NO14中自5’端第1-6位堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn)；含有抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為pMD-18T-2E8Hchain。
步驟2)中的SEQ ID NO16由60個(gè)堿基組成，SEQ ID NO17由32個(gè)堿基組成，其中，SEQ ID NO17中自5’端第1-8位堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I識(shí)別位點(diǎn)；含有抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體2E8的輕鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為pMD-18T-2E8Lchain。
本發(fā)明還提供了一種表達(dá)上述融合蛋白的方法。
本發(fā)明所提供的表達(dá)上述融合蛋白方法，是將含有上述融合基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到融合蛋白。
所述宿主可為酵母菌、大腸桿菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞或枯草桿菌等，優(yōu)選為大腸桿菌。
所述大腸桿菌可為E.coli JM109、E.coli HB101、E.coli Top10或E.coli TG1等。優(yōu)選E.coli TG1。
用于構(gòu)建所述重組大腸桿菌表達(dá)載體的出發(fā)載體為任意一種可在大腸桿菌中表達(dá)外源基因的表達(dá)載體，如pET-his或pUC-118等。
以pHenIX為出發(fā)載體構(gòu)建的重組大腸桿菌表達(dá)載體為pET-his-2E8ScFv3、pET-his-2E8ScFv2或pET-his-2E8ScFv1。
上述重組表達(dá)載體均可按照常規(guī)方法構(gòu)建。
培養(yǎng)含有本發(fā)明的融合基因的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，均可為培養(yǎng)出發(fā)宿主的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。
當(dāng)所述宿主為大腸桿菌時(shí)，需用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG的終濃度可為0.8-1.2mmol/L。
本發(fā)明提供了一株雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No.1942及其產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體，以及通過(guò)柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)2或(Gly4Ser)3作為linker，將抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)連接在一起得到的融合蛋白。實(shí)驗(yàn)證明，雜交瘤細(xì)胞株CGMCC No.1942產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)、抗原分布廣泛的優(yōu)點(diǎn)。柔性肽Gly4Ser、(Gly4Ser)2和(Gly4Ser)3易于彎曲，因而可使本發(fā)明的融合蛋白正確折疊，且不影響融合蛋白各自的活性結(jié)合區(qū)域。實(shí)驗(yàn)證明，該融合蛋白能特異結(jié)合人紅細(xì)胞表面的H抗原；此外，該融合蛋白還具有表達(dá)量高，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，制備成本低的優(yōu)點(diǎn)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，本發(fā)明為下一步用基因工程法制備雙功能性分子，以及建立基于紅細(xì)胞的治療與檢測(cè)平臺(tái)打下了良好的基礎(chǔ)，將在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。


圖1為5’RACE法擴(kuò)增的2E8單抗輕、重鏈可變區(qū)基因的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖2為融合蛋白基因2E8R3的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖3為融合蛋白2E8R3的SDS-PAGE電泳檢測(cè)結(jié)果圖4為融合蛋白2E8R3的Western Blot鑒定結(jié)果圖5為融合蛋白2E8R3的熒光檢測(cè)結(jié)果圖6為融合蛋白2E8R3的競(jìng)爭(zhēng)抑制檢測(cè)結(jié)果具體實(shí)施方式
下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見(jiàn)《Molecular CloningA Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular CloningA Laboratory Manual，3rdedition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。所有引物合成和測(cè)序工作均由北京奧科生物公司完成。
實(shí)施例1、雜交瘤細(xì)胞株2E8Z的獲得及其產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8的鑒定本發(fā)明的發(fā)明人制備了可產(chǎn)生抗人紅細(xì)胞H抗原的雜交瘤細(xì)胞株，名稱(chēng)為2E8Z，該細(xì)胞株已于2007年02月08日保藏于北京中關(guān)村的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.1942，具體構(gòu)建方法可參見(jiàn)文獻(xiàn)(李卉，潘紀(jì)春，劉子，劉景漢，章金剛?？谷思t細(xì)胞膜抗原非凝集型單克隆抗體的研制及特性鑒定[J]。細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志2005，21(4)473-475)。將該細(xì)胞株產(chǎn)生的單克隆抗體命名為2E8，該單抗的凝集效價(jià)為1∶1024，腹水凝集效價(jià)達(dá)1∶64×106，亞類(lèi)為IgG1、κ鏈?？骨虻鞍籽龑?shí)驗(yàn)證明，2E8單抗凝集時(shí)間為7s，3min內(nèi)凝塊大于1mm2。O型紅細(xì)胞與2E8單抗不發(fā)生凝集反應(yīng)。2E8單抗與11種(小鼠、大鼠、豚鼠、家兔、家豬、小型豬、牛、羊、狗、猴、馬)哺乳動(dòng)物血球無(wú)種屬交叉反應(yīng)。與人的8個(gè)(Rhhr、Kidd、MNSs、Duffy、Diego、KellLewis以及P血型抗原)血型系統(tǒng)、21種抗原均不相關(guān)。該單抗能有效與單核、巨噬細(xì)胞結(jié)合，介導(dǎo)白細(xì)胞吞噬、溶解紅細(xì)胞，與補(bǔ)體結(jié)合后，激活補(bǔ)體，溶解紅細(xì)胞。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明雜交瘤細(xì)胞株2E8Z產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)、抗原分布廣泛的特點(diǎn)。
實(shí)施例2、2E8單克隆抗體可變區(qū)基因的克隆用下述方法克隆2E8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因，具體過(guò)程包括以下步驟一、提取總RNA用Iinvitrogen的TRIzol試劑盒并參照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取實(shí)施例1獲得的可產(chǎn)生抗人紅細(xì)胞表面H抗原的雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942的總RNA。
