助下清洗未聚合的多巴胺單體。隨后，用200mM EDTA-Na反復(fù)清洗磁性顆粒，使Ni2+洗脫下來，進(jìn)而使螯合于其上的模板肽段得以洗脫，直至高效液相色譜(日立高新chromaster, 10*4.6mm,C18柱)檢測不出洗脫液中的模板分子,真空干燥,得到白蛋白抗原決定基分子印跡材料(MIP)。
[0030]用相同的方法，但不加模板分子，制備得到非印跡材料(NIP)。
[0031]如圖1，MIP, NIP大小均勻、分散性好，為200_300nm，這為顆粒提供了很大的比表面積，進(jìn)而具有較高的吸附容量。同時(shí)，MIP和NIP外表面印跡殼層約厚4nm，這降低了印跡位點(diǎn)的傳質(zhì)阻力，使目標(biāo)蛋白及肽段能夠在短時(shí)間內(nèi)進(jìn)入識(shí)別位點(diǎn)，達(dá)到吸附平衡。
[0032](2)白蛋白抗原決定基印跡材料對(duì)抗原決定基肽段及其目標(biāo)蛋白的識(shí)別性能考察
[0033]白蛋白抗原決定基材料對(duì)人血清白蛋白抗原決定基肽段的識(shí)別在25°C，水相中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中，0.4mg上述制備的分子印跡材料或非印跡材料分別于0.3ml,0.05mg/ml的白蛋白抗原決定基中孵育3h，去孵育上清，高效液相色譜(日立高新chromaster, 10*4.6mm, C18柱)峰面積定量法檢測其中抗原決定基的濃度，進(jìn)而計(jì)算得到吸附容量。如圖2 (a), MIP對(duì)白蛋白抗原決定基的識(shí)別因子能夠達(dá)到4.3，對(duì)模板分子的吸附容量可以達(dá)到3.1lmg/g，對(duì)比MIP與NIP對(duì)抗原決定基的吸附容量計(jì)算得到印跡材料的模板利用率，模板利用率近100%。說明通過此法制備的印跡材料表面具有完整的識(shí)別位點(diǎn)，可對(duì)抗原決定基肽段進(jìn)行良好的識(shí)別。
[0034]白蛋白抗原決定基材料對(duì)人血清白蛋白的識(shí)別在25°C，水相中進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)中，0.4mg分子印跡材料或非印跡材料分別與0.3ml,0.3mg/ml的白蛋白抗原決定基孵育3h,取孵育上清，高效液相色譜(日立高新chromaster, 10*4.6mm,C8柱)峰面積定量法檢測其中白蛋白的濃度。如圖2(b)，MIP人血清白蛋白的識(shí)別因子為2.2，對(duì)白蛋白的吸附容量可達(dá)51.7mg/g，這說明抗原決定基形成的印跡位點(diǎn)也能對(duì)目標(biāo)蛋白有明顯的識(shí)別效果。同時(shí)，對(duì)比印跡材料和非印跡材料的吸附容量計(jì)算得到識(shí)別目標(biāo)蛋白過程中的模板利用率為15%，而用非共價(jià)固定模板的方法所得的材料識(shí)別蛋白的模板利用率不到2% ;這說明，通過表面定向固定模板在基質(zhì)材料表面形成了表面印跡位點(diǎn)，通過控制殼層厚度使這些印跡位點(diǎn)充分暴露，使位點(diǎn)最大限度的用于目標(biāo)蛋白的識(shí)別，充分體現(xiàn)了共價(jià)定向固定模板的優(yōu)勢。
[0035](3)白蛋白抗原決定基印跡材料對(duì)目標(biāo)蛋白的選擇性
[0036]0.4mg上述制備的分子印跡材料或非印跡材料分別與0.3ml,0.5mg/ml的人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、細(xì)胞色素c (Cyc)孵育3h，取孵育上清，高效液相色譜(日立高新chromaster, 10*4.6mm,C8柱)峰面積定量法檢測其中各蛋白的濃度。如圖3所示，材料對(duì)HSA，BSA, Cyc的識(shí)別系數(shù)分別為1.57，1.45，1.11，對(duì)目標(biāo)蛋白HSA的識(shí)別能力最強(qiáng)。值得一提的是，相對(duì)于BSA，材料能更好的識(shí)別HSA，這對(duì)傳統(tǒng)的完整蛋白而言是很難實(shí)現(xiàn)的，充分體現(xiàn)了抗原決定基分子印跡材料較蛋白質(zhì)分子印跡材料的識(shí)別優(yōu)勢。
[0037]⑷實(shí)施例2
[0038]按模板與基質(zhì)材料質(zhì)量比為40:1000進(jìn)行模板固載，其他同實(shí)施例1可得MIP2及NIP2，其對(duì)人血清白蛋白抗原決定基的吸附容量如圖4所示。
[0039](5)實(shí)施例 3
[0040]按模板與基質(zhì)材料質(zhì)量比為2.5:1000進(jìn)行模板固載，其他同實(shí)施例1可得MIP3及NIP3，其對(duì)人血清白蛋白抗原決定基的吸附容量如圖5所示。
[0041](6)實(shí)施例 4
[0042]按功能單體與基質(zhì)材料質(zhì)量比為0.5:1加入功能單體進(jìn)行聚合，其他同實(shí)施例1可得MIP4及NIP4，其對(duì)人血清白蛋白的吸附容量如圖6所示。
[0043](7)實(shí)施例 5
