專利名稱：血紅蛋白的測(cè)定方法和血紅蛋白糖化率的測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定試樣中的血紅蛋白(Hb)量的方法。
作為Hb的測(cè)定方法，想到的是用吸光度來(lái)測(cè)定。然而，前述未變性的Hb，例如，根據(jù)與氧結(jié)合的狀態(tài)和未結(jié)合的狀態(tài)等的其狀態(tài)的不同，顯示吸收最大值的波長(zhǎng)也不同。因此即使單純地測(cè)定的吸光度也難以準(zhǔn)確求出Hb量。所以，過(guò)去已經(jīng)提出了通過(guò)變性使Hb穩(wěn)定化后再來(lái)測(cè)定其吸光度的方法。作為這樣的方法，已經(jīng)有，例如，氰化高鐵血紅蛋白法(HiCN法)、疊氮高鐵血紅蛋白法、月桂磺酸鈉(SLS)法、堿正鐵血紅素法等，其中，特別是國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的HiCN法已經(jīng)得到廣泛的采用。此HiCN法是，向血液中加入含鐵氰化鉀和氰化鉀的試劑，把Hb變成穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白，通過(guò)測(cè)定在規(guī)定波長(zhǎng)(540nm)的吸光度來(lái)求Hb量的方法。
因此，本發(fā)明的目的在于提供可以在沒(méi)有環(huán)境問(wèn)題的情況下容易且準(zhǔn)確測(cè)定Hb量的Hb測(cè)定方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明的Hb測(cè)定方法是一種用四唑鎓化合物使試樣中的血紅蛋白變性，在對(duì)得到的變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量，從此光學(xué)變化量算出前述試樣中的血紅蛋白量的方法。再者，在本發(fā)明中，所謂變性Hb是指用四唑鎓化合物變性的血紅蛋白。
根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定方法，用四唑鎓化合物變性的變性Hb是穩(wěn)定的，與根據(jù)其形態(tài)而具有各種各樣吸收波長(zhǎng)的未變性Hb不同，由于顯示吸收最大的波長(zhǎng)在一定范圍之內(nèi)，就可以很容易的求得Hb量。還有，不使用前述那樣的氰化合物或強(qiáng)堿物質(zhì)，在環(huán)境方面安全，是有用方法。
在本發(fā)明的測(cè)定方法中，作為前述光學(xué)變化量，列舉有，例如，吸光度和反射率等。
作為前述四唑鎓化合物，并沒(méi)有特別的限制，例如可以使用后面講的化合物，不過(guò)，特別優(yōu)選的是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽(例如，同仁化學(xué)研究所公司制造的商品WST-3)。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)在440～700nm的范圍為優(yōu)選，500～670nm范圍為更優(yōu)選，540～670nm范圍為特別優(yōu)選。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，前述四唑鎓化合物的加入量沒(méi)有特別的限制，可以根據(jù)前述試樣的種類等來(lái)適當(dāng)確定。具體說(shuō)，例如，每1μL的試樣，加入前述四唑鎓化合物并使其達(dá)到0.001～100μmol范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.01～10μmol范圍，特別優(yōu)選0.05～5μmol范圍。
前述試樣并沒(méi)有特別的限制，如后面講的那樣優(yōu)選含紅血球的試樣，例如全血。在用全血試樣的場(chǎng)合，四唑鎓化合物的加入量，對(duì)于1μL的前述試樣，例如加入0.01～30μmol范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.05～10μmol范圍，特別優(yōu)選0.1～5μmol范圍。再者，在全血中的血球濃度通常推定為約50重量％。
本發(fā)明的測(cè)定方法，在表面活性劑的存在下用四唑鎓化合物處理前述試樣中的血紅蛋白為優(yōu)選。如果這樣地進(jìn)一步共存表面活性劑的話，則更進(jìn)一步促進(jìn)了Hb的變性，使得測(cè)定更迅速的進(jìn)行。
前述表面活性劑的加入量，沒(méi)有特別的限制，例如，可以由前述四唑鎓化合物的加入量等來(lái)適當(dāng)?shù)拇_定。具體說(shuō)，相對(duì)于1mol的四唑鎓化合物，表面活性劑的加入量例如為0.01～70mol范圍，優(yōu)選0.05～50mol范圍，更優(yōu)選0.1～20mol范圍。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，前述試樣沒(méi)有特別的限制，可以列舉的有全血、血漿、血清、血球等血液試樣等。以含有紅血球的試樣為優(yōu)選，具體是全血試樣、血球試樣等。
接著，本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法是用上述本發(fā)明的Hb測(cè)定方法來(lái)測(cè)定含糖化Hb試樣的Hb量，另一方面，把所得到的前述變性Hb的糖化部分與果糖基氨基酸氧化酶(以下稱為“FAOD”)反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定此氧化還原反應(yīng)來(lái)測(cè)定Hb的糖化量，從前述Hb量和前述糖化量求得Hb糖化率。再者，所謂Hb量，是包括了糖化了的Hb和未糖化的Hb兩方的。
本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法，與前述一樣，不產(chǎn)生有害廢液，在環(huán)境方面優(yōu)越，所以是有用的方法。還有，前述四唑鎓化合物與前述強(qiáng)堿性試劑等不同，對(duì)于采用前述氧化還原反應(yīng)的酶法進(jìn)行的糖化量測(cè)定不產(chǎn)生使酶失活等影響。為此，使用用四唑鎓化合物處理過(guò)的試樣，不僅可以進(jìn)行前述那樣的Hb測(cè)定，而且也可以方便地進(jìn)行糖化量測(cè)定的一系列操作。為此，例如，使用一個(gè)測(cè)定裝置、采用一個(gè)反應(yīng)體系就可以進(jìn)行本發(fā)明的測(cè)定。還有，如果在試樣中加入了前述四唑鎓化合物，則不僅可以使Hb變性，而且還可以除去存在于前述試樣中的、影響前述氧化還原反應(yīng)的還原物質(zhì)的影響，這樣就可以以更高的精度求出糖化率。
本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法中，與前面講過(guò)的一樣，變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)在440～700nm范圍為優(yōu)選，在500～670nm范圍為更優(yōu)選，在540～670nm范圍為特別優(yōu)選。
本發(fā)明的測(cè)定方法中，前述氧化還原反應(yīng)的測(cè)定是由其所產(chǎn)生的顯色物質(zhì)的光學(xué)變化量的測(cè)定為優(yōu)選。再者，所謂光學(xué)變化量與前面講的一樣，是指例如吸光度和反射率等。