二、合成cDNA以步驟一獲得的總RNA為模板，oligo(dT)15為引物，用Invitrogen公司的SuperScriptTM-II反轉(zhuǎn)錄酶并按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，50μL反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為總RNA 10μL，oligo(dT)151μL，2.5mmol/L dNTPs 4μL，在65℃下孵育5min，然后冰浴5min，微離心，再加入5×反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)緩沖液(購(gòu)自Promega)5μL，0.1mol/LDTT(購(gòu)自Invitrogen)2μL，1μL 40U/μL RNasin(購(gòu)自Invitrogen)，42℃ 2min，然后加入SuperScriptTM-II 1μL混勻，隨之25℃ 10min，42℃ 50min，70℃ 15min，最后加入2U/μL RnaseH(購(gòu)自Invitrogen)1μL，37℃ 20min。
三、反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的純化連續(xù)兩次用2倍體積的2.5mol/L乙酸銨和3倍體積的乙醇沉淀步驟二的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，以除去過(guò)剩的dNTPs和引物，純化的產(chǎn)物可直接用于PCR擴(kuò)增。
四、5’RACE法克隆可變區(qū)基因用5’RACE法克隆2E8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因，具體方法包括以下步驟1、在合成的cDNA末端添加PloyG尾及反應(yīng)產(chǎn)物的純化在步驟三純化的cDNA末端添加PloyG尾，反應(yīng)體系及反應(yīng)條件為純化的cDNA 5μL，5×TdT緩沖液(購(gòu)自Promega)4μL，100mmol/L dGTP(購(gòu)自Promega)2μL，TdT酶(Promega)2μL，用水補(bǔ)足反應(yīng)體系至20μL，在37℃下反應(yīng)60min。用乙醇-乙酸銨方法(參見(jiàn)《Molecular CloningA Laboratory Manual》)純化帶PloyG尾的反應(yīng)產(chǎn)物，定容至20μL。
2、5’RACE擴(kuò)增首先，根據(jù)抗體恒定區(qū)設(shè)計(jì)5’RACE法擴(kuò)增2E8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因的引物，引物序列如下
PloyC(5’端共享引物)5’-CCCCCCCCCCCCCC-3’；VH3’端引物(擴(kuò)增重鏈可變區(qū)的3’端引物)VRACEFOR5’-ACTAGTACAATCCCCTGGGCACAAT-3’；VL3’端引物(擴(kuò)增輕鏈可變區(qū)的3’端引物)VRACEκFOR5’-TCATGTCGACGGATCCAAGCTTCAAGAAGCACACACTGAGGCAC-3’。
然后，以步驟1純化的帶PloyG尾的cDNA為模板，在引物PloyC和VRACEFOR的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)編碼基因，在引物PloyC和VRACEκFOR的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)編碼基因；反應(yīng)條件均為先95℃預(yù)變性2min；然后94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖1所示(泳道a為Marker，泳道b為重鏈可變區(qū)編碼基因，泳道c為輕鏈可變區(qū)編碼基因)，經(jīng)擴(kuò)增得到了約351bp和336bp的條帶，回收這兩條DNA片段，并用購(gòu)自Promega的DNA純化試劑盒純化回收片段，再將回收片段分別連接入載體pGEM-T(Promega公司)中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆，得到分別含有2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段和重鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組載體，將含有2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組載體命名為pMD-18T-2E8Hchain，將含有2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組載體命名為pMD-18T-2E8Lchain。對(duì)重組載體進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增的2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)編碼序列具有序列表中SEQ ID NO3的核苷酸序列，由351個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至351位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)；擴(kuò)增的2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)編碼序列具有序列表中SEQ ID NO4的核苷酸序列，由336個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1至336位堿基，編碼具有序列表中SEQID NO2的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)。經(jīng)Blast進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果最高同源性達(dá)96％和94％，表明成功克隆了2E8單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因，屬于鼠抗體可變區(qū)重鏈基因家族I(B)亞群和輕鏈基因家族I亞群。
實(shí)施例3、融合蛋白基因2E8R3的克隆及含有該融合基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建一、融合蛋白基因2E8R3的克隆用下述方法克隆通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)3(序列表中SEQ ID NO5)連接得到的實(shí)施例2獲得的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白(命名為2E8R3)基因2E8R3，具體過(guò)程包括以下步驟1、設(shè)計(jì)引物根據(jù)實(shí)施例2克隆的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因和柔性肽(Gly4Ser)3編碼序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下2E8HBACKNEW(上游引物)5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO14，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))；2E8HFORNEW(下游引物)5’-gccacccgacccaccaccgcccgagccaccgccacctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQ ID NO15)；2E8LBACKNEW(上游引物)5’-ggctcgggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO16)；2E8LFORNEW(下游引物)5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO17，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I識(shí)別位點(diǎn))。
