專利名稱：針對犬埃利希體的疫苗和相關方法
技術領域：
本發(fā)明涉及針對由細菌犬埃利希體can is)引起的犬單核細胞埃利希病(CME)的免疫原性組合物和疫苗及相關方法。背景
犬單核細胞埃利希病(CME)是由細菌犬埃利希體(犬埃利希體，疋can is)引起的在狗中的嚴重立克次體病。犬埃利希體經(jīng)由褐色犬蜱(血紅扇頭蜱{Rhipic印halussanguineus))從狗傳播到狗。在感染后2 - 3周的培養(yǎng)期后,狗可以通過疾病的急性、亞臨床和慢性期進展。在急性期中，臨床體征范圍為輕度到重度血小板減少癥、白血球減少癥、貧血、嗜睡和重量減輕。在兩個月后，大多數(shù)狗將進入持續(xù)數(shù)月或數(shù)年的亞臨床期，在這個過程中低血壓值可能持續(xù)，但臨床體征是最低的。小百分比的受感染狗可能發(fā)展稱為熱帶犬全血細胞減少癥(TCP)的嚴重形式的疾病。持續(xù)骨髓抑制、出血、神經(jīng)學紊亂、外周性水腫、和嚴重重量減輕是TCP的特征。可能發(fā)展低血壓休克，導致死亡。盡管迄今為止有針對犬埃利希體的免疫原性組合物的報道[參見例如，Mahan等人，Onderstepoort J.Vet.Res.72(2) =119-128(2005) ；US 2006/0188524A1]，但仍未出現(xiàn)針對犬埃利希體的有效疫苗的證實。因此，存在保護免于CME和/或TCP的疫苗的需要。本文任何參考文獻的引用不應解釋為此類參考文獻可用作本申請的“現(xiàn)有技術”的承認。發(fā)明概沭
本發(fā)明提供了促進針對埃利希病的原因的保護性免疫應答的疫苗和/或免疫原性組合物。在某些實施方案中，疫苗組合物和/或免疫原性組合物包含這樣的試劑，當作為初次疫苗施用于受試者時，其在受試者中引發(fā)最低的(如果存在的話)體液免疫應答。在特定實施方案中，免疫原性組合物包含這樣的試劑，當作為初次疫苗施用時，其在受試者中引發(fā)最低的(如果存在的話)體液免疫應答，但仍引發(fā)保護性免疫應答。一個此類實施方案是包含滅活的在狗骨髓細胞系上生長的犬埃利希體的疫苗。在這個類型的特定實施方案中，疫苗可以進一步包含佐劑。在這個類型的某些實施方案中，佐劑是索狀因子。在更特定的實施方案中，索狀因子佐劑溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中。在一個方面，本發(fā)明提供了包含來自犬埃利希體的抗原的疫苗組合物和/或免疫原性組合物，其在初始施用于受試者(例如作為初次疫苗)后，不引發(fā)針對抗原的顯著抗體的產(chǎn)生。相應地，本發(fā)明的某些實施方案包括免疫原性組合物和/或疫苗組合物，其包含有效免疫量的來自犬埃利希體的抗原，其中組合物對于受試者的初始施用/初次疫苗引發(fā)最低的體液應答。在特定實施方案中，本發(fā)明提供了免疫原性組合物和/或疫苗，其在初始施用/初次接種疫苗后不引發(fā)可測量的體液應答， 而是在受試者中引發(fā)保護性免疫應答。在某些實施方案中，在初次接種疫苗/初始施用中的本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物引發(fā)細胞免疫應答，同時引發(fā)最低和/或無法測量的(例如無法檢測的)體液應答。因此，在相關方面，本發(fā)明提供了包含有效免疫量的來自犬埃利希體的抗原的疫苗組合物。在這個類型的某些實施方案中，當疫苗作為初次疫苗施用時，抗原在受試者中引發(fā)保護性免疫應答，但引發(fā)最低的體液應答。本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物可以包含如本文公開的由在細胞上生長和/或傳代的犬埃利希體生成的抗原。在某些實施方案中，犬埃利希體在犬細胞系上生長和/或傳代。在更特定的實施方案中，細胞系可以是狗骨髓細胞系。在更特定的實施方案中，細胞具有ATCC登記號PTA-10545，和/或是具備具有ATCC登記號PTA-10545的細胞的一種或多種和/或所有鑒定特征的細胞。在特定實施方案中，犬埃利希體抗原是具有ATCC登記號PTA-10546的細胞相關犬埃利希體，和/或具備具有ATCC登記號PTA-10546的細胞相關犬埃利希體的一種或多種和/或所有鑒定特征的細胞相關犬埃利希體。