專利名稱：生物分子微陣列的制備方法及定點(diǎn)裝置的制作方法
專利說明生物分子微陣列的制備方法及定點(diǎn)裝置 本發(fā)明涉及定點(diǎn)型生物分子微陣列的制造方法。
特別地，本發(fā)明屬于檢測靶生物分子的生物分子檢測技術(shù)，它是以具有要檢測的靶生物分子互補(bǔ)堿基序列的單鏈生物分子或者以與要檢測的靶生物分子有相互作用的單鏈生物分子為探針，通過檢測該探針生物分子與生物體來源的核酸樣品是否通過雜交或相互作用而形成雙鏈而進(jìn)行測定的技術(shù)。用于檢測生物體來源的樣品中所有存在的生物分子(DNA、RNA等)的設(shè)備有DNA微陣列(亦叫做DNA芯片)。應(yīng)用DNA微陣列可一并對(duì)數(shù)百～數(shù)萬個(gè)生物分子進(jìn)行檢測處理或進(jìn)行堿基序列測定處理。DNA微陣列是將數(shù)百～數(shù)萬的DNA檢測點(diǎn)(定點(diǎn)部分)井然有序地分配到數(shù)平方厘米～數(shù)十平方厘米的玻璃基板或硅基板上。持有預(yù)先已知堿基序列的單鏈核酸聚合物(基因片段)作為探針(檢測子)按每一種固定到每個(gè)DNA檢測點(diǎn)上。結(jié)果DNA微陣列上整齊排列著許多種類的核酸探針。讓用熒光物質(zhì)標(biāo)記的核酸樣品水溶液在DNA微陣列上流動(dòng)，該樣品核酸中的核酸堿基序列只有在與探針互補(bǔ)時(shí)二者才能進(jìn)行雜交，洗滌后，只有與探針雜交的靶核酸殘存在DNA微陣列上?？赏ㄟ^檢測DNA微陣列上殘存的靶核酸上標(biāo)記的熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光來判斷該樣品中是否存在靶核酸。
根據(jù)制備方法的不同DNA微陣列可大致分為光分解色譜(フオトリ ソグラフイ)型和定點(diǎn)型2種。
光分解色譜型中采用的制備方法是通過在半導(dǎo)體集成電路的制備過程中應(yīng)用的光分解色譜在基板(或薄片)上合成所希望的多種DNA(寡核苷酸)，它使具有高密度DNA檢測點(diǎn)的DNA微陣列實(shí)用化(參照美國特許5744305、5445934等)。
而定點(diǎn)型中應(yīng)用的制備方法是應(yīng)用整面覆蓋了固相化劑(聚賴氨酸或氨基硅烷)的載物玻片基板(或片)，將預(yù)先制備的含探針DNA的液滴一滴一滴點(diǎn)到基板上后，使之干燥，由此形成DNA檢測點(diǎn)(參照美國特許587522、特表平10-503841號(hào)等)。上述2種DNA微陣列有以下不同的特性。
光分解色譜型DNA微陣列的優(yōu)點(diǎn)在于由于它能使DNA檢測點(diǎn)很細(xì)小、均一生成DNA，所以能保證高的測定靈敏度和再現(xiàn)性，能用于SNP(單核苷酸多態(tài)性)分析。但是，合成1個(gè)堿基需要1個(gè)掩蔽罩(マスク)，因?yàn)橛蠥、T、G、C四種堿基，所以至少需要4個(gè)掩蔽罩(マスク)。例如合成20個(gè)堿基長的探針時(shí)80個(gè)掩蔽罩(マスク)是必要的。1個(gè)掩蔽罩(マスク)的價(jià)格高達(dá)十萬元，制作DNA微陣列就需要數(shù)千萬元的花費(fèi)。因此，只在一部分研究機(jī)構(gòu)使用是其現(xiàn)狀。
定點(diǎn)型DNA微陣列應(yīng)用于將含有探針DNA的液滴加到基板上使之干燥的方法。因此有制備廉價(jià)這一優(yōu)點(diǎn)，但是有不能保證固定到基板上的DNA的密度和均一性這樣的缺點(diǎn)。也就是說，由于DNA檢測點(diǎn)的尺寸和形狀不均一，所以固定在各DNA檢測點(diǎn)上的DNA量亦多少不一。因此，定點(diǎn)型DNA微陣列可用于定性分析不宜于定量分析。也就是說，可檢測有無與靶生物分子雜交產(chǎn)生的DNA檢測點(diǎn)，而不能測定在各DNA檢測點(diǎn)雜交的靶生物分子的量。另外，為了實(shí)現(xiàn)某種程度的定量性有必要將參照樣品作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)進(jìn)行雜交。