在前述那樣的酶法中，測(cè)定光學(xué)變化量時(shí)，通常雙波長(zhǎng)測(cè)定為主流。在前述雙波長(zhǎng)測(cè)定中，例如，以顯示測(cè)定的對(duì)象物(例如，顯色物質(zhì))的最大吸收的波長(zhǎng)為主波長(zhǎng)來(lái)測(cè)定前述對(duì)象物，再以與此前述主波長(zhǎng)不同的波長(zhǎng)為副波長(zhǎng)來(lái)校正電噪音、試樣的混濁、光量變化等。所以，副波長(zhǎng)設(shè)定在其它混在的物質(zhì)不顯示吸收的波長(zhǎng)為優(yōu)選。前述主波長(zhǎng)，根據(jù)前述測(cè)定的對(duì)象物的吸收波長(zhǎng)來(lái)適當(dāng)確定，不過(guò)，一般是約650～800nm范圍。在這種情況下，副波長(zhǎng)要設(shè)定在比其高的波長(zhǎng)約800～900nm范圍。然而，如前面講的那樣，未變性Hb根據(jù)與氧結(jié)合的形態(tài)、非結(jié)合形態(tài)等的其形態(tài)，對(duì)各種各樣的波長(zhǎng)顯示吸收，是不穩(wěn)定的，因此，例如在用前述那樣的顯色性基質(zhì)等的吸光度來(lái)測(cè)定糖化量時(shí)，在副波長(zhǎng)也看到了Hb的吸收，使得難以準(zhǔn)確進(jìn)行糖化量的測(cè)定。然而，用四唑鎓化合物處理所得到的變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)，在前面已經(jīng)講過(guò)了。所以，例如即使在糖化量測(cè)定中把副波長(zhǎng)設(shè)定在800nm～900nm范圍，根據(jù)本發(fā)明就沒(méi)有看到前面所講那樣的依賴于形態(tài)而不穩(wěn)定的未變性Hb的吸收導(dǎo)致的影響。因此，可以以高精度進(jìn)行糖化量的測(cè)定。
作為前述顯色物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)，例如，是在500～800nm范圍，以在540～750nm范圍為優(yōu)選。
再者，如后面敘述那樣，把為測(cè)定前述Hb量的測(cè)定波長(zhǎng)與前述顯色物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定為同一波長(zhǎng)也行。在此場(chǎng)合，例如，將測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定在500～670nm范圍為優(yōu)選，540～670nm范圍為更優(yōu)選。
本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法，在使前述變性Hb的糖化部分與FAOD反應(yīng)之前，對(duì)前述變性Hb進(jìn)行蛋白酶處理為優(yōu)選。前述FAOD要比糖化蛋白質(zhì)、糖化肽更容易與糖化氨基酸、更短的糖化肽片段作用。為此，如果預(yù)先把前述變性Hb用蛋白酶分解的話，前述FAOD變得容易與糖化部分作用，因此可以提高測(cè)定精度。
如前述那樣，如果適用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法，就可以直接用使Hb變性了的試樣來(lái)作為測(cè)定Hb糖化量的試樣。所以，對(duì)前述試樣的Hb量測(cè)定和Hb糖化量的測(cè)定例如可以按以下所示順序來(lái)進(jìn)行。
第1種方法是，例如，在對(duì)變性Hb特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量之后，使前述變性Hb的糖化部分與FAOD反應(yīng)的方法。
在此第1種方法中，進(jìn)行蛋白酶處理的場(chǎng)合，例如，在對(duì)變性Hb特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量之后，把前述變性Hb進(jìn)行蛋白酶處理，使前述變性Hb分解物的糖化部分與FAOD反應(yīng)也行。另外，對(duì)變性Hb進(jìn)行了蛋白酶處理后，在對(duì)前述變性Hb特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量，其后，再使前述變性Hb分解物的糖化部分與FAOD反應(yīng)也行。
又，第2種方法是，例如，使變性Hb的糖化部分與FAOD反應(yīng)之后，進(jìn)行在對(duì)前述變性Hb特異的吸收波長(zhǎng)下的前述試樣的光學(xué)變化量的測(cè)定和前述氧化還原反應(yīng)的測(cè)定的方法。在此方法的場(chǎng)合，例如，通過(guò)把變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)與顯色物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定為不同的波長(zhǎng)，也就可以同時(shí)測(cè)定兩者的光學(xué)變化量。
在此第2種方法中進(jìn)行蛋白酶處理的場(chǎng)合，例如，在使變性Hb的糖化部分與FAOD反應(yīng)之前，將前述變性Hb蛋白酶處理為好。
本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法中，前述顯色物質(zhì)的光學(xué)變化量與通過(guò)使前述變性Hb的糖化部分與FAOD反應(yīng)而生成的過(guò)氧化氫量相對(duì)應(yīng)為優(yōu)選。前述顯色物質(zhì)優(yōu)選的是，例如，使用氧化酶和通過(guò)氧化而顯色的基質(zhì)(以下稱為顯色性基質(zhì))，通過(guò)前述氧化酶使前述過(guò)氧化氫和前述顯色性基質(zhì)反應(yīng)時(shí)顯色了的前述顯色性基質(zhì)。
作為前述氧化酶，沒(méi)有特別的限制，但以POD為優(yōu)選。作為前述顯色性基質(zhì)，沒(méi)有特別的限制，不過(guò)從能以高靈敏度被檢出來(lái)說(shuō)，優(yōu)選為，例如，N-(羧甲氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉(例如，商品名DA-64，和光純藥工業(yè)公司制造)。
在本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法中，前述試樣并沒(méi)有特別的限制，列舉有與前面前述同樣的物質(zhì)。
當(dāng)前述四唑鎓化合物是，如前述，在前述四唑環(huán)的至少2個(gè)位置上有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時(shí)，在前述四唑環(huán)的2位和3位有前述取代基為優(yōu)選。還有，當(dāng)前述四唑鎓化合物是在前述四唑環(huán)的3個(gè)位置上有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基時(shí)，在前述四唑環(huán)的2位、3位和5位有前述取代基為優(yōu)選。
還有，前述四唑鎓化合物至少2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)是苯環(huán)為優(yōu)選。還有，作為除了苯環(huán)以外的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基，例如可舉出在環(huán)骨架中含硫或氧、且是共振結(jié)構(gòu)的取代基，例如，噻嗯基、噻唑(チアゾイル)基等。
前述四唑鎓化合物，在四唑環(huán)的至少3個(gè)位置上有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基、前述環(huán)結(jié)構(gòu)取代基中的至少2個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的環(huán)結(jié)構(gòu)是苯環(huán)為優(yōu)選。
前述四唑鎓化合物的至少1個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)取代基有官能團(tuán)為優(yōu)選，前述官能團(tuán)的數(shù)目多者為更優(yōu)選。
