本發(fā)明涉及一種基于磁性微球的抗體分離的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：
抗體是一類重要的生物大分子，能特異性識(shí)別相應(yīng)的抗原。目前，抗體已經(jīng)廣泛應(yīng)用于疾病治療、體外診斷和檢測(cè)、腫瘤定位顯像和生物分離等領(lǐng)域。無論是從血液、腹水、初乳還是從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離抗體，通常需要通過離心或者過濾等方法去除料液中的細(xì)胞和固體雜質(zhì)顆粒，再結(jié)合親和層析等步驟進(jìn)行純化。整個(gè)過程步驟多，操作繁瑣，同時(shí)親和層析填料存在配基易脫落和價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。因此，亟待開發(fā)更為經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離技術(shù)。疏水性電荷誘導(dǎo)層析(Hydrophobicchargeinductionchromatography，HCIC)，通過疏水作用力吸附蛋白，并通過調(diào)節(jié)溶液pH使得蛋白和配基產(chǎn)生靜電排斥來協(xié)助蛋白洗脫(J.Chromatogr.A，1998，814：71)，在抗體分離中顯示出良好的應(yīng)用前景。Guerrier等人(Bioseparation2000，9：211)報(bào)道了以巰基雜環(huán)化合物為相關(guān)HCIC功能配基進(jìn)行抗體吸附分離，專利(USPatent5,652,348)描述了相關(guān)介質(zhì)及其制備方法。專利(CN101279243；CN101279244；CN101284224)報(bào)道了在含碳化鎢的纖維素微球上偶聯(lián)HCIC配基制備擴(kuò)張床介質(zhì)，采用擴(kuò)張床模式分離抗體。此外，專利(CN104096544A；CN104117345A)公開了以氨基苯并咪唑?yàn)楣δ芑鶊F(tuán)的HCIC層析介質(zhì)的制備方法，并引入第二個(gè)官能基團(tuán)進(jìn)一步提高抗體的選擇性。以上研究的研究重點(diǎn)在于HCIC功能配基的設(shè)計(jì)和改造，仍然將層析基質(zhì)作為偶聯(lián)載體，以層析方式進(jìn)行蛋白分離。層析過程對(duì)原料液的澄清度有較高的要求，料液中存在的固體雜質(zhì)顆粒(細(xì)胞及細(xì)胞碎片或培養(yǎng)基組分等)容易堵塞床層。因此，在實(shí)際層析分離過程，需要對(duì)原料進(jìn)行離心過濾等步驟去除相關(guān)固體雜質(zhì)。盡管擴(kuò)張床模式也可以避免對(duì)料液進(jìn)行固體顆粒的去除步驟，但是擴(kuò)張床模式操作復(fù)雜，對(duì)設(shè)備和工藝參數(shù)控制要求高。因此，開發(fā)更為簡便的抗體分離新方法，對(duì)于提高抗體分離效率具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種基于磁性微球的抗體分離的方法。所述的一種基于磁性微球的抗體分離的方法包括以下步驟：1)按照質(zhì)量比2∶1∶1∶50分別稱取瓊脂糖、納米四氧化三鐵、氯化鈉和去離子水，超聲混合并加熱融化瓊脂糖，制得水相；2)按照質(zhì)量比5∶30∶1稱取水相、真空泵油和聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯80(吐溫80)混合，70℃下高速攪拌進(jìn)行乳化2小時(shí)，置于冰水浴中降溫，收集微球；3)按照質(zhì)量比2∶2∶1稱取微球、1M的氫氧化鈉和環(huán)氧氯丙烷混合，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，添加0.1倍微球質(zhì)量的硼氫化鈉，室溫振蕩反應(yīng)8小時(shí)，得到交聯(lián)的磁性微球；4)按照質(zhì)量比2∶2∶1∶1稱取微球、去離子水、烯丙基溴和氫氧化鈉，室溫振蕩活化24小時(shí)，水洗，加入1倍微球質(zhì)量的N-溴代丁二酰亞胺及3倍微球質(zhì)量的去離子水，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，水洗得到活化的磁性微球；5)按照質(zhì)量比2∶1∶3稱取活化的磁性微球、4-氨基吲哚以及0.1M碳酸鈉緩沖液(pH12)，室溫振蕩8小時(shí)，水洗，加入2倍微球質(zhì)量的乙醇胺中，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，得到偶聯(lián)有4-氨基吲哚的磁性微球。6)將微球與pH6-8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉平衡緩沖液在具塞三角瓶中振蕩混合，進(jìn)行預(yù)平衡，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液；7)按照每克微球加入10-100ml細(xì)胞液比例加入細(xì)胞液，振蕩混合10-20分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉細(xì)胞液；8)按照每克微球加入20ml平衡緩沖液比例加平衡緩沖液，振蕩混合1-5分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，完成微球的沖洗；9)按照每克微球加入10ml緩沖液比例加入pH3-5的檸檬酸鈉緩沖液作為解吸緩沖液，振蕩混合3-5分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸緩沖液，得到抗體溶液。