再者定點(diǎn)型DNA微陣列還有這樣的問題由于附著在DNA檢測點(diǎn)周圍的固相化試劑的存在，靶DNA非特異性吸附到基板上，引起噪音增強(qiáng)，降低了S/N比。
于是本發(fā)明者們以提供可用于定量分析且S/N比高的定點(diǎn)型生物分子微陣列為目的，首先開發(fā)了具有能定量接納、固化核酸等探針生物分子的探針生物分子接納固相部的生物分子微陣列用基板。將含有探針生物分子的溶液點(diǎn)到該基板的探針生物分子接納固相部可得到所定量的探針生物分子固化到檢測點(diǎn)上的生物分子微陣列。
然而，為了將所定量的探針生物分子固定到檢測點(diǎn)有必要將含有所定量探針生物分子的溶液點(diǎn)到區(qū)域微小且眾多的探針生物分子接納固相部的各個(gè)區(qū)域。但是到目前為止還沒有相對(duì)于有確定位置的探針生物分子接納固相部，而將含有探針生物分子的溶液精細(xì)定點(diǎn)制備生物分子微陣列的方法。
因此本發(fā)明的目的是提供生物分子微陣列的制備方法和裝置，相對(duì)于具有確定位置的探針生物分子接納固相部，它高精度地定點(diǎn)含有探針生物分子的溶液，將所定量(數(shù)量)的探針生物分子固定到各探針生物分子接納固相部。
本發(fā)明如下(權(quán)利要求1)生物分子微陣列的制備方法，它包括準(zhǔn)備表面有多個(gè)探針生物分子接納固相部的基板的工序(其中上述各探針生物分子接納固相部特異且定量地接受探針生物分子)，以及將包含探針生物分子的溶液定點(diǎn)到上述探針生物分子接納固相部，將該溶液中所包含的探針生物分子固化到上述探針生物分子接納固相部的工序(其中上述溶液的定點(diǎn)是上述溶液的1個(gè)液滴至少要全面覆蓋上述1個(gè)探針生物分子接納固相部，且上述1個(gè)液滴中包含的探針生物分子的數(shù)在1個(gè)探針生物分子接納固相部所能接納的數(shù)目以上)；其中基板表面上有確定基板位置的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，上述探針生物分子接納固相部根據(jù)與上述調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的位置關(guān)系而確定位置，且上述溶液的定點(diǎn)相對(duì)于由與上述調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系而確定位置的上述探針生物分子接納固相部進(jìn)行。
(權(quán)利要求2)權(quán)利要求1的制備方法，用CCD相機(jī)讀取上述調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，根據(jù)相機(jī)的讀取識(shí)別定點(diǎn)手段中基板表面的探針生物分子接納固相部的位置，通過識(shí)別位置的定點(diǎn)手段來定點(diǎn)包含探針生物分子的溶液。
(權(quán)利要求3)權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征在于，上述探針生物分子為DNA、RNA、PNA或蛋白質(zhì)。
(權(quán)利要求4)包含探針生物分子的溶液的定點(diǎn)裝置，它具有讀取生物分子微陣列用基板上的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的CCD相機(jī)，根據(jù)用該CCD相機(jī)讀取的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的位置識(shí)別探針生物分子接納固相部的位置的裝置，以及定點(diǎn)裝置，該裝置具有通過定點(diǎn)手段將包含探針生物分子的溶液定點(diǎn)到由上述裝置進(jìn)行位置識(shí)別所識(shí)別的探針生物分子接納固相部上的位置控制裝置。
(權(quán)利要求5)權(quán)利要求4的定點(diǎn)裝置，它還有用于使生物分子微陣列用基板整齊排列的臺(tái)面和保持用于定點(diǎn)包含探針生物分子的溶液的針(チツプ)的持針器，持針器借助持針器位置校正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)而接續(xù)于X軸、Y軸和Z軸的各移動(dòng)裝置上。