作為前述官能團(tuán)，以電子吸引性官能團(tuán)為優(yōu)選，例如，列舉有鹵基、醚基、酯基、羧基、?；?、亞硝基、硝基、羥基、磺基等。其它列舉的有，例如，過(guò)氧化氫基、氧代(oxy)基、環(huán)氧基、表二氧基、氧合(oxo)等含氧的特性基團(tuán)和巰基、烷基硫基、甲基硫甲基、硫代基、亞磺基、苯磺?；?benzenesulfonyl)、苯基磺?；?phenylsulfonyl)、對(duì)甲苯磺?；?p-toluenesulfonyl)、對(duì)甲苯基磺酰基(p-tolylsulfonyl)、對(duì)甲苯磺酰基(tosyl)、氨磺?；惲蚯杷狨セ群虻奶匦曰鶊F(tuán)等。在這些電子吸引性取代基中，優(yōu)選的是硝基、磺基、鹵基、羧基、羥基、甲氧基、乙氧基。還有，除了上述電子吸引性的取代基之外，例如，還可以列舉苯基(C6H5-)、苯乙烯基(C6H5CH＝CH-)等不飽和烴基等。再者，上述官能團(tuán)通過(guò)解離而離子化也行。
前述四唑鎓化合物在其四唑環(huán)的2位和3位有苯環(huán)、前述苯環(huán)中的至少1個(gè)具有至少1個(gè)從鹵基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基和乙氧基中選出的官能團(tuán)為優(yōu)選。再者，前述兩個(gè)苯環(huán)有前述官能團(tuán)也可以。在前述苯環(huán)中，在任何位置(鄰位、間位、對(duì)位)有前述官能團(tuán)者也行。還有，對(duì)官能團(tuán)的數(shù)目沒(méi)有特別的限制，無(wú)論是有相同的官能團(tuán)還是有不同的官能團(tuán)都行。
前述四唑鎓化合物，例如，作為在前述四唑環(huán)的2位、3位和5位有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，列舉有，例如，2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽、2-(4-碘代苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽、3，3’-(1，1’-聯(lián)苯-4，4’-二基)-雙(2，5-二苯基)-2H-四唑鎓鹽、3，3’-[3，3’-二甲氧基-(1，1’-聯(lián)苯)-4，4’-二基]-雙[2-(4-硝基苯基)-5-苯基-2H-四唑鎓鹽]、2，3-二苯基-5-(4-氯代苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(對(duì)二苯基)四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-(對(duì)二苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(4-苯乙烯基苯基)四唑鎓鹽、2，5-二苯基-3-(間甲苯基)四唑鎓鹽和2，5-二苯基-3-(對(duì)甲苯基)四唑鎓鹽等。
還有，前述四唑鎓化合物并不限于前述那樣的化合物，除此以外，也可以使用在前述四唑環(huán)的2個(gè)位置上有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基和1個(gè)位置上有其它的環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物。例如，2，3-二苯基-5-(2-噻嗯基)四唑鎓鹽、2-苯并噻唑基-3-(4-羧基-2-甲氧基苯基)-5-[4-(2-磺乙基氨基甲?；?苯基]-2H-四唑鎓鹽、2，2’-二苯并噻唑基-5，5’-雙[4-二(2-磺乙基)氨基甲酰基苯基]-3，3’-(3，3’-二甲氧基-4，4’-二苯撐)二(四唑)鎓鹽和3-(4，5-二甲基-2-噻唑基)-2，5-二苯基-2H-四唑鎓鹽等。
另外，也可以使用前述四唑環(huán)的2個(gè)位置上有苯環(huán)結(jié)構(gòu)取代基和1個(gè)位置上有非環(huán)結(jié)構(gòu)的取代基的四唑鎓鹽化合物，例如，列舉有2，3-二苯基-5-氰基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-羧基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-甲基四唑鎓鹽、2，3-二苯基-5-乙基四唑鎓鹽等。
在前述四唑鎓化合物中，如前述那樣，優(yōu)選有3個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)取代基的化合物，更優(yōu)選有3個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)是苯環(huán)的取代基、且較多地有電子吸引性官能團(tuán)者，特別優(yōu)選的是前面已經(jīng)講到的2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽。再者，這樣的四唑鎓化合物是，例如，也可以是鹽，也可以是離子化的狀態(tài)等。另外，四唑鎓鹽化合物，可以是1種也可以把2種以上合并使用。
作為在本發(fā)明的Hb測(cè)定方法中可以使用的前述表面活性劑，并沒(méi)有特別的限制，但例如聚氧乙烯醚等為優(yōu)選。此聚氧乙烯醚[CLHM-O-(CH2CH2O)NH]是聚氧乙烯鏈與烴鏈進(jìn)行醚鍵合，作為前述烴鏈列舉有，例如，烷基、烷基苯基等。前述的聚氧乙烯鏈的重均聚合度(N)在8～23的范圍而另一方的碳數(shù)(L)在8～18的范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選前述的重均聚合度(N)在8～15的范圍而烴類的碳數(shù)(L)在8～16范圍，前述的重均聚合度(N)在8～10的范圍而烴類的碳數(shù)(L)在8～14范圍為特別優(yōu)選。另外，前述烴鏈，例如，直鏈也行，有支鏈也行。作為前述聚氧乙烯醚的具體例子，列舉有，例如，聚氧乙烯對(duì)叔辛基苯基醚、聚乙二醇(10)月桂醚、聚乙二醇(9)月桂醚等。無(wú)論是用這些中的任何一種還是2種以上合并使用都行。
更具體說(shuō)，例如，可以使用市售的Triton類表面活性劑聚氧乙烯對(duì)叔辛基苯基醚等、市售的Tween類表面活性劑聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯等、市售的Brij類表面活性劑聚氧乙烯烷基醚等。除此以外，例如，也可以使用聚氧乙烯(10)月桂醚、商品名Nikkol BL-9EX(聚氧乙烯的重均聚合度N為9，和光純藥工業(yè)公司制造)等之類的聚氧乙烯(9)月桂醚、商品名Tergitol NPX(聚氧乙烯的重均聚合度N為約10.5，ナカライテスク公司制造)和商品名Tergitol NP-40(聚氧乙烯的重均聚合度N為20，ナカライテスク公司制造)等之類的聚氧乙烯辛苯基醚等。
本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法中使用的前述FAOD優(yōu)選是下述式(1)所示的催化反應(yīng)的FAOD。
……(1)在前述式(1)中，R1表示羥基或來(lái)自于糖化反應(yīng)前的糖的殘基(糖殘基)。當(dāng)反應(yīng)前的糖是醛糖時(shí)，前述糖殘基(R1)是醛糖殘基，而反應(yīng)前的糖是酮糖時(shí)，則是酮糖殘基。例如，當(dāng)反應(yīng)前的糖是葡萄糖時(shí)，通過(guò)阿馬多利重排使反應(yīng)后的結(jié)構(gòu)為果糖結(jié)構(gòu)，但此時(shí)，糖殘基(R1)是葡萄糖殘基(醛糖殘基)。此糖殘基(R1)例如可以用-[CH(OH)]n-CH2OH表示，其中的n為0～6的整數(shù)。
在前述式(1)中，R2沒(méi)有特別的限制，但例如，在糖化氨基酸、糖化肽或糖化蛋白質(zhì)的場(chǎng)合、α-氨基被糖化的場(chǎng)合、與此以外的氨基被糖化的場(chǎng)合下不同。
在前述式(1)中，α-氨基被糖化的場(chǎng)合，R2是以下述式(2)所示的氨基酸殘基或肽殘基。
-CHR3-CO-R4……(2)在前述式(2)中，R3表示氨基酸側(cè)基。R4可以表示羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以以下述式(3)來(lái)表示。在下述式(3)中，n為0以上的整數(shù)，R3與前面一樣表示氨基酸側(cè)基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH……(3)在前述式(1)中，α-氨基以外的氨基被糖化(氨基酸側(cè)基被糖化)的場(chǎng)合，R2可以以下述式(4)來(lái)表示。