2、PCR擴(kuò)增以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Hchain為模板，在引物2E8HBACKNEW和2E8HFORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的重鏈可變區(qū)基因，同時(shí)，以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Lchain為模板，在引物2E8LBACKNEW和2E8LFORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的輕鏈可變區(qū)基因，反應(yīng)條件均為先95℃預(yù)變性2min；然后94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共28個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果分別獲得了大小約為387bp和372bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥者@兩條DNA片段，并用購(gòu)自Promega的DNA純化試劑盒純化回收片段，然后將兩個(gè)片段的回收產(chǎn)物各取2μL，并以各自互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為先95℃預(yù)變性2min；然后94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min，共7個(gè)循環(huán)；再向反應(yīng)管中加入2μL引物2E8HBACKNEW和2E8LFORNEW，再在相同條件(94℃變性1min，57℃退火1min，72℃延伸1min)下進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示(泳道a為Marker，泳道b為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了大小約為732bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥赵揇NA片段，并用購(gòu)自Promega的DNA純化試劑盒純化回收片段，將其連接入pGEM-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，得到含有融合蛋白基因2E8R3的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-T-2E8R3。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明經(jīng)上述方法擴(kuò)增得到了序列正確的融合蛋白2E8R3的編碼基因，該融合基因具有序列表中SEQ ID NO11的核苷酸序列，由732個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-732位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO8的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第397-732位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-396位堿基為連接肽(Gly4Ser)3的編碼序列。
二、融合蛋白基因2E8R3的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一獲得的融合蛋白基因2E8R3用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Nhe I進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET-his(晶美生物工程有限公司)進(jìn)行連接，得到融合蛋白基因2E8R3的大腸桿菌表達(dá)載體，命名為pET-his-2E8ScFv3。
實(shí)施例4、融合蛋白基因2E8R2的克隆及含有該融合基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建一、融合蛋白基因2E8R2的克隆用下述方法克隆通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)2(序列表中SEQ ID NO6)連接得到的實(shí)施例2獲得的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白(命名為2E8R2)基因2E8R2，具體過(guò)程包括以下步驟1、設(shè)計(jì)引物根據(jù)實(shí)施例2克隆的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因和柔性肽(Gly4Ser)2編碼序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下2E8H2BACKNEW(上游引物)5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO18，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))；2E8H2FORNEW(下游引物)5’-gccacccgacccaccaccgcctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQ ID NO19)；2E8L2BACKNEW(上游引物)5-ggcggtggtgggtcgggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO20)；2E8L2FORNEW(下游引物)5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO21，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I識(shí)別位點(diǎn))。
2、PCR擴(kuò)增以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Hchain為模板，在引物2E8H2BACKENW和2E8H2FORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的重鏈可變區(qū)基因，同時(shí)，以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Lchain為模板，在引物2E8L2BACKNEW和2E8L2FORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的輕鏈可變區(qū)基因，反應(yīng)條件與實(shí)施例3相應(yīng)步驟的相同。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果分別獲得了大小約為372bp和366bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。回收這兩條DNA片段，并用購(gòu)自Promega的DNA純化試劑盒純化回收片段，然后將兩個(gè)片段的回收產(chǎn)物各取2μL，并以各自互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與實(shí)施例3相應(yīng)步驟的相同；再向反應(yīng)管中加入2μL引物2E8H2BACKNEW和2E8L2FORNEW，再在相同的循環(huán)條件下進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了大小約為732bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符。回收該DNA片段，并用購(gòu)自Promega公司DNA純化試劑盒純化回收片段，將其連接入pGEM-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，得到含有融合蛋白基因2E8R2的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-T-2E8R2。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明經(jīng)上述方法擴(kuò)增得到了序列正確的融合蛋白2E8R2的編碼基因，該融合基因具有序列表中SEQ ID NO12的核苷酸序列，由717個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-717位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO9的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第382-717位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-381位堿基為連接肽(Gly4Ser)2的編碼序列。