(權(quán)利要求6)權(quán)利要求4或5的定點(diǎn)裝置，在持針器位置校正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)附近它還有基板讀取相機(jī)和印記(スタンプ)觀察裝置。
本發(fā)明的生物分子微陣列的制備方法由準(zhǔn)備基板的工序和定點(diǎn)溶液的工序構(gòu)成。該工序中準(zhǔn)備生物分子微陣列用基板，基板表面設(shè)置多個(gè)探針生物分子接納固相部。其中各探針生物分子接納固相部是能特異且定量接納探針生物分子的部分。
上述生物分子微陣列用基板可以，例如在基板表面的大約整個(gè)表面規(guī)則設(shè)置多個(gè)微細(xì)的能分別定量接受探針生物分子的探針生物分子接納固相部。該生物分子微陣列用基板中，雖然探針生物分子接納固相部是能定量接受探針生物分子的部位，但為了能定量接納探針生物分子，要將針對(duì)探針生物分子的固相化試劑定量吸附到探針生物分子接納固相部。根據(jù)附著到探針生物分子接納固相部的固相化試劑的量可以適當(dāng)決定所固定的探針生物分子的量(數(shù)量)。也就是說，假若吸附到探針生物分子接納固相部的固相化試劑的量在各個(gè)探針生物分子接納固相部相同，那么供給足量的探針生物分子給各個(gè)探針生物分子接納固相部，使之固定，那么固定到各個(gè)探針生物分子接納固相部的探針生物分子的量(數(shù)量)相同。
上述固相化試劑包括具有有固相化能力官能團(tuán)的物質(zhì)，例如有親和素、鏈霉親和素、生物素、氨基、羰基、羥基、琥珀?；?スクシニイド基)、馬來?；?マレイド基)、巰基等基團(tuán)的物質(zhì)。后面描述將固相化試劑吸附到基板上的方法。特別地，探針生物分子接納固相部為親和素分子單層結(jié)合到結(jié)合于基板表面的生物素分子末端的固相部。
各探針生物分子接納固相部的直徑為，例如50-200μm，各探針生物分子接納固相部之間的間隔為，例如100-500μm。上述直徑是指探針生物分子接納固相部的形狀為圓形時(shí)的直徑，當(dāng)其形狀為正方形時(shí)指一邊的長度。另外，期望上述形狀與上述生物分子微陣列的生物分子檢測點(diǎn)部的攝像中使用的固體攝像元件的象素的形狀大致一致。
對(duì)于基板的材料沒有特殊限制，只要是能吸附固相化試劑的物質(zhì)即可。例如可以適當(dāng)使用玻璃基板、硅基板、塑料基板、金基板、銀基板等作為基板。
可應(yīng)用光分解色譜技術(shù)和蝕刻技術(shù)，通過在基板所定部位設(shè)置探針生物分子接納固相部制造上述生物分子微陣列用基板。


圖1說明了生物分子微陣列用基板的制備方法。圖1是一制備流程圖，表示生物分子微陣列用基板制備方法的一例。
圖中流程(9)中所示的100為生物分子微陣列用基板，該基板100進(jìn)行了只在特定部位101吸附探針DNA的表面處理。
基板100的制備流程如下(1)基板洗滌過程洗滌載物玻片基板11，除去雜物。
(2)鋁膜蒸鍍過程在載物玻片基板11的表面蒸鍍(涂布)一層鋁膜12。
(3)光致抗蝕劑(photoresist)的涂布過程在鋁膜12的表面涂布一層陰性光致抗蝕劑。
(4)露光過程只用光(hν)照射通過光罩14的(3)基板上的特定部位101。
(5)顯像過程(4)基板上的光致抗蝕劑13顯像。該階段除去特定部位101的光致抗蝕劑13。
(6)蝕刻工序蝕刻除去(5)基板上的光致抗蝕劑而露出的部位101的鋁膜。由此除去特定部位101的鋁膜12。
(7)除去抗蝕劑的過程用丙酮等溶劑溶解除去(6)基板上的光致抗蝕劑。該階段在載玻片基板11的表示只露出特定部位101，其余的表面被鋁膜覆蓋。
(8)DNA固相化膜形成過程將吸附探針DNA使之固相化的固相化試劑涂到(7)的基板上，形成DNA固相化膜15。具體而言，該過程包括用氨基硅烷處理基板將氨基導(dǎo)入基板表面的過程和用生物素琥珀酰胺處理基板將生物素導(dǎo)入基板表面的氨基的過程。
(9)DNA附著部位形成過程用酸、堿或螯合劑溶解去除(8)基板上的鋁膜12。該階段只在載玻片基板11表面的特定部位101形成DNA固相化膜15。