-R5-CH(NH-R6)-CO-R7……(4)在前述式(4)中，R5表示氨基酸側(cè)基中被糖化的氨基之外的部分。例如，糖化的氨基酸為賴氨酸時(shí)，R5是-CH2-CH2-CH2-CH2-，例如，糖化的氨基酸為精氨酸時(shí)，R5為-CH2-CH2-CH2-NH-CH(NH2)-。
在前述式(4)中，R6為氫、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以以下述式(5)表示。再者，在下述式(5)中，n為0以上的整數(shù)，R3與前面一樣表示氨基酸側(cè)基。
-(CO-CHR3-NH)n-H……(5)在前述式(4)中，R7為羥基、氨基酸殘基或肽殘基，例如，可以以下述式(6)表示。再者，在下述式(6)中，n為0以上的整數(shù)，R3與前面一樣表示氨基酸側(cè)基。
-(NH-CHR3-CO)n-OH……(6)本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法中，作為前述蛋白酶沒(méi)有特別的限制，例如，可以使用絲氨酸蛋白酶、硫趕蛋白酶、金屬蛋白酶等，具體說(shuō)，以胰蛋白酶、蛋白酶K、胰凝乳蛋白酶、番瓜蛋白酶、菠蘿蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、彈性蛋白酶、氨基肽酶等為優(yōu)選。更優(yōu)選的是把前述糖化Hb選擇性分解的蛋白酶，優(yōu)選菠蘿蛋白酶、番瓜蛋白酶、來(lái)自于豬胰的胰蛋白酶、金屬蛋白酶、來(lái)自于Bacillus subtillis的蛋白酶等。作為前述來(lái)自于Bacillus subtillis的蛋白酶，列舉有商品名為蛋白酶N(例如，フルカ公司制造)、商品名為蛋白酶N“アマノ”(天野制藥公司制造)等的商品。作為前述金屬蛋白酶，列舉有來(lái)自于Bacillus的金屬蛋白酶(EC3.4.24.4)(例如，東洋紡社制造的商品トヨチ-ム)等。它們中，以金屬蛋白酶、菠蘿蛋白酶、番瓜蛋白酶為優(yōu)選，金屬蛋白酶為特別優(yōu)選。這樣，如果使用把糖化Hb選擇性分解的蛋白酶的話，就可以選擇性調(diào)制糖化Hb分解物，可以更進(jìn)一步提高測(cè)定精度。
接下來(lái)，舉出以前述全血為試樣的例子來(lái)說(shuō)明本發(fā)明的Hb測(cè)定方法。
首先，將全血原樣地溶血，或者從全血用離心分離等通常方法分離出血球成分，將其溶血，調(diào)制成溶血試樣。該溶血方法沒(méi)有特別的限制，例如，可以使用采用了表面活性劑的方法、采用超聲波的方法、利用滲透壓差的方法等，其中使用前述表面活性劑的方法為優(yōu)選。
作為溶血用的表面活性劑沒(méi)有特別的限制，例如，可以使用聚氧乙烯對(duì)叔辛基苯基醚(Triton類表面活性劑等)、聚氧乙烯山梨糖醇酐烷基酯(Tween類表面活性劑等)、聚氧乙烯烷基醚(Bril類表面活性劑等)等非離子型表面活性劑。具體列舉有，例如，Triton X-100、Tween-20、Brij35等商品。采用前述表面活性劑的處理?xiàng)l件，通常，當(dāng)處理溶液中的血球濃度為1～10體積％時(shí)，加入前述表面活性劑使得在前述處理溶液中的濃度為0.1～1重量％，在室溫下攪拌5秒～1分鐘左右為好。
還有，在前述利用滲透壓差的場(chǎng)合，例如，可以加入相對(duì)于全血的體積為2～100倍體積量的純凈水來(lái)溶血。
接著，在前述溶血試樣中，加入前述四唑鎓化合物，進(jìn)行Hb變性。
作為前述四唑鎓化合物，可以使用前面講過(guò)的化合物，例如，當(dāng)前述溶血試樣中的血球濃度為0.2～2體積％時(shí)，添加以使?jié)舛冗_(dá)到0.005～400mmol/L范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.02～100mmol/L范圍，特別優(yōu)選0.1～50mmol/L范圍。具體說(shuō)，當(dāng)前述四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽時(shí)，添加以使?jié)舛瘸蔀?.004～16mmol/L范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.02～10mmol/L范圍，特別優(yōu)選0.1～5mmol/L范圍。
按原樣來(lái)使用前述四唑鎓化合物也是可以的，不過(guò)，從操作簡(jiǎn)便性和處理效率等點(diǎn)來(lái)看，以溶解在溶劑中的四唑鎓化合物溶液的形式使用為優(yōu)選。前述溶液的濃度可以隨四唑鎓化合物的種類(例如分子量等)等來(lái)適當(dāng)?shù)倪x擇，例如，在0.01～120mmol/L范圍，優(yōu)選在0.1～50mmol/L范圍，在0.2～20mmol/L范圍為更優(yōu)選。作為前述溶劑，例如，可以使用蒸餾水、生理鹽水、緩沖液等。前述緩沖液，例如，可以使用MES、MOPS、磷酸、ADA、PIPES、ACES、CHES、HEPES等緩沖液等。還有，前述緩沖液的pH例如在5.5～10.0范圍為優(yōu)選。
對(duì)采用前述四唑鎓化合物的處理?xiàng)l件并沒(méi)有特別的限制，例如，為溫度4～50℃范圍、處理時(shí)間20秒～60分鐘的范圍，優(yōu)選溫度15～40℃范圍、優(yōu)選處理時(shí)間20秒～20分鐘，更優(yōu)選溫度25C～37℃范圍、處理時(shí)間30秒～6分鐘。
還有，此前述四唑鎓化合物的處理在如前前述那樣在表面活性劑存在下來(lái)進(jìn)行時(shí)，可以進(jìn)一步促進(jìn)Hb的變性。為此，從操作的簡(jiǎn)便性等來(lái)看，在試樣溶血時(shí)，預(yù)先加入四唑鎓化合物也行。
表面活性劑的加入量并沒(méi)有特別的限制，例如，在前述溶血試樣中的血球濃度在0.2～1體積％時(shí)，添加以使達(dá)到濃度0.05～50mmol/L范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.2～30mmol/L范圍，特別優(yōu)選0.3～10mmol/L范圍。具體說(shuō)，當(dāng)前述表面活性劑是商品Triton X-100時(shí)，添加使得濃度達(dá)到0.2～100mmol/L的范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選1～30mmol/L的范圍，特別優(yōu)選2～20mmol/L的范圍。當(dāng)前述表面活性劑是商品Brij35時(shí)，添加并使得濃度達(dá)到0.1～50mmol/L的范圍為優(yōu)選，更優(yōu)選0.5～20mmol/L那樣來(lái)加入，特別優(yōu)選1～10mmol/L的范圍。
還有，前述表面活性劑，相對(duì)于1mol前述四唑鎓化合物，例如，添加使達(dá)到0.01～70mol范圍也可以，在0.05～50mol范圍為優(yōu)選，在0.1～20mol范圍為更優(yōu)選。
具體說(shuō)，在前述表面活性劑是商品Triton X-100時(shí)，相對(duì)于1mmol前述四唑鎓化合物，添加使達(dá)到0.05～15mmol范圍為優(yōu)選，在0.1～10mmol范圍為更優(yōu)選，0.2～5mmol范圍為特別優(yōu)選。還有，在為商品Brij35時(shí)，相對(duì)于1mmol前述四唑鎓化合物，添加使達(dá)到0.05～10mmol范圍為優(yōu)選，在0.1～8mmol范圍為更優(yōu)選，0.2～4mmol范圍為特別優(yōu)選。再者，在試樣溶血時(shí)預(yù)先加入足夠量的表面活性劑可以促進(jìn)Hb變性，這也是可以的。