所述的基質(zhì)為包裹納米四氧化三鐵的多孔瓊脂糖微球，配基為經(jīng)烯丙基溴活化后偶聯(lián)的4-氨基吲哚。所述的新型磁性微球的配基密度為100-200μmol/ml。本發(fā)明研制的以4-氨基吲哚為功能配基的磁性微球同時(shí)具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)和磁性響應(yīng)特點(diǎn)，可以用于抗體的高效分離。磁性微球的疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)使得其抗體吸附容量大，耐鹽吸附，洗脫只需通過調(diào)節(jié)溶液pH至弱酸即可實(shí)現(xiàn)。磁性響應(yīng)特點(diǎn)使得微球可以通過外加磁場(chǎng)的施加實(shí)現(xiàn)微球與料液的快速分離，尤其在料液中含有細(xì)胞或其他固體雜質(zhì)時(shí)。因此，采用具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的磁性微球可以從各種的復(fù)雜的料液中直接分離抗體，減少了離心過濾以及調(diào)節(jié)料液離子強(qiáng)度等步驟，極大地提高抗體分離的效率。此外，微球的性質(zhì)穩(wěn)定、配基結(jié)合牢固、清洗再生方便。附圖說明附圖1是本發(fā)明制備的具有疏水性電荷誘導(dǎo)效應(yīng)的新型磁性微球的光學(xué)顯微鏡照片，圖2是本發(fā)明直接從細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體的電泳譜圖。具體實(shí)施方式以下通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的描述：實(shí)施例1稱取2g瓊脂糖、1g納米四氧化三鐵、1g氯化鈉和50g去離子水，超聲混合并加熱融化瓊脂糖，制得水相；將水相與324g的真空泵油以及10.8g的吐溫80混合，70℃下高速攪拌進(jìn)行乳化2小時(shí)，乳化結(jié)束后置于冰水浴中降溫，收集微球；取10g微球與10g1M的氫氧化鈉以及2g環(huán)氧氯丙烷混合，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，隨后添加1g硼氫化鈉，室溫振蕩反應(yīng)8小時(shí)，得到交聯(lián)的磁性微球基質(zhì)；稱取10g交聯(lián)的磁性微球，加入10g去離子水、5g烯丙基溴和5g氫氧化鈉，室溫振蕩活化24小時(shí)，水洗，5gN-溴代丁二酰亞胺和30g去離子水，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸鈉緩沖液(pH12)混合，室溫振蕩8小時(shí)，水洗，加入20g乙醇胺，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，得到偶聯(lián)有4-氨基吲哚的磁性微球。稱取4-氨基吲哚的磁性微球10g與100mlpH6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉平衡緩沖液在具塞三角瓶中振蕩混合，進(jìn)行預(yù)平衡，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，加入100ml單抗細(xì)胞液，振蕩混合10分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉細(xì)胞液；加入200ml平衡緩沖液，振蕩混合1分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，完成微球的沖洗；加入100ml緩沖液比例加入pH3的檸檬酸鈉緩沖液作為解吸緩沖液，振蕩混合3分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸緩沖液，得到抗體溶液，純度為98.1％。實(shí)施例2稱取2g瓊脂糖、1g納米四氧化三鐵、1g氯化鈉和50g去離子水，超聲混合并加熱融化瓊脂糖，制得水相；將水相與324g的真空泵油以及10.8g的吐溫80混合，70℃下高速攪拌進(jìn)行乳化2小時(shí)，乳化結(jié)束后置于冰水浴中降溫，收集微球；取10g微球與10g1M的氫氧化鈉以及2g環(huán)氧氯丙烷混合，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，隨后添加1g硼氫化鈉，室溫振蕩反應(yīng)8小時(shí)，得到交聯(lián)的磁性微球基質(zhì)；稱取10g交聯(lián)的磁性微球，加入10g去離子水、5g烯丙基溴和5g氫氧化鈉，室溫振蕩活化24小時(shí)，水洗，5gN-溴代丁二酰亞胺和30g去離子水，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸鈉緩沖液(pH12)混合，室溫振蕩8小時(shí)，水洗，加入20g乙醇胺，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，得到偶聯(lián)有4-氨基吲哚的磁性微球。