(10)親和素結(jié)合過程將親和素溶液導(dǎo)入(9)的基板上，使親和素分子單層結(jié)合到在特定部位101形成的DNA固相化膜15的生物素分子的末端。
通過以上(1)～(9)或(1)～(10)的流程，可得到只在載玻片基板11表示的特定部位101單層固定了生物素或親和素的DNA微陣列基板100。特定部位101的直徑在200μm以下，特定部位101之間的間隔小于500μm。
圖2顯示了親和素分子單層結(jié)合到DNA固相化膜15的生物素分子末端的過程。
因?yàn)楣庹值墓馔高^孔的面積和形狀均一，所以經(jīng)過上面(1)～(9)而制成的在各基板表示形成的特定部位101的面積和形狀可全部均一。因此，固定在各特定部位101的生物素分子23的數(shù)目也可大體一致。與固化到各特定部位101的生物素分子23結(jié)合的親和素分子的數(shù)目在各特定部位101之間也是均等的。
可通過改變露光過程中所使用的光罩而任意改變特定部位101的形狀和尺寸以及特定部位101之間的間隔。因此，固定到特定部位101的親和素分子的數(shù)目也可通過光罩而任意調(diào)控。
生物分子微陣列用基板的制備方法不限于上述實(shí)施方案。也就是說也可采用與圖1所示的制備方法不同的方法，如最初在基板11的表面整體形成DNA固相化膜15，而只在特定部位101露出DNA固相化膜15。這種情況下，在基板11的表面整體順次疊層DNA固相化膜15和鋁膜12后，在鋁膜12上疊層形成陽性光致抗蝕劑13，通過光罩，只在特定部位101露光，然后與上面同樣進(jìn)行顯像和蝕刻，可只在特定部位101露出DNA固相化膜15。當(dāng)然陽性光致抗蝕劑并非必要，也可使用陰性光致抗蝕劑。該過程是將包含探針生物分子的溶液點(diǎn)到探針生物分子接納固相部，將該溶液中所包含的探針生物分子固化到上述探針生物分子接納固相部。
如上所述探針生物分子接納固相部上附著與所定量的探針生物分子相對(duì)應(yīng)的固相化試劑，將足量的探針生物分子供給各探針生物分子接納固相部，使之固化，固定到各探針生物分子接納固相部的探針生物分子的量(數(shù)量)幾乎相同。但是若不供給各探針生物分子接納固相部足量的探針生物分子，固定的探針生物分子的量(數(shù)量)就不能大致相同，就不能進(jìn)行定量。
本發(fā)明的制備方法中溶液的滴點(diǎn)是溶液的1滴液滴至少要全面覆蓋1個(gè)探針生物分子接納固相部。這樣才不至于在探針生物分子接納固相部的一部分中存在沒有滴到探針生物分子的地方。此外，1滴液中包含的探針生物分子的數(shù)目在1個(gè)探針生物分子接納固相部所能接納的數(shù)目以上。液滴覆蓋探針生物分子接納固相部的全面，且該液滴中包含其可接納能力以上的探針生物分子的話，那么探針生物分子接納固相部整面且其接納能力上限量的探針生物分子被固定。若液滴中供給的探針生物分子不足可接納的數(shù)目，那么即便溶液的1滴液滴能覆蓋1個(gè)探針生物分子接納固相部的全面，也不能固定覆蓋探針生物分子接納固相部整面且其接納能力的上限量的探針生物分子。
為了使上述固定化適當(dāng)進(jìn)行，其前提是溶液的液滴正確定點(diǎn)到各探針生物分子接納固相部是必要的。但是如上所述探針生物分子接納固相部的大小，直徑為，例如50-200μm，間隔為，例如100-500μm。為了將各液滴供給到如此微細(xì)且間隔狹窄的各探針生物分子接納固相部，在本發(fā)明中首先使用表面上有調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的基板，該標(biāo)志能確定基板的位置。圖3中顯示了表面上有能確定基板位置的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的基板的例子。該基板是載玻片30的表面有固相部31的基板，并且除固相部31以外載玻片上有4條調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志32。由于調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志由CCD相機(jī)來讀取，考慮到目前CCD相機(jī)的分辨能力，調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志可以是圖4所示的尺寸。但是，CCD相機(jī)的分辨能力增強(qiáng)的話，可用與之相匹配的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志。