接下來(lái)，進(jìn)行前述變性Hb的吸光度測(cè)定。如前前述，測(cè)定波長(zhǎng)在440～700nm范圍為優(yōu)選，500～670nm范圍為更優(yōu)選，540～670nm范圍為特別優(yōu)選。還有，在以前述波長(zhǎng)為主波長(zhǎng)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定的場(chǎng)合，副波長(zhǎng)在730～900nm范圍為優(yōu)選，800～900nm范圍為更優(yōu)選，800～850nm范圍為特別優(yōu)選。
然后，從所測(cè)定的吸光度和預(yù)先準(zhǔn)備的校正曲線求出Hb量。這樣，如果用四唑鎓化合物使試料中的Hb變性的話，就可以容易且準(zhǔn)確地求得變性Hb的量。
再者，上述校正曲線，例如，可以用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法和公知的測(cè)定方法測(cè)定含各種濃度Hb的試樣再由這些測(cè)定值來(lái)作出。作為前述的公知測(cè)定方法，只要是測(cè)定精度優(yōu)異的方法就行，沒(méi)有特別的限制，例如，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的HiCN法為優(yōu)選。還有，用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法測(cè)定含有已知濃度的Hb的標(biāo)準(zhǔn)試樣并由此測(cè)定值和前述已知濃度來(lái)畫(huà)出校正曲線也行。
接著，關(guān)于本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法，說(shuō)明以前述全血作為試樣的第1測(cè)定方法之一個(gè)例子。
首先，與前述一樣，用四唑鎓化合物處理所調(diào)制的溶血試樣，測(cè)定其吸光度，求其Hb量。
然后，把前述處理過(guò)的溶血試樣進(jìn)行蛋白酶處理，把變性Hb分解。在這樣做了之后加入的FAOD，與糖化蛋白質(zhì)和糖化肽相比，更容易與糖化氨基酸、更短的糖化肽片段作用。
使用番瓜蛋白酶作為前述蛋白酶來(lái)處理前述溶血試樣時(shí)，通常，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度是100～30,000U/L、反應(yīng)液中的血球濃度是0.07～12體積％或反應(yīng)液中的Hb濃度是0.1～10g/L、反應(yīng)溫度為15～60℃、反應(yīng)時(shí)間為10min～40h、pH在5～9范圍。還有，前述的緩沖液的種類也沒(méi)有特別的限制，例如，可以使用Tris鹽酸緩沖液、EPPS緩沖液、PIPES緩沖液、磷酸緩沖液、ADA緩沖液、檸檬酸緩沖液、醋酸緩沖液等。
還有，使用金屬蛋白酶作為蛋白酶來(lái)處理前述溶血試樣時(shí)，通常，反應(yīng)液中的蛋白酶濃度是10～10,000KU/L、反應(yīng)液中的血球濃度是0.07～12體積％或反應(yīng)液中的Hb濃度是0.1～10g/L、反應(yīng)溫度為15～60℃、反應(yīng)時(shí)間為10min～40h、pH在6～9范圍。前述緩沖液可以用與上述同樣的。還有，其它的蛋白酶也同樣可以使用。
然后，把由上述蛋白酶處理得到的變性Hb分解物用FAOD處理。由此FAOD處理，催化了前述式(1)所示的反應(yīng)。
此FAOD處理，與前述蛋白酶處理同樣，在緩沖液中進(jìn)行為優(yōu)選。其處理?xiàng)l件隨所使用的FAOD的種類、作為測(cè)定對(duì)象物的糖化Hb的濃度等來(lái)適當(dāng)?shù)拇_定。
具體說(shuō)是，例如，反應(yīng)液中的FAOD濃度是50～50,000U/L、反應(yīng)液中的血球濃度是0.01～1體積％、反應(yīng)溫度為15～37℃、反應(yīng)時(shí)間為1～60min、pH在6～9范圍。前述緩沖液的種類也沒(méi)有特別的限制，可以使用與上述蛋白酶處理同樣的緩沖液。
然后，加入POD和上述顯色性基質(zhì)，采用POD使在前述FAOD處理中生成的過(guò)氧化氫與前述顯色性基質(zhì)進(jìn)行氧化還原反應(yīng)。
作為前述顯色性基質(zhì)，例如，列舉有N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉、鄰苯二胺(OPD)、將トリンダ-試劑與4-氨基安替比林組合的基質(zhì)等。作為前述トリンダ-試劑，例如，列舉有苯酚、苯酚衍生物、苯胺衍生物、萘酚、萘酚衍生物、萘胺、萘胺衍生物等。還有，除了前述4-氨基安替比林之外，氨基安替比林衍生物、香草醛二胺磺酸、甲基苯并噻唑啉腙(MBTH)、磺化甲基苯并噻唑啉腙(SMBTH)等也可以使用。在這些顯色性基質(zhì)中，特別優(yōu)選的是，如前前述，N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉。
前述氧化還原反應(yīng)通常是在緩沖液中進(jìn)行的，其條件由前述生成的過(guò)氧化氫的濃度等來(lái)適當(dāng)?shù)拇_定。通常，反應(yīng)液中的POD濃度是10～20,000IU/L、顯色性基質(zhì)濃度是0.0001～1mmol/L、反應(yīng)溫度為20～37℃、反應(yīng)時(shí)間為1～5min、pH在6～9范圍。還有，前述緩沖液的種類沒(méi)有特別的限制，例如，可以使用與上述蛋白酶處理和FAOD處理等同樣的緩沖液等。
而且，由前述氧化還原反應(yīng)使前述顯色性基質(zhì)顯色，用分光光度計(jì)測(cè)定前述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)。從此吸光度和校正曲線，例如，可以通過(guò)過(guò)氧化氫的量、或直接求出Hb糖化量。
前述吸光度的檢測(cè)波長(zhǎng)沒(méi)有特別的限制，可以隨前述顯色性基質(zhì)的種類而適當(dāng)?shù)拇_定，但在650～900nm范圍為優(yōu)選，650～800nm范圍為更優(yōu)選，650～760nm范圍為特別優(yōu)選。還有，當(dāng)以上述波長(zhǎng)為主波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，副波長(zhǎng)優(yōu)選為730～900nm范圍，800～900nm范圍為更優(yōu)選，800～850nm范圍為特別優(yōu)選。再者，副波長(zhǎng)通常設(shè)定得比主波長(zhǎng)高，設(shè)定得至少高出30nm以上為優(yōu)選，高出50nm以上為更優(yōu)選。
具體說(shuō)，在使用N-(羧甲基氨基羰基)-4，4’-雙(二甲氨基)二苯基胺鈉作為顯色基質(zhì)時(shí)，測(cè)定波長(zhǎng)在650～760nm范圍為優(yōu)選，690～760nm范圍為更優(yōu)選。還有，當(dāng)以上述波長(zhǎng)為主波長(zhǎng)來(lái)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，副波長(zhǎng)優(yōu)選為800～900nm范圍，800～850nm范圍為更優(yōu)選。
在此糖化率測(cè)定方法中，把上述變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)與顯色性基質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定成彼此互不重疊的波長(zhǎng)為優(yōu)選。進(jìn)而，在對(duì)顯色性基質(zhì)進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定時(shí)，主波長(zhǎng)和副波長(zhǎng)設(shè)定在變性Hb不顯示吸收的范圍為優(yōu)選。再者，如果在顯色反應(yīng)之前，在顯色性基質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度，由此對(duì)顯色反應(yīng)后的吸光度進(jìn)行校正，就可以把精度更提高一步。