二、融合蛋白基因2E8R2的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一獲得的融合蛋白基因2E8R2用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Nhe I進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET-his進(jìn)行連接，得到融合蛋白基因2E8R2的大腸桿菌表達(dá)載體，命名為pET-his-2E8ScFv2。
實(shí)施例5、融合蛋白基因2E8R1的克隆及含有該融合基因的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建一、融合蛋白基因2E8R1的克隆用下述方法克隆通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)(序列表中SEQ ID NO7)連接得到的實(shí)施例2獲得的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白(命名為2E8R1)基因2E8R1，具體過(guò)程包括以下步驟1、設(shè)計(jì)引物根據(jù)實(shí)施例2克隆的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)編碼基因和柔性肽(Gly4Ser)編碼序列設(shè)計(jì)引物，引物序列如下2E8H1BACKNEW(上游引物)5’-ggatcccaggtgcagttgaaggagtcagga-3’(SEQ ID NO22，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I識(shí)別位點(diǎn))；2E8H1FORNEW(下游引物)5’-gtcagatccgccgccacctgcagagacagtgaccagagtccc-3’(SEQID NO23；
2E8L1BACKNEW(上游引物)5’-tctgcaggtggcggcggatctgacattgtgatgacacagtctcca-3’(SEQ ID NO24)；2E8L1FORNEW(下游引物)5’-gctagctatttccaactttgtccccgagcc-3’(SEQ ID NO25，帶下劃線堿基為限制性?xún)?nèi)切酶Nhe I識(shí)別位點(diǎn))。
2、PCR擴(kuò)增以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Hchain為模板，在引物2E8H1BACKNEW和2E8H1FORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的重鏈可變區(qū)基因，同時(shí)，以實(shí)施例2構(gòu)建的含有2E8單克隆抗體輕鏈可變區(qū)擴(kuò)增片段的重組質(zhì)粒pMD-18T-2E8Lchain為模板，在引物2E8L1BACKNEW和2E8L1FORNEW的引導(dǎo)下PCR擴(kuò)增2E8的輕鏈可變區(qū)基因，反應(yīng)條件與實(shí)施例3相應(yīng)步驟的相同。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果分別獲得了大小約為369bp和357bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。回收這兩條DNA片段，并用購(gòu)自Promega生物公司的DNA純化試劑盒純化回收片段，然后將兩個(gè)片段的回收產(chǎn)物各取2μL，并以各自互為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件與實(shí)施例3相應(yīng)步驟的相同；再向反應(yīng)管中加入2μL引物2E8H1BACKNEW和2E8L1FORNEW，再在相同的循環(huán)條件下進(jìn)行28個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得了大小約為732bp的DNA片段，與預(yù)期結(jié)果相符?；厥赵揇NA片段，并用購(gòu)自Promega生物公司的DNA純化試劑盒純化回收片段，將其連接入pGEM-T載體中，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用藍(lán)白斑法篩選陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒，得到含有融合蛋白基因2E8R1的重組質(zhì)粒，命名為pGEM-T-2E8R1。對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明經(jīng)上述方法擴(kuò)增得到了序列正確的融合蛋白2E8R1的編碼基因，該融合基因具有序列表中SEQ ID NO13的核苷酸序列，由702個(gè)堿基組成，其編碼序列為自5’端第1-702位堿基，編碼具有序列表中SEQ ID NO10的氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，自5’端第1-351位堿基為抗體2E8重鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第367-702位堿基為抗體2E8輕鏈可變區(qū)的編碼序列，自5’端第352-366位堿基為連接肽(Gly4Ser)的編碼序列。
二、融合蛋白基因2E8R1的大腸桿菌表達(dá)載體的構(gòu)建將步驟一獲得的融合蛋白基因2E8R1用限制性?xún)?nèi)切酶BamH I和Nhe I進(jìn)行雙酶切后，與經(jīng)相同酶雙酶切的載體pET-his進(jìn)行連接，得到融合蛋白基因2E8R1的大腸桿菌表達(dá)載體，命名為pET-his-2E8ScFv1。
實(shí)施例6、融合蛋白的表達(dá)及其活性鑒定一、融合蛋白的表達(dá)將實(shí)施例3構(gòu)建的表達(dá)載體pET-his-2E8ScFv3轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，以pET-his為對(duì)照，篩選陽(yáng)性單克隆，再將陽(yáng)性單菌落接種于5mL 2YT培養(yǎng)基(peptone20g+yeast extract10g+NaCl 10g+100μg/mL ampicillin+1％ glucose)中，在37℃下培養(yǎng)過(guò)夜(12-24小時(shí))，然后，取2mL菌液，再接種到200mL新鮮2YT培養(yǎng)基中，在37℃、250rpm下培養(yǎng)至OD600＝0.6時(shí)，加入IPTG(1mol/L)200μL，在30℃、250rpm下誘導(dǎo)培養(yǎng)16小時(shí)(分別于誘導(dǎo)至第8、16、20小時(shí)時(shí)取樣)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體，加入5mL緩沖液(50mmol/L pH7.4 PBS)，超聲破碎(0.5后，離心收集上清，過(guò)0.45μm濾膜(購(gòu)自上海市新化凈化器件廠)，分批加入到用5mL緩沖液預(yù)處理的鎳瓊脂糖凝膠純化柱(北京卓冠生物技術(shù)公司)，在4℃下參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。將純化后的蛋白用PBS液進(jìn)行透析，過(guò)0.22μm濾膜(購(gòu)自上海市新化凈化器件廠)，分裝，凍存。