再者，本發(fā)明的制備方法中使用的基板，其各個(gè)探針生物分子接納固相部通過與調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系來進(jìn)行位置確定。也就是說，各個(gè)探針生物分子接納固相部設(shè)置成與基板表面的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志相對(duì)應(yīng)的規(guī)定位置。應(yīng)用光分解色譜技術(shù)和蝕刻技術(shù)，將探針生物分子接納固相部設(shè)置到基板的規(guī)定部位可得到上述本發(fā)明的制備方法中所使用的基板，這樣的精密加工也很容易進(jìn)行。
再者，包含探針生物分子的溶液的滴點(diǎn)是相對(duì)于探針生物分子接納固相部進(jìn)行的，該固相部的位置是根據(jù)與調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系而確定的。更具體而言，用CCD相機(jī)讀取基板上的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志。然后根據(jù)其讀取的定點(diǎn)手段識(shí)別基板表面的探針生物分子接納固相部的位置。識(shí)別探針生物分子接納固相部位置的定點(diǎn)手段有，例如通過Tip(針)將含有探針生物分子的溶液正確點(diǎn)到探針生物分子接納固相部。
將包含探針生物分子的溶液點(diǎn)到基板表面規(guī)定位置的方法和裝置有已知的。定點(diǎn)方法有，例如庫伊魯(クイル)法、針和環(huán)(ピンアンドリング)法、噴墨打印法。庫伊魯法是讓溶液浸入鋼筆狀的針頭來點(diǎn)的方法。針和環(huán)法是將溶液拉成環(huán)，讓針通過溶液形成的膜而進(jìn)行滴點(diǎn)的方法。噴墨打印法是用噴墨打印機(jī)進(jìn)行滴點(diǎn)的方法。本發(fā)明中可應(yīng)用任一種方法。
本發(fā)明制備方法可應(yīng)用有下面結(jié)構(gòu)的裝置實(shí)施(1)讀取基板上的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志時(shí)用的CCD相機(jī)；(2)根據(jù)CCD相機(jī)讀取的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的位置識(shí)別探針生物分子接納固相部位置的結(jié)構(gòu)；及(3)定點(diǎn)結(jié)構(gòu)，其具有用定點(diǎn)手段將包含探針生物分子的溶液點(diǎn)到(2)中位置識(shí)別的探針生物分子接納固相部的位置調(diào)控結(jié)構(gòu)。
圖5顯示了一例這樣的裝置。
圖5是DNA陣列系統(tǒng)50的立體圖，它由將包含探針生物分子的溶液定點(diǎn)到生物分子微陣列用基板的裝置51(圖中左前)和將包含探針生物分子的溶液由樣品平臺(tái)供給定點(diǎn)手段針的裝置52(圖中右后)構(gòu)成。
定點(diǎn)溶液的裝置51上有載玻片臺(tái)面53和保持點(diǎn)溶液的針的持針器55，53是為了整齊排列生物分子微陣列用基板載玻片54。持針器55借助持針器位置校正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)56可接續(xù)于X軸57、Y軸58和Z軸59的各移動(dòng)裝置。持針器位置校正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)56上設(shè)置了讀取載玻片的相機(jī)(CCD相機(jī))60和觀察定點(diǎn)過程中滴點(diǎn)狀態(tài)的印記觀察裝置(CCD相機(jī))61。此外，滴點(diǎn)溶液的裝置51和供給針樣品溶液的裝置52之間有持針器位置讀取傳感器63。