另一方面，也可以把上述變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)與顯色性基質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定成相同的波長(zhǎng)。在此時(shí)，可以將把Hb用四唑鎓化合物變性之后測(cè)定的吸光度作為變性Hb的吸光度，進(jìn)而，由此吸光度對(duì)顯色反應(yīng)之后測(cè)定的吸光度進(jìn)行校正。也就是說(shuō)，如果從顯色反應(yīng)后的吸光度值導(dǎo)出變性Hb的吸光度值的話，則其成為顯色的基質(zhì)的吸光度。
這樣，使前述兩測(cè)定波長(zhǎng)為相同波長(zhǎng)的場(chǎng)合，前述波長(zhǎng)，例如，440～700nm的范圍為優(yōu)選，500～670nm為更優(yōu)選，540～670nm為特別優(yōu)選。
然后，從所測(cè)定的吸光度和預(yù)先準(zhǔn)備的校正曲線求出Hb糖化量，從此Hb糖化量和前述的Hb量，算出Hb糖化率。
前述校正曲線，例如，按照本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法，測(cè)定含有已知量的糖化Hb的標(biāo)準(zhǔn)試樣在顯色反應(yīng)后的吸光度，從此吸光度和前述已知濃度就可以制成。
再者，前述過(guò)氧化氫量，除了可以由使用了前述POD等的酶方法測(cè)定以外，還可以由電學(xué)方法來(lái)測(cè)定。
這樣，如果由四唑鎓化合物使Hb變性，并測(cè)定其量的話，則可以以一連串的操作進(jìn)行Hb量和糖化量的測(cè)定，由此，就可以迅速且簡(jiǎn)便地測(cè)定。還有，由于在試樣中預(yù)先加入了四唑鎓化合物，所以排除了試樣中存在的各種還原物質(zhì)對(duì)氧化還原反應(yīng)的影響，可以進(jìn)一步提高測(cè)定精度。
再者，Hb的糖化率，例如，以人的Hb為對(duì)象的場(chǎng)合，被稱為HbAlc％，因此，本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法是一種對(duì)測(cè)定HbAlc％有用的方法。
接下來(lái)，關(guān)于本發(fā)明的Hb糖化率的測(cè)定方法，說(shuō)明以前述全血作為試樣的第2測(cè)定方法之一個(gè)例子。
與前述一樣，用四唑鎓化合物使前述溶血試樣中的Hb變性，再把前述試樣進(jìn)行蛋白酶處理，然后進(jìn)行FAOD處理。進(jìn)行此種用FAOD處理了的反應(yīng)液的變性Hb測(cè)定、和用分光光度計(jì)測(cè)定前述反應(yīng)液的顯色程度(吸光度)即可。
在此場(chǎng)合，為了對(duì)同一反應(yīng)液進(jìn)行變性Hb和顯色程度的測(cè)定，有必要把對(duì)兩者的測(cè)定波長(zhǎng)設(shè)定為不同的波長(zhǎng)。例如，變性Hb的測(cè)定波長(zhǎng)(A)為440～700nm范圍，顯色程度的測(cè)定波長(zhǎng)(B)為500～800nm范圍，優(yōu)選(A)在500～670nm范圍、(B)在540～670nm范圍，更優(yōu)選(A)在540～670nm范圍、(B)在540～670nm范圍。再者，(A)和(B)例如設(shè)定為相差30nm以上為好。
還有，在進(jìn)行雙波長(zhǎng)測(cè)定的場(chǎng)合，例如，可以設(shè)定成以下那樣。例如，(A)的主波長(zhǎng)在440～700nm范圍，副波長(zhǎng)在730～900nm范圍，(B)的主波長(zhǎng)在500～800nm范圍、副波長(zhǎng)在800～900nm范圍為優(yōu)選，(A)的主波長(zhǎng)在500～670nm范圍，副波長(zhǎng)在730～900nm范圍，(B)的主波長(zhǎng)在540～750nm范圍、副波長(zhǎng)在800～900nm范圍為更優(yōu)選，(A)的主波長(zhǎng)在540～670nm范圍，副波長(zhǎng)在800nm～850nm范圍，(B)的主波長(zhǎng)在540～750nm范圍、副波長(zhǎng)在800～850nm范圍為特別優(yōu)選。
(實(shí)施例1)此實(shí)施例是考察用四唑鎓化合物變性處理血球中的Hb，由其吸光度求出的Hb濃度與用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)HiCN法測(cè)定的Hb濃度的相關(guān)關(guān)系。以下，示出了使用的試樣、試劑和方法。
(試樣的調(diào)制)把所采集的正常的健康人和糖尿病患者的全血分別進(jìn)行離心分離(2000G，3min)，分離回收為血球和血漿。把前述血球與血漿按預(yù)定比例(血球∶血漿＝10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6)混合。然后，把這些混合液用0.4重量％的商品Triton X-100(和光純藥工業(yè)公司制造，下同)水溶液稀釋15倍(體積)，將其作為試樣，調(diào)制了合計(jì)45個(gè)試樣。
(標(biāo)準(zhǔn)液)把商品ヘモコンN(アズウエル公司制造)用2.4重量％商品Triton X-100水溶液溶解，把Hb濃度調(diào)制為預(yù)定濃度(0、50、100、200、300g/L)，來(lái)作為標(biāo)準(zhǔn)液。
(WST-3溶液下同)把作為四唑鎓化合物的下述式(7)所示2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓單鈉鹽(商品名WST-3，同仁化學(xué)研究所公司制造，下同)溶解在純凈水中，調(diào)制為濃度1.66mM。 (緩沖液)0.1mM CHES緩沖液(pH9.0)(測(cè)定方法)在把前述試樣用純凈水稀釋3倍所成的稀釋液25μL中混合前述CHES緩沖液15μL后，加入前述WST-3溶液45μL。把它在37℃下恒溫5min后，用生化自動(dòng)分析裝置(日本電子公司制造的JCA-BM8，下同)，測(cè)定主波長(zhǎng)596nm和副波長(zhǎng)884nm的吸光度。下面把此吸光度稱之為“WST-3法的吸光度”。還有，作為參比，用和光血紅蛋白試劑(ヘモグロビンテストワコ-)(商品名，和光純藥工業(yè)公司制造)由HiCN法測(cè)定Hb濃度。下面把此濃度稱之為“HiCN法的Hb濃度”。
另一方面，關(guān)于前述標(biāo)準(zhǔn)液用前述WST-3法測(cè)定的吸光度，制成表示前述吸光度與Hb濃度的關(guān)系的校正曲線。所得到的校正曲線以下式來(lái)表示y＝505.1x-6.1692yHb濃度(g/L)，xWST-3法的吸光度。
然后，把前述試樣的WST-3法的吸光度代入前述校正曲線，求出Hb濃度。

圖1示出了從此校正曲線所求出的Hb濃度和由HiCN法得到的前述試樣的Hb濃度的結(jié)果。
圖1表示出了從前述校正曲線求出的Hb濃度(g/L)與由HiCN法得到的濃度(g/L)的相關(guān)關(guān)系，所得到的相關(guān)式的斜率為0.9733，近于1，實(shí)施例1表明可以以與參比的HiCN法進(jìn)行的Hb測(cè)定同樣優(yōu)異的精度來(lái)測(cè)定Hb的濃度。還有，其相關(guān)系數(shù)為r＝0.9978，可知能穩(wěn)定地進(jìn)行高精度的測(cè)定。
(實(shí)施例2)此實(shí)施例是用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法測(cè)定Hb量，調(diào)查與用作為參比例的由SLS法測(cè)定的Hb量的相關(guān)關(guān)系。以下，示出了所使用的試樣、試劑、測(cè)定方法等。
(溶血試劑)TAPS(同仁化學(xué)公司制造)140mmol/L甘氨酰胺(ナカライテスク公司制造) 60mmol/L聚氧乙烯月桂醚(ナカライテスク公司制造)24g/L(第1試劑pH5.5)MES(同仁化學(xué)公司制造) 5mmol/LWST-3 2mmol/L疊氮鈉(ナカライテスク公司制造)0.05g/LCaCl2(ナカライテスク公司制造)5mmol/LNaCl(ナカライテスク公司制造) 150mmol/L金屬蛋白酶(商品名トヨチ-ム，東洋紡絲公司制造) 3g/L