[0044]按功能單體與基質(zhì)材料質(zhì)量比為0.2:1加入功能單體進(jìn)行聚合，其他同實(shí)施例1可得MIP5及NIP5，其對(duì)人血清白蛋白的吸附容量如圖7所示。
[0045](8)實(shí)施例 6
[0046]以甲基丙烯酸(MAA)、亞甲基雙丙烯酰胺(MBA)為單體，利用MAA、MBA與氨基硅球表面的靜電相互作用將雙鍵修飾于硅基質(zhì)顆粒表面，以N-(4-乙烯基)_苯甲基亞胺基雙乙酸(VBIDA)為連接臂在基質(zhì)顆粒表面修飾金屬離子Ni2+，按實(shí)施例1所述方法對(duì)修飾了組氨酸標(biāo)簽的模板肽段進(jìn)行固定，分別以MAA、MBA為功能單體，偶氮二異丁腈(AIBN)為引發(fā)齊IJ，通過熱引發(fā)進(jìn)行聚合；之后利用200mM EDTA-Na進(jìn)行模板去除，分別得MIP6及NIP6。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡材料，其特征在于: 利用組氨酸標(biāo)簽為連接臂將模板固定于基質(zhì)材料上，通過功能單體聚合，再洗脫模板分子，形成印跡位點(diǎn)，制備得到蛋白質(zhì)抗原決定基印跡材料； 所述模板為目標(biāo)蛋白的抗原決定基肽段； 所述組氨酸標(biāo)簽為一段連續(xù)的組氨酸段。2.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡材料，其特征在于: 所述模板分子為目標(biāo)蛋白的抗原決定基肽段，即為目標(biāo)蛋白序列上連續(xù)的2-40個(gè)氨基酸序列，或者蛋白質(zhì)上天然存在的抗原決定基肽段序列； 所述組氨酸標(biāo)簽為2-15個(gè)連續(xù)的組氨酸，通過多肽化學(xué)合成的方法修飾于模板肽段的羧基端或者氨基端； 所述目標(biāo)蛋白為自然界存在的所有蛋白質(zhì)。3.如權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)抗原決定基分子印跡材料，其特征在于: 所述基質(zhì)材料為表面通過金屬螯合方式固載金屬離子Ni2+的硅基質(zhì)材料或者聚合物基質(zhì)材料；功能單體是指，可聚合形成聚合物的單體。4.一種權(quán)利要求1、2或3所述抗原決定基分子印跡材料的制備方法，其特征在于:將末端修飾了組氨酸標(biāo)簽的模板通過金屬螯合作用固定于表面修飾了 Ni2+的基質(zhì)材料表面，通過功能單體的聚合反應(yīng)在基質(zhì)材料表面形成聚合物層；隨后利用乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na)溶液競爭性洗脫Ni2+，從而使固定于其上的模板分子得以洗脫，形成印跡位點(diǎn)，得到分子印跡材料。5.按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于: 模板固定方法:將末端修飾了組氨酸標(biāo)簽的模板按模板:基質(zhì)材料的質(zhì)量比1:1000-100:1000加入基質(zhì)材料的懸浮液中，室溫下孵育。6.按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于: 功能單體聚合:將功能單體加入固載了模板的基質(zhì)材料懸浮液中，預(yù)組裝后，加入引發(fā)齊U，攪拌條件下進(jìn)行聚合。7.按照權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于: 所述的EDTA-Na溶液是指濃度為20mM_lM的EDTA-Na水溶液。8.—種權(quán)利要求1、2或3所述的抗原決定基印跡材料用于目標(biāo)蛋白抗原決定基肽段或其所對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白的選擇性識(shí)別。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種可對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行選擇性識(shí)別的抗原決定基分子印跡材料及其制備過程。所述的分子印跡材料是利用目標(biāo)蛋白所對(duì)應(yīng)的一段特異性肽段為模板分子，利用組氨酸標(biāo)簽為連接臂將其固定于基質(zhì)材料上，通過功能單體在基質(zhì)材料上進(jìn)行聚合而制備得到，并將該印跡材料用于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的選擇性識(shí)別中。
【IPC分類】C08J9/26, B01J20/30, C04B41/48, C08J7/16, G01N33/68, B01J20/26, C08J7/12
【公開號(hào)】CN104941602
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410119209
【發(fā)明人】張麗華, 李森武, 楊開廣, 李沁然, 張玉奎
【申請(qǐng)人】中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所
【公開日】2015年9月30日
【申請(qǐng)日】2014年3月27日