以下對(duì)上述裝置的運(yùn)作進(jìn)行說明。
首先，在將樣品溶液供給針的裝置52中，通過持針器交換結(jié)構(gòu)64將定點(diǎn)完成的針交換成從新的樣品臺(tái)面65供給含有探針生物分子的溶液的針。新的針固定在定點(diǎn)溶液的裝置51上，通過持針器位置讀取傳感器63讀取持針器上針的位置。接著通過載玻片讀取相機(jī)讀取定點(diǎn)的載玻片上的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，識(shí)別載玻片的位置及設(shè)置在載玻片上的探針生物分子接納固相部的位置。然后為了能正確定點(diǎn)探針生物分子接納固相部，操作X軸57、Y軸58和位置校正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)56的各移動(dòng)裝置進(jìn)行位置補(bǔ)正(X、Y、θ方向)。然后從進(jìn)行了位置補(bǔ)正的持針器上固定的針將探針生物分子點(diǎn)到各個(gè)探針生物分子接納固相部。
本發(fā)明的制備方法中探針生物分子可以是例如DNA、RNA、PNA或蛋白質(zhì)。另外，這些探針生物分子可以是，例如生物素標(biāo)記的生物分子，探針生物分子接納固相部附著的親和素或鏈霉親和素等。以下通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明。
(定量基板制備方法的各步驟)(a)載玻片的洗滌在預(yù)清潔的載玻片(マツナミ公司，S1111)上涂上丙酮，超聲波洗滌30分鐘。其后用去離子水洗滌3次。接著涂上過氧化氫水/濃硫酸(1∶1)，超聲波洗滌30分鐘。其后用去離子水洗滌3次。然后用超純水(ミリ Q水)超聲波洗滌30分鐘。其后用超純水洗滌3次，60℃烤箱中干燥20分鐘。
(b)鋁的真空蒸鍍用真空蒸鍍裝置(ULVAC公司)給洗凈的載玻片蒸鍍鋁膜(膜厚約300nm)。
(c)涂光致抗蝕劑在蒸鍍了鋁膜的載玻片涂上陽性光致抗蝕劑(シプレ一公司，S1813)，用旋轉(zhuǎn)的涂層(ミカサ公司)涂1μm厚。其后120℃烤20分鐘。
(d)露光將涂了抗蝕劑的載玻片通過制作DNA固相化部位圖形的光罩，只在DNA固相化部位的中間暴露紫外光。該露光操作中應(yīng)用能掃描露光YAG激光的3倍波長(波長355nm；激光源80nW)的露光裝置。求出最近的掃描時(shí)間，結(jié)果為120秒(30×80mm的面積)。
(e)顯影露光后浸到顯影液(シプレ一公司、CD-26)中35秒后，用超純水洗滌。結(jié)果僅在紫外照射的DNA固相化部位抗蝕劑溶解，露出鋁膜。
(f)蝕刻將制作了抗蝕劑圖形的載玻片浸到蝕刻溶液(磷酸/醋酸/硝酸/超純水(16∶2∶1∶1))中3分鐘，僅在DNA固化部位溶解鋁膜，用超純水洗滌。然后用丙酮1次，2次，3次洗滌，只有抗蝕劑被溶解。
(g)涂布氨基硅烷在1％氨基硅烷溶液(3-(2-氨基乙基氨基丙基)-三甲氧基硅烷于95％丙酮中)中浸10分鐘。其后用丙酮洗滌10分鐘，洗3次，以洗去未結(jié)合的氨基。然后在110℃烤箱中干燥40分鐘。其后室溫自然放置。
(h)生物素化反應(yīng)接著在5mg/ml生物素-Long arm-NHS溶液(于0.05M NaHCO3，pH8.6)中室溫浸入4小時(shí)。其后用超純水洗滌，真空干燥。
(i)溶解為了溶解殘余的鋁膜，在蝕刻溶液中邊超聲邊浸3-5分鐘，其后在超純水中邊超聲邊浸30分鐘。通過這步操作，在溶解鋁膜的基礎(chǔ)上還可物理性剝離其上面的生物素化的膜。這樣只在DNA固相化部位形成生物素化的膜。
(j)結(jié)合親和素反應(yīng)接下來將0.1mg/ml親和素溶液(Cy3標(biāo)記的鏈霉抗生物素，Vector；緩沖液1×SSPE，pH7.3)涂到形成生物素圖形的載玻片上，室溫靜置30分鐘。然后用1×SSPE(pH7.3)緩沖10分鐘洗滌2次。然后用超純水洗滌5次，真空干燥。這樣完成DNA固相化部位結(jié)合了親和素的定量基板。
表示點(diǎn)到表面處理基板上的探針生物分子接納固相部(特定部位)的溶液中的DNA量(濃度)與固化到特定部位的DNA量間關(guān)系的測定例。圖6的測定結(jié)果表明點(diǎn)3×109～5×109個(gè)探針DNA的話固定到特定部位的探針DNA量一定。