(第2試劑pH6.9)FAOD(ア-クレイ公司制造) 26KU/LPOD(東洋紡社制造) 78KU/LDA-64(和光純藥工業(yè)公司制造) 0.052mmol/LTris-HCl(ナカライテスク公司制造) 200mmol/L(試樣)從糖尿病患者和正常健康人共71人身上分別采取全血，將其經(jīng)離心分離(1000G，10min)，回收血球成分。然后，在血球成分10μL中，加入前述溶血試劑40μL，調(diào)制溶血試樣(下同)。
(測(cè)定方法)在前述溶血試樣10μL中加入純凈水10μL，再加入前述第1試劑65μL，在37℃下恒溫(反應(yīng)液量85μL)。然后，在恒溫開(kāi)始后的4.5min之后，關(guān)于前述反應(yīng)液用前述生化自動(dòng)分析裝置測(cè)定在規(guī)定波長(zhǎng)(545nm、571nm、596nm、658nm、694nm、751nm)的吸光度。此測(cè)定值在下面稱之為“第1次測(cè)定值”。
接著，在恒溫開(kāi)始5min之后，在前述反應(yīng)液中加入前述第2試劑45μL，在37℃下恒溫3min(反應(yīng)液量130μL)。然后，關(guān)于該反應(yīng)液用前述裝置測(cè)定在前述規(guī)定波長(zhǎng)(545nm、571nm、596nm)的吸光度。此測(cè)定值在下面稱之為“第2次測(cè)定值”。
作為參比，用前述SLS法來(lái)進(jìn)行Hb的測(cè)定。首先，在與前述實(shí)施例2同樣的溶血試樣4μL中，加入純凈水4μL，再加入下述SLS法試劑100μL，在37℃下恒溫5min。然后，在恒溫開(kāi)始5min之后，用前述裝置測(cè)定在545nm的吸光度。
(SLS法試劑)SLS 0.64gTriton X-100 0.75g磷酸鉀緩沖液(pH7.2) 1.0L將對(duì)全部試樣(71個(gè)檢體)測(cè)定的實(shí)施例的第1次和第2次的吸光度以及SLS法的參比例的吸光度作圖(未圖示出)，求出實(shí)施例與參比例的相關(guān)系數(shù)。下面的表1示出了這些結(jié)果。
表1測(cè)定波長(zhǎng) 第1次的吸光度 第2次的吸光度測(cè)定的相關(guān)系數(shù)測(cè)定的相關(guān)系數(shù)545nm 0.993 0.993571nm 0.993 0.993596nm 0.993 0.989658nm 0.993 -694nm 0.993 -751nm 0.916 -如上述那樣，用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法，可進(jìn)行顯示出高達(dá)SLS法的相關(guān)關(guān)系的測(cè)定。還有，不僅是在用第1試劑來(lái)使Hb變性后立即測(cè)定，而且即使是在用前述第2試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)之后，仍可以準(zhǔn)確測(cè)定變性Hb。
(實(shí)施例3)本實(shí)施例是用本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法測(cè)定HbAlc％，調(diào)查與參比例之相關(guān)關(guān)系的例子。
與前述實(shí)施例2同樣，關(guān)于前述溶血試樣(71個(gè)檢體)進(jìn)行第1次的吸光度測(cè)定(測(cè)定波長(zhǎng)571nm)和第2次的吸光度測(cè)定(測(cè)定波長(zhǎng)751nm)。另一方面，使用Hb量和HbAlc量已知的標(biāo)準(zhǔn)試樣，制成了表示本發(fā)明的第1次的吸光度與已知Hb量的關(guān)系的校正曲線(Hb校正曲線)和表示本發(fā)明的第2次的吸光度與已知的HbAlc量的關(guān)系的校正曲線(HbAlc校正曲線)。
接著，把前述第1次吸光度代入前述Hb校正曲線，把第2次吸光度代入前述HbAlc校正曲線，分別求其Hb量和HbAlc量。然后，把所得到的Hb量和HbAlc量代入下式，求出HbAlc％。
HbAlc％＝(HbAlc量/Hb量)×100作為參比例，關(guān)于相同的溶血試樣(71個(gè)檢體)，用前述SLS法測(cè)定Hb量，用商品ラピデイアオ-トHbAlc(SRL公司制造)來(lái)測(cè)定HbAlc％。然后，分別求出相對(duì)于參比例的Hb濃度和HbAlc％的實(shí)施例的相關(guān)系數(shù)。
其結(jié)果是，Hb量的相關(guān)系數(shù)為0.994，HbAlc％的相關(guān)系數(shù)為0.9841，可知，本發(fā)明的Hb測(cè)定方法和Hb糖化率測(cè)定方法是精度非常高的方法。
(實(shí)施例4)此實(shí)施例是用本發(fā)明的Hb糖化率測(cè)定方法測(cè)定HbAlc％，調(diào)查與參比例的相關(guān)關(guān)系的例子。
與前面的實(shí)施例2一樣，關(guān)于前述溶血試樣(71個(gè)檢體)，進(jìn)行第1次吸光度測(cè)定和第2次吸光度測(cè)定(下面也稱為“修正前的吸光度”)。再者，第1次的吸光度測(cè)定時(shí)的測(cè)定波長(zhǎng)是596nm、658nm、694nm、751nm，此吸光度作為變性Hb的吸光度。還有，第2次的吸光度測(cè)定時(shí)的測(cè)定波長(zhǎng)是596nm、658nm、694nm和791nm。
如前所述，根據(jù)上述實(shí)施例3的結(jié)果，在751nm進(jìn)行第2次吸光度測(cè)定時(shí)的HbAlc％，相對(duì)于參比例的相關(guān)系數(shù)為0.9841，值相當(dāng)高。所以，證明了在進(jìn)行751nm下的吸光度測(cè)定時(shí)，可以以高精度測(cè)定HbAlc量。由此，以在751nm的第2次吸光度為基準(zhǔn)，求出了相對(duì)于它的各波長(zhǎng)下的第2次吸光度的相關(guān)系數(shù)。
進(jìn)而，對(duì)于上述第2次吸光度，用在各波長(zhǎng)的第1次吸光度，按下面的公式進(jìn)行修正(以下稱為“修正后的吸光度”)。然后，以在751nm下的修正后的吸光度為基準(zhǔn)，求出與此相對(duì)的在各波長(zhǎng)下的修正后的吸光度的相關(guān)關(guān)系。下面的表2示出了這些結(jié)果。
修正后的吸光度＝A2-(A1×85/130)A1第1次吸光度，A2第2次吸光度。
表2相關(guān)系數(shù)測(cè)定波長(zhǎng)修正前的吸光度 修正后的吸光度596nm - 0.9474658nm 0.9785 0.9998694nm 0.9998 1.0751nm 1.0 1.0從上面結(jié)果可知，在各波長(zhǎng)下，可看到高達(dá)751nm的吸光度的相關(guān)關(guān)系，通過(guò)再進(jìn)行修正更提高了相關(guān)系數(shù)。而且，從實(shí)施例2的結(jié)果可知，可以以高精度來(lái)進(jìn)行Hb濃度的測(cè)定。所以，從實(shí)施例2和本實(shí)施例4的結(jié)果可知，用本發(fā)明的糖化率測(cè)定方法，可以以高精度測(cè)定HbAlc％。還有，如果這樣地進(jìn)行修正，就可以在相同的測(cè)定波長(zhǎng)下來(lái)進(jìn)行變性Hb和糖化Hb的吸光度測(cè)定。如果是相同的測(cè)定波長(zhǎng)的話，那么例如測(cè)定裝置的條件的設(shè)定等也簡(jiǎn)單了，進(jìn)而也能夠簡(jiǎn)便且迅速的測(cè)定。
產(chǎn)業(yè)上的利用可能性如上述那樣，用本發(fā)明的Hb測(cè)定方法，可以在沒(méi)有環(huán)境問(wèn)題情況下容易且準(zhǔn)確測(cè)定試樣中的Hb。還有，在測(cè)定Hb的糖化率時(shí)，根據(jù)本發(fā)明的Hb測(cè)定方法，即使用四唑鎓化合物處理試樣，前述四唑鎓化合物對(duì)利用了氧化還原反應(yīng)的糖化量的測(cè)定也沒(méi)有影響。為此，可以以一連串的操作簡(jiǎn)便且高精度地進(jìn)行Hb量測(cè)定和糖化量測(cè)定。為此，如果把利用了本發(fā)明的Hb測(cè)定方法的Hb糖化率測(cè)定方法適用于，例如，臨床檢查領(lǐng)域等，就進(jìn)一步提高了糖化Hb的作為糖尿病診斷等的指標(biāo)物質(zhì)的可靠性和重要性。