本發(fā)明進一步提供了具有ATCC登記號PTA-10546的細胞相關犬埃利希體。本發(fā)明還提供了具備具有ATCC登記號PTA-10546的細胞相關犬埃利希體的一種或多種和/或所有鑒定特征的細胞相關犬埃利希體。此外，本發(fā)明提供了具有ATCC登記號PTA-10545的細胞。本發(fā)明進一步提供了具備具有ATCC登記號PTA-10545的細胞的一種或多種和/或所有鑒定特征的細胞。此外，本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物的犬埃利希體抗原可以是滅活的。在某些實施方案中，滅活的犬埃利希體抗原是用福爾馬林滅活的。在另一個方面，本發(fā)明提供了包含佐劑的疫苗和/或免疫原性組合物。在這個類型的某些實施方案中，佐劑是親脂佐劑。在某些實施方案中，親脂佐劑在非極性溶劑內(nèi)。在特定實施方案中，本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗包含抗原，其可以與疏水佐劑組合且制成與由疫苗和/或免疫原性組合物包含的極性溶劑系統(tǒng)易混合的。在更特定的實施方案中，佐劑包含索狀因子如海藻糖6，6' - 二霉菌酸酯。在特定實施方案中，海藻糖6,6/ -二霉菌酸酯在非 極性溶劑內(nèi)。在更特定的實施方案中，佐劑包含在氯仿溶劑系統(tǒng)內(nèi)溶解的海藻糖6，6' - 二霉菌酸酯。在特定實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約65-95%氯仿體積/體積。在更特定的實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約80-95%氯仿體積/體積。在特定實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約5.0-30%甲醇體積/體積。在更特定的實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約7.5-15%甲醇體積/體積。在特定實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約0.5-5.0%水體積/體積。在更特定的實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約0.75-2.5%水體積/體積。在某些實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)分別包含約90%氯仿:10%甲醇:1.0%水體積/體積。在特定實施方案中，疫苗和/或免疫原性組合物包含福爾馬林滅活的在具有ATCC登記號PTA-10545的保藏細胞中生長的細胞相關犬埃利希體和包含溶解于90:10:1氯仿:甲醇:水中的海藻糖6，6' - 二霉菌酸酯的佐劑。包含溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中的索狀因子如海藻糖6，6' - 二霉菌酸酯的組合物也是本發(fā)明的部分，如其作為佐劑的用途一樣。此外，本發(fā)明提供了在特別適合于其生長的細胞和/或細胞系上生長的犬埃利希體細菌。本發(fā)明進一步提供了用于生產(chǎn)用于本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物的抗原的方法。因此，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)犬埃利希體抗原的方法。在特定實施方案中，犬埃利希體在巨噬細胞上生長。在某些實施方案中，犬埃利希體細菌在巨噬細胞樣細胞系上生長。在某些實施方案中，犬埃利希體在狗骨髓(DBM)細胞上生長，以生產(chǎn)細胞相關犬埃利希體抗原。在特定實施方案中，犬埃利希體細菌在DBM細胞系上生長。在特定實施方案中，DBM細胞系是DBM(WCS)MCS+12，ATCC登記號PTA-10545。在特定實施方案中，犬埃利希體是細胞相關的，WS MS+3，19517-001，ATCC登記號PTA 10546。在可替換的實施方案中，犬埃利希體在DH-82細胞系上生長。