(定點(diǎn)方法)為了實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)速度的高速化，圖5所示的定點(diǎn)裝置由將樣品溶液點(diǎn)到載玻片上的裝置和洗滌點(diǎn)樣品溶液的針使之干燥，從樣品板中取樣的裝置構(gòu)成。通過使點(diǎn)樣動(dòng)作和取樣等動(dòng)作并列進(jìn)行，采樣等的時(shí)間不加算在點(diǎn)樣時(shí)間內(nèi)。因此設(shè)計(jì)了2臺(tái)持針器，通過持針器交換結(jié)構(gòu)在點(diǎn)樣裝置和采樣等裝置間進(jìn)行持針器的交換。
(進(jìn)行取樣等裝置)a)取樣等將處于持針器待機(jī)位置的針移動(dòng)給持針器交換結(jié)構(gòu)，進(jìn)行針的超聲洗滌、流水洗滌、干燥處理，從樣品板中取樣，再定置回到持針器待機(jī)位置。
(點(diǎn)樣裝置)a)載玻片位置識(shí)別讀取載玻片的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志識(shí)別載玻片的位置。
b)交換持針器通過持針器交換結(jié)構(gòu)從定點(diǎn)側(cè)裝置摘下定點(diǎn)結(jié)束的針，移動(dòng)到持針器待機(jī)位置進(jìn)行定位，通過持針器交換結(jié)構(gòu)移動(dòng)已經(jīng)定位了的新的供給樣品的針，安裝到定點(diǎn)側(cè)裝置。
c)持針器位置識(shí)別、位置補(bǔ)正用持針器位置讀取傳感器讀取持針器的安裝位置進(jìn)行位置補(bǔ)正(X、Y、Q)d)點(diǎn)樣分別進(jìn)行與各個(gè)載玻片相對(duì)應(yīng)的持針器的位置補(bǔ)正(X、Y、Q)，進(jìn)行點(diǎn)樣。
用上述方法進(jìn)行定點(diǎn)可制備生物分子微陣列。
本發(fā)明可提供制備生物分子微陣列的方法和裝置，它高精確度地將含有探針生物分子的溶液定點(diǎn)到相應(yīng)的有規(guī)定位置的探針生物分子接納固相部，將規(guī)定量(數(shù)量)的探針生物分子固定到各個(gè)探針生物分子接納固相部。
按本發(fā)明的方法得到的DNA微陣列上的DNA檢測點(diǎn)部分全部是相同形狀、相同面積，且整個(gè)檢測點(diǎn)部分均固定了相同數(shù)目的探針DNA，所以應(yīng)用該DNA微陣列可以進(jìn)行定量分析。因?yàn)镈NA微陣列上的DNA吸附部位只限于特定部位，即只限于DNA檢測點(diǎn)部，所以可以防止DNA非特異性吸附到DNA檢測點(diǎn)部的周圍。因此可減少熒光檢測時(shí)的噪音(不想要的光)，從而增強(qiáng)S/N比。
再者，通過使DNA檢測點(diǎn)部的形狀即上述的特定部位的形狀與攝像時(shí)使用的固體攝像元件(CCD傳感器、CMOS傳感器等)的象素形狀保持一致，可進(jìn)一步提高S/N比。[圖1]表示一例生物分子微陣列用基板制備方法的制造流程圖。表示親和素分子單層結(jié)合到各DNA固相化膜15的生物素分子末端的過程。表示表面上有用于確定基板位置的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的基板的實(shí)例。表示一例調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志。表示一例本發(fā)明的裝置。表示點(diǎn)到表面處理基板上的探針生物分子接納固相部(特定部位)的溶液中DNA量(濃度)與固化到特定部位的DNA量之間的關(guān)系的測定結(jié)果。
權(quán)利要求