權(quán)利要求
1.一種血紅蛋白的測(cè)定方法，其特征在于，用四唑鎓化合物使試樣中的血紅蛋白變性，在對(duì)得到的變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量，從此光學(xué)變化量算出前述試樣中的血紅蛋白量。
2.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，光學(xué)變化量是吸光度或反射率。
3.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，測(cè)定波長(zhǎng)在440～700nm的范圍。
4.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，四唑鎓化合物在四唑環(huán)的至少2個(gè)位置上有環(huán)結(jié)構(gòu)取代基。
5.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，四唑鎓化合物在四唑環(huán)的2位和3位有苯環(huán)，前述苯環(huán)中的至少1個(gè)有從鹵基、羧基、硝基、羥基、磺基、甲氧基和乙氧基中選出的至少1個(gè)官能團(tuán)。
6.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，四唑鎓化合物是2-(4-碘代苯基)-3-(2，4-二硝基苯基)-5-(2，4-二磺苯基)-2H-四唑鎓鹽。
7.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，相對(duì)于每1μL試樣添加0.001～100μmol范圍的四唑鎓化合物。
8.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，在表面活性劑存在下，用四唑鎓化合物處理前述試樣中的血紅蛋白。
9.權(quán)利要求8中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，表面活性劑是聚氧乙烯醚。
10.權(quán)利要求8中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，相對(duì)于1mol四唑鎓化合物添加0.01～70mol表面活性劑。
11.權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法，其中，試樣含有紅血球。
12.一種血紅蛋白糖化率的測(cè)定方法，其特征在于，對(duì)含有糖化血紅蛋白的試樣用權(quán)利要求1中所述的血紅蛋白測(cè)定方法測(cè)定血紅蛋白量，另外使所得到的變性血紅蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定此氧化還原反應(yīng)來(lái)測(cè)定血紅蛋白的糖化量，由前述血紅蛋白量和前述糖化量來(lái)求出血紅蛋白糖化率。
13.權(quán)利要求12中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，在使變性血紅蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)之前，用蛋白酶處理前述變性血紅蛋白。
14.權(quán)利要求12中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，在對(duì)變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量之后，使前述變性血紅蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)。
15.權(quán)利要求14中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，在對(duì)變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量之后，用蛋白酶處理前述變性血紅蛋白，再使前述變性血紅蛋白分解物的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)。
16.權(quán)利要求14中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，用蛋白酶處理變性血紅蛋白，在對(duì)前述變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量之后，再使前述變性血紅蛋白分解物的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)。
17.權(quán)利要求12中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，使前述變性血紅蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶反應(yīng)之后，進(jìn)行在對(duì)前述變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下的前述試樣的光學(xué)變化量測(cè)定和前述氧化還原反應(yīng)的測(cè)定。
18.權(quán)利要求12中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其中，前述氧化還原反應(yīng)的測(cè)定是由此所產(chǎn)生的顯色物質(zhì)的光學(xué)變化量的測(cè)定。
19.權(quán)利要求18中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其特征在于，前述顯色物質(zhì)的光學(xué)變化量與通過(guò)變性血紅蛋白的糖化部分和果糖基氨基酸氧化酶的反應(yīng)而生成的過(guò)氧化氫量對(duì)應(yīng)。
20.權(quán)利要求19中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其中，前述顯色物質(zhì)是使用氧化酶通過(guò)使過(guò)氧化氫和通過(guò)氧化而顯色的基質(zhì)反應(yīng)而顯色的前述基質(zhì)。
21.權(quán)利要求18中所述的測(cè)定方法，其中，顯色物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)是650～900nm。
22.權(quán)利要求18中所述的血紅蛋白糖化率測(cè)定方法，其中，用于測(cè)定血紅蛋白量的測(cè)定波長(zhǎng)和顯色物質(zhì)的測(cè)定波長(zhǎng)是同一波長(zhǎng)。
全文摘要
提供沒(méi)有環(huán)境上的問(wèn)題、能夠容易且準(zhǔn)確測(cè)定試料中的血紅蛋白量的Hb量測(cè)定方法。用四唑鎓化合物使試樣中的血紅蛋白變性，在對(duì)所得到的變性血紅蛋白特異的吸收波長(zhǎng)下測(cè)定前述試樣的光學(xué)變化量，就可以從此光學(xué)變化量算出前述試樣的血紅蛋白量。前述測(cè)定波長(zhǎng)在520nm～670nm的范圍為好。由此方法可以如圖1所示那樣以高精度測(cè)定Hb量。
文檔編號(hào)G01N33/72GK1466684SQ01816508
公開(kāi)日2004年1月7日 申請(qǐng)日期2001年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2000年9月28日
發(fā)明者米原聰, 八木雄次, 次 申請(qǐng)人:愛(ài)科來(lái)株式會(huì)社