然后用與上述相同的方法將實(shí)施例4、5構(gòu)建的表達(dá)載體pET-his-2E8ScFv2和pET-his-2E8ScFv1分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1感受態(tài)細(xì)胞，再用相同方法誘導(dǎo)表達(dá)及純化，并對(duì)經(jīng)純化的表達(dá)蛋白分裝，凍存。
二、表達(dá)蛋白的SDS-PAGE及Western Blot鑒定1、SDS-PAGE將步驟一表達(dá)及純化的蛋白進(jìn)行12％ SDS-PAGE電泳檢測(cè)，其中轉(zhuǎn)化pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示(泳道a為轉(zhuǎn)化有pET-his空載體的重組菌的表達(dá)產(chǎn)物，泳道b為轉(zhuǎn)化有pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物，泳道c為Marker，泳道d為經(jīng)純化的蛋白)，經(jīng)表達(dá)獲得了分子量約為32KD的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符，且經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)16小時(shí)蛋白表達(dá)量最高。轉(zhuǎn)化pET-his-2E8ScFv2的工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了32KD的蛋白，轉(zhuǎn)化pET-his-2E8ScFv1的工程菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)獲得了32KD的蛋白，均與預(yù)期結(jié)果相符。
2、Western Blot鑒定將步驟一表達(dá)及純化的蛋白進(jìn)行12％ SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western Blot鑒定，所用一抗為抗His單抗(購(gòu)自普利萊生物公司)，二抗為羊抗鼠抗體(購(gòu)自華美生物公司)。其中轉(zhuǎn)化pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物的Western Blot檢測(cè)結(jié)果如圖4所示(泳道a為轉(zhuǎn)化有pET-his空載體的重組菌的表達(dá)產(chǎn)物，泳道b為轉(zhuǎn)化有pET-his-2E8ScFv3的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物)，表明表達(dá)蛋白可與抗His單抗特異結(jié)合，證明融合蛋白基因2E8R3獲得正確表達(dá)，得到了通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)3連接的2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白2E8R3。
轉(zhuǎn)化pET-his-2E8ScFv2和pET-his-2E8ScFv1的工程菌的表達(dá)產(chǎn)物也可與抗His單抗特異結(jié)合，證明融合蛋白基因2E8R2和2E8R1也均獲得正確表達(dá)，得到了分別通過(guò)柔性肽(Gly4Ser)2和(Gly4Ser)連接的2E8單克隆抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的融合蛋白2E8R2和2E8R1。
三、融合蛋白的熒光檢測(cè)取4個(gè)EP管，標(biāo)記上檢測(cè)管(3個(gè))與陽(yáng)性對(duì)照管，分別加入4％的紅細(xì)胞300μL，然后向3個(gè)檢測(cè)管中分別加入步驟一表達(dá)及純化的具有不同連接肽的三種融合蛋白各100μL(0.85mg/mL)，陽(yáng)性對(duì)照管中加入2E8單克隆抗體(3.84mg/mL)，將4個(gè)管在37℃下孵育1小時(shí)，用0.9％的生理鹽水洗滌3次，再用300μL生理鹽水重懸沉淀，向檢測(cè)管中加入一抗(抗His單抗，購(gòu)自普利萊生物公司)，混勻后37℃孵育1小時(shí)，用0.9％的生理鹽水洗滌3次，再用300μL生理鹽水重懸沉淀，向兩管中加入二抗(FITC標(biāo)記羊抗鼠抗體，購(gòu)自華美生物公司)，混勻后37℃孵育1小時(shí)，用0.9％的生理鹽水洗滌3次，最后在熒光電鏡下觀察。與陽(yáng)性對(duì)照組相同，檢測(cè)組也可見(jiàn)綠色熒光，其中，融合蛋白2E8R3的檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明本發(fā)明的三種具有不同連接肽的融合蛋白均可與紅細(xì)胞表明的H抗原表位特異結(jié)合，具有與2E8單克隆抗體相同的生物活性。
四、融合蛋白的競(jìng)爭(zhēng)抑制試驗(yàn)取4個(gè)10mL的試管，分別標(biāo)記上檢測(cè)管(3個(gè))和對(duì)照管，分別加入5％的紅細(xì)胞100μL，然后向3個(gè)檢測(cè)管中分別加入步驟一表達(dá)及純化的具有不同連接肽的三種融合蛋白(0.85mg/mL)，37℃孵育1小時(shí)，再向4個(gè)管中分別加入2E8單克隆抗體(3.84mg/mL)，37℃孵育1小時(shí)；取出試管，分別加入低離子液(LIM，東耀生物科技有限公司)700μL，混勻；再向4個(gè)管中分別加入2滴聚凝胺(購(gòu)自東耀生物科技有限公司)，混勻，3400rpm離心30s，再向每管中加入500μL解離液(Resuspending，東耀生物科技有限公司)，振蕩15s，各取10μL鋪于玻片上，光學(xué)顯微鏡下觀察。結(jié)果加入了本發(fā)明表達(dá)及純化的三種融合蛋白的檢測(cè)組的紅細(xì)胞在聚凝胺的作用下，不再出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，其中，融合蛋白2E8R3的檢測(cè)結(jié)果如圖6所示(右圖為對(duì)照)，而對(duì)照組的紅細(xì)胞出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，表明本發(fā)明的三種具有不同連接肽的融合蛋白均可與紅細(xì)胞表明的H抗原表位特異結(jié)合，具有與2E8單克隆抗體相同的生物活性。
序列表<160>25<210>1<211>117<212>PRT<213>小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>1Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ala115<210>2<211>112<212>PRT<213>小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>2Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly1 5 10 15Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser20 25 30
Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln35 40 45Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val50 55 60Ser Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr65 70 75 80Ile Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln85 90 95Leu Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile100 105 110<210>3<211>351<212>DNA<213>小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>3caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc 60acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa180tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta240aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga300tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc a 351<210>4<211>336<212>DNA<213>小鼠屬小鼠(Mus musculus)<400>4gacattgtga tgacacagtc tccatcctct ctggctatgt cagtaggaca gaaggtcact 60atgagctgca agtccagtca gagcctttta aatagtgaca atcaaaagaa ctatttggcc120tggtaccagc agaaaccagg acagtctcct aaacttctgg tgtactttgc atccagtagg180gaatcggggg tgtctgatcg gttcataggc agtggctctg ggacagattt cactcttacc240atcggcagtg tgcagtctga agacctggca tattacttct gtcagcaact ttatagaact300ccattcacgt tcggctcggg gacaaagttg gaaata 336
<210>5<211>15<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>5Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10 15<210>6<211>10<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>6Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser1 5 10<210>7<211>5<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>7Gly Gly Gly Gly Ser1 5<210>8
<211>244<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>8Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly115 120 125Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala130 135 140Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser145 150 155 160Leu Leu Asn Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln165 170 175Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg180 185 190Glu Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp195 200 205Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr210 215 220Phe Cys Gln Gln Leu Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr
225 230 235 240Lys Leu Glu Ile<210>9<211>239<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>9Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp115 120 125Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln130 135 140Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp145 150 155 160Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser165 170 175Pro Lys Leu Leu Val Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Ser180 185 190Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205Gly Ser Val Gln Ser Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu210 215 220Tyr Arg Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile225 230 235<210>10<211>234<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>10Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln1 5 10 15Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Gly Tyr20 25 30Ser Val His Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu35 40 45Gly Met Ile Trp Gly Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Lys Ser Ala Leu Lys50 55 60Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Asn Ser Arg Ser Gln Val Leu Leu65 70 75 80Lys Met Asn Ser Leu Gln Ile Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala85 90 95Arg Asn Tyr Gly Tyr Ser Pro Phe Val His Trp Gly Gln Gly Thr Leu100 105 110Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Val Met Thr Gln115 120 125Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly Gln Lys Val Thr Met Ser130 135 140Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Asp Asn Gln Lys Asn Tyr145 150 155 160Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Val165 170 175