稱取4-氨基吲哚的磁性微球10g與100mlpH8的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉平衡緩沖液在具塞三角瓶中振蕩混合，進(jìn)行預(yù)平衡，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，加入1000ml單抗細(xì)胞液，振蕩混合20分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉細(xì)胞液；加入200ml平衡緩沖液，振蕩混合5分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，完成微球的沖洗；加入100ml緩沖液比例加入pH5的檸檬酸鈉緩沖液作為解吸緩沖液，振蕩混合5分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸緩沖液，得到抗體溶液，純度為99.2％。實(shí)施例3稱取2g瓊脂糖、1g納米四氧化三鐵、1g氯化鈉和50g去離子水，超聲混合并加熱融化瓊脂糖，制得水相；將水相與324g的真空泵油以及10.8g的吐溫80混合，70℃下高速攪拌進(jìn)行乳化2小時(shí)，乳化結(jié)束后置于冰水浴中降溫，收集微球；取10g微球與10g1M的氫氧化鈉以及2g環(huán)氧氯丙烷混合，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，隨后添加1g硼氫化鈉，室溫振蕩反應(yīng)8小時(shí)，得到交聯(lián)的磁性微球基質(zhì)；稱取10g交聯(lián)的磁性微球，加入10g去離子水、5g烯丙基溴和5g氫氧化鈉，室溫振蕩活化24小時(shí)，水洗，5gN-溴代丁二酰亞胺和30g去離子水，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸鈉緩沖液(pH12)混合，室溫振蕩8小時(shí)，水洗，加入20g乙醇胺，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，得到偶聯(lián)有4-氨基吲哚的磁性微球。稱取4-氨基吲哚的磁性微球10g與100mlpH6的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉平衡緩沖液在具塞三角瓶中振蕩混合，進(jìn)行預(yù)平衡，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，加入500ml單抗細(xì)胞液，振蕩混合15分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉細(xì)胞液；加入200ml平衡緩沖液，振蕩混合3分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，完成微球的沖洗；加入100ml緩沖液比例加入pH4的檸檬酸鈉緩沖液作為解吸緩沖液，振蕩混合4分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸緩沖液，得到抗體溶液，純度為98.5％。實(shí)施例4稱取2g瓊脂糖、1g納米四氧化三鐵、1g氯化鈉和50g去離子水，超聲混合并加熱融化瓊脂糖，制得水相；將水相與324g的真空泵油以及10.8g的吐溫80混合，70℃下高速攪拌進(jìn)行乳化2小時(shí)，乳化結(jié)束后置于冰水浴中降溫，收集微球；取10g微球與10g1M的氫氧化鈉以及2g環(huán)氧氯丙烷混合，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，隨后添加1g硼氫化鈉，室溫振蕩反應(yīng)8小時(shí)，得到交聯(lián)的磁性微球基質(zhì)；稱取10g交聯(lián)的磁性微球，加入10g去離子水、5g烯丙基溴和5g氫氧化鈉，室溫振蕩活化24小時(shí)，水洗，5gN-溴代丁二酰亞胺和30g去離子水，室溫振蕩反應(yīng)1小時(shí)，水洗得到活化的磁性微球；加入5g4-氨基吲哚以及15g0.1M碳酸鈉緩沖液(pH12)混合，室溫振蕩8小時(shí)，水洗，加入20g乙醇胺，室溫振蕩反應(yīng)2小時(shí)，得到偶聯(lián)有4-氨基吲哚的磁性微球。稱取4-氨基吲哚的磁性微球10g與100mlpH7的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉平衡緩沖液在具塞三角瓶中振蕩混合，進(jìn)行預(yù)平衡，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，加入200ml單抗細(xì)胞液，振蕩混合10分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉細(xì)胞液；加入200ml平衡緩沖液，振蕩混合1分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，傾倒掉平衡緩沖液，完成微球的沖洗；加入100ml緩沖液比例加入pH4.5的檸檬酸鈉緩沖液作為解吸緩沖液，振蕩混合3分鐘，用磁鐵在三角瓶外壁吸住微球，收集解吸緩沖液，得到抗體溶液，純度為98.9％。