1.生物分子微陣列的制備方法，它包含準(zhǔn)備表面有多個(gè)探針生物分子接納固相部的基板的工序，其中上述各個(gè)探針生物分子接納固相部能特異且定量接受探針生物分子，以及將包含探針生物分子的溶液定點(diǎn)到上述探針生物分子接納固相部，使該溶液中所含探針生物分子固化到探針生物分子接納固相部的工序，其中上述溶液的滴點(diǎn)是該溶液的1個(gè)液滴至少要覆蓋1個(gè)探針生物分子接納固相部的整面，且所述1個(gè)液滴中所含探針生物分子的數(shù)目在1個(gè)探針生物分子接納固相部所能容納的數(shù)目以上；其中所述基板表面上有確定基板位置的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，上述探針生物分子接納固相部通過與調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系而進(jìn)行位置確定，且上述溶液的滴點(diǎn)相對(duì)于通過上述調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系而進(jìn)行位置確定的探針生物分子接納固相部進(jìn)行。
2.權(quán)利要求1的制備方法，它用CCD相機(jī)讀取上述調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，通過這種讀取識(shí)別基板表面的探針生物分子接納固相部的位置，通過識(shí)別位置的定點(diǎn)手段來滴點(diǎn)包含探針生物分子的溶液。
3.權(quán)利要求1或2的制備方法，其特征在于，探針生物分子為DNA、RNA、PNA或蛋白質(zhì)。
4.含有探針生物分子的溶液的定點(diǎn)裝置，它具有讀取生物分子微陣列用基板上的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的CCD相機(jī)，根據(jù)該CCD相機(jī)讀取的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的位置識(shí)別探針生物分子接納固相部的位置的結(jié)構(gòu)，以及定點(diǎn)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)具有通過定點(diǎn)手段將包含探針生物分子的溶液定點(diǎn)到由上述結(jié)構(gòu)進(jìn)行位置識(shí)別所識(shí)別的探針生物分子接納固相部上的位置調(diào)控結(jié)構(gòu)。
5.權(quán)利要求4的定點(diǎn)裝置，它還有用于整齊排列生物分子微陣列用基板的臺(tái)面和保持針的持針器，針用于滴點(diǎn)包含探針生物分子的溶液，持針器介助于持針器位置補(bǔ)正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)而接續(xù)于X軸、Y軸和Z軸的各移動(dòng)裝置上。
6.權(quán)利要求4或5的定點(diǎn)裝置，在持針器位置補(bǔ)正回轉(zhuǎn)結(jié)構(gòu)(θ軸)附近它還有基板讀取相機(jī)和印記觀察裝置。
全文摘要
生物分子微陣列的制備方法及該方法中使用的裝置，該方法包括預(yù)備表面上有多個(gè)能特異且定量接受探針生物分子的探針生物分子接納固相部的基板，將含有探針生物分子的溶液點(diǎn)到上述固相部，將該溶液中所含探針生物分子固定到上述固相部(該溶液的點(diǎn)樣是溶液的1滴液滴要覆蓋1個(gè)固相部的整面，且1個(gè)液滴中所含探針生物分子的數(shù)目在1個(gè)固相部所能容納的數(shù)目以上)。上述基板表面上有用于確定基板位置的調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志，根據(jù)與調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志的位置關(guān)系確定上述固相部的位置，并且溶液的滴點(diǎn)相對(duì)于通過與調(diào)準(zhǔn)標(biāo)志間的位置關(guān)系而進(jìn)行位置確定的固相部進(jìn)行。
文檔編號(hào)G01N37/00GK1405326SQ0213030
公開日2003年3月26日 申請(qǐng)日期2002年8月12日 優(yōu)先權(quán)日2001年8月10日
發(fā)明者田代英夫, 橘內(nèi)德司, 近藤恭光, 白井武樹, 中澤東治, 飯村彰浩 申請(qǐng)人:理化學(xué)研究所, Thk株式會(huì)社