Tyr Phe Ala Ser Ser Arg Glu Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe Ile Gly180 185 190Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Val Gln Ser195 200 205Glu Asp Leu Ala Tyr Tyr Phe Cys Gln Gln Leu Tyr Arg Thr Pro Phe210 215 220Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile225 230<210>11<211>732<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>11caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc 60acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa180tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta240aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga300tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtggcggt360ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgatgac acagtctcca420tcctctctgg ctatgtcagt aggacagaag gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagc480cttttaaata gtgacaatca aaagaactat ttggcctggt accagcagaa accaggacag540tctcctaaac ttctggtgta ctttgcatcc agtagggaat cgggggtgtc tgatcggttc600ataggcagtg gctctgggac agatttcact cttaccatcg gcagtgtgca gtctgaagac660ctggcatatt acttctgtca gcaactttat agaactccat tcacgttcgg ctcggggaca720aagttggaaa ta732<210>12<211>717<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>12caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc 60acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa180tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta240aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga300tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggcggtggt360gggtcgggtg gcggcggatc tgacattgtg atgacacagt ctccatcctc tctggctatg420tcagtaggac agaaggtcac tatgagctgc aagtccagtc agagcctttt aaatagtgac480aatcaaaaga actatttggc ctggtaccag cagaaaccag gacagtctcc taaacttctg540gtgtactttg catccagtag ggaatcgggg gtgtctgatc ggttcatagg cagtggctct600gggacagatt tcactcttac catcggcagt gtgcagtctg aagacctggc atattacttc660tgtcagcaac tttatagaac tccattcacg ttcggctcgg ggacaaagtt ggaaata 717<210>13<211>702<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>13caggtgcagt tgaaggagtc aggacctggc ctggtggctc cctcacagag cctgtccatc 60acatgcactg tctctggatt ctcattatca ggatatagtg tacactgggt tcgccagcct120ccaggaaagg gtctggagtg gctgggaatg atatggggtg gtggaaacac agactataaa180tcagctctca aatccagact gaccattagt aaggacaact ccaggagcca agttctctta240aaaatgaaca gtctgcaaat tgatgacaca gccatttact actgtgccag aaattacgga300tatagtccgt ttgttcactg gggccaaggg actctggtca ctgtctctgc aggtggcggc360ggatctgaca ttgtgatgac acagtctcca tcctctctgg ctatgtcagt aggacagaag420gtcactatga gctgcaagtc cagtcagagc cttttaaata gtgacaatca aaagaactat480ttggcctggt accagcagaa accaggacag tctcctaaac ttctggtgta ctttgcatcc540agtagggaat cgggggtgtc tgatcggttc ataggcagtg gctctgggac agatttcact600cttaccatcg gcagtgtgca gtctgaagac ctggcatatt acttctgtca gcaactttat660agaactccat tcacgttcgg ctcggggaca aagttggaaa ta 702<210>14
<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>14ggatcccagg tgcagttgaa ggagtcagga 30<210>15<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>15gccacccgac ccaccaccgc ccgagccacc gccacctgca gagacagtga ccagagtccc 60<210>16<211>60<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>16ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctgaca ttgtgatgac acagtctcca 60<210>17<211>32<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>
<400>17gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc 30<210>18<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>18ggatcccagg tgcagttgaa ggagtcagga 30<210>19<211>45<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>19gccacccgac ccaccaccgc ctgcagagac agtgaccaga gtccc 45<210>20<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>20
ggcggtggtg ggtcgggtgg cggcggatct gacattgtga tgacacagtc tcca 54<210>21<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>21gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc 30<210>22<211>37<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>22ggatccgccc aggtgcagtt gaaggagtca gga 33<210>23<211>42<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>23gtcagatccg ccgccacctg cagagacagt gaccagagtc cc42<210>24<211>45
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>24tctgcaggtg gcggcggatc tgacattgtg atgacacagt ctcca 45<210>25<211>32<212>DNA<213>工序列<220>
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<400>25gctagcta tttccaactt tgtccccgag cc 3權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942。
2.權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體；所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO1的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO1的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的多肽；輕鏈可變區(qū)具有序列表中的SEQ ID NO2的氨基酸殘基序列或?qū)⑿蛄斜碇蠸EQ ID NO2的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的多肽。
3.編碼權(quán)利要求2所述的雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因；所述單克隆抗體的重鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO3的DNA序列或編碼序列表中SEQ ID NO1的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO3限定的DNA序列雜交的核苷酸序列；輕鏈可變區(qū)編碼基因具有序列表中SEQ ID NO4的DNA序列或編碼序列表中SEQID NO2的DNA序列或在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中SEQ ID NO4限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
4.含有權(quán)利要求3所述的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體重鏈和/或輕鏈可變區(qū)編碼基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌。
5.一種將權(quán)利要求2所述的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)連接得到的融合蛋白；所述融合蛋白中的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8的重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)通過(guò)具有序列表中SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的氨基酸殘基序列的柔性肽連接。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的融合蛋白，其特征在于所述融合蛋白是下述氨基酸殘基序列之一1)序列表中的SEQ ID NO8；2)序列表中的SEQ ID NO9；3)序列表中的SEQ ID NO10；4)將序列表中SEQID NO8-10的氨基酸殘基序列經(jīng)過(guò)一至十個(gè)氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有抗人紅細(xì)胞表面H抗原中和活性的蛋白質(zhì)。
7.編碼權(quán)利要求6所述融合蛋白的基因，是下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID NO11的DNA序列；2)序列表中SEQ ID NO12的DNA序列；3)序列表中SEQ ID NO13的DNA序列；4)編碼序列表中SEQ ID NO8-10的DNA序列；5)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下可與序列表中的SEQ ID NO11-13限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
8.含有權(quán)利要求7所述融合基因的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系及宿主菌。
9.一種構(gòu)建權(quán)利要求7所述融合基因的方法，包括以下步驟1)以含有權(quán)利要求3所述的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的重鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為模板，在由序列表中SEQ ID NO14和SEQ ID NO15組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的重鏈可變區(qū)編碼基因；2)以含有權(quán)利要求3所述的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)編碼基因的質(zhì)粒為模板，在由序列表中SEQ ID NO16和SEQ ID NO17組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，PCR擴(kuò)增抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)編碼基因；3)以步驟1)擴(kuò)增的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的重鏈可變區(qū)編碼基因和步驟2)擴(kuò)增的抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體的輕鏈可變區(qū)編碼基因?yàn)槟０?，在由序列表中SEQ ID NO14和SEQ ID NO17組成的引物對(duì)的引導(dǎo)下，進(jìn)行重疊PCR擴(kuò)增，得到融合基因。
10.一種表達(dá)權(quán)利要求5或6所述的融合蛋白的方法，是將含有權(quán)利要求7所述融合基因的重組表達(dá)載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞，表達(dá)得到融合蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了雜交瘤細(xì)胞株2E8Z CGMCC No.1942及其產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生的抗人紅細(xì)胞表面H抗原的單克隆抗體2E8具有效價(jià)高、特異性強(qiáng)、抗原分布廣泛的優(yōu)點(diǎn)。柔性肽易于彎曲，因而可使本發(fā)明的融合蛋白正確折疊，且不影響融合蛋白各自的活性結(jié)合區(qū)域。實(shí)驗(yàn)證明，該融合蛋白能特異結(jié)合人紅細(xì)胞表面的H抗原；此外，該融合蛋白還具有表達(dá)量高，易純化，生產(chǎn)周期短，生產(chǎn)規(guī)模大，制備成本低的優(yōu)點(diǎn)。基于上述優(yōu)點(diǎn)，本發(fā)明為下一步用基因工程法制備雙功能性分子，以及建立基于紅細(xì)胞的治療與檢測(cè)平臺(tái)打下了良好的基礎(chǔ)，將在醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域，具有較大的實(shí)際意義和廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C07K16/28GK101037671SQ20071006392
公開(kāi)日2007年9月19日 申請(qǐng)日期2007年2月14日 優(yōu)先權(quán)日2007年2月14日
發(fā)明者章金剛, 邵長(zhǎng)利, 呂茂民 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所