本發(fā)明的犬埃利希體抗原可以是滅活的犬埃利希體。在特定實施方案中，犬埃利希體抗原是菌苗。在某些實施方案中，滅活的犬埃利希體抗原是細胞相關的。本發(fā)明還提供了針對犬埃利希體免疫受試者的方法。此類方法可以包括給受試者施用本發(fā)明的疫苗組合物和/或免疫原性組合物。某些實施方案包含給受試者皮內(nèi)施用本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物。另一種此類方法包括給受試者皮下施用本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物。另外一種此類方法包括給受試者經(jīng)口施用本發(fā)明的疫苗和/或免疫原性組合物。在這個類型的特定實施方案中，動物受試者是犬。在另一個實施方案中，動物受試者是貓(例如家貓)。在特定實施方案中，提供疫苗組合物和/或免疫原性組合物的第二個劑量作為加強劑量。在某些實施方案中，加強劑量在疫苗組合物的初始劑量后約21天施用。本發(fā)明進一步提供了制備本發(fā)明的疫苗組合物和/或免疫原性組合物的方法。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了用于生產(chǎn)如本文描述的犬埃利希體抗原的方法。所述疫苗組合物和/或免疫原性組合物通過將本發(fā)明的抗原與獸醫(yī)學合適的賦形劑混合進行制備。在這個類型的某些實施方案中，抗原是細胞相關的犬埃利希體菌苗。在特定實施方案中，獸醫(yī)學合適的賦形劑是溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中的索狀因子佐劑。本發(fā)明的這 些和其他方面通過參考附圖、詳述和實施例將得到更好地理解。附圖簡沭


圖1是隨著對照動物(三角形)和接種疫苗的動物(正方形)時間過去的平均攻擊后白血細胞計數(shù)的圖解表示。粗線指示依照默克手冊(Merck Manual)視為正常的最低水平的白血細胞計數(shù)。圖2是隨著對照動物(三角形)和接種疫苗的動物(正方形)時間過去的平均攻擊后紅血細胞計數(shù)的圖解表示。粗線指示依照默克手冊視為正常的最低水平的紅血細胞計數(shù)。圖3是隨著對照動物(三角形)和接種疫苗的動物(正方形)時間過去的平均攻擊后血紅蛋白值的圖解表示。粗線指示依照默克手冊視為正常的最低水平的血紅蛋白計數(shù)。圖4是隨著對照動物(三角形)和接種疫苗的動物(正方形)時間過去的平均攻擊后血細胞比容值的圖解表示。粗線指示依照默克手冊視為正常的最低水平的血細胞比容計數(shù)。圖5是隨著對照動物(三角形)和接種疫苗的動物(正方形)時間過去的平均攻擊后血小板計數(shù)的圖解表示。粗線指示依照默克手冊視為正常的最低水平的血小板計數(shù)。發(fā)明詳沭
本發(fā)明提供了免疫原性組合物和疫苗，其可以減少在用犬埃利希體的強毒株攻擊后血小板減少癥、白血球減少癥、貧血和重量減輕的發(fā)生率。本發(fā)明的結果與先前公開的關于受感染狗的報道不一致，其已通過抗生素治療治愈，但對后續(xù)疾病敏感[參見例如，Breitschwerdt 等人，Agents and Chemotherapy 42(2)362-368(1998)]。這些先前報道提示在暴露于該生物后不發(fā)展保護性免疫。與之形成直接對比，本發(fā)明提供了通過給受試者施用本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗組合物，用于改善和/或預防受試者中的犬單核細胞埃利希病(CME)和/或熱帶犬全血細胞減少癥(TCP)的方法。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了針對犬埃利希體的有效疫苗。如本文公開的，在犬埃利希體攻擊模型的發(fā)展過程中，狗快速發(fā)展針對犬埃利希體的體液抗體應答。與抗犬埃利希體抗體的出現(xiàn)相關的是血小板計數(shù)中的快速下降，或血小板減少癥，和幾種其他臨床適應癥的開始。然而，在狗中誘導強體液抗體應答的疫苗未能保護其免于疾病的臨床體征。事實上，產(chǎn)生針對犬埃利希體的強抗體應答的接種疫苗的狗在攻擊后可能具有比未接種疫苗的對應物更差的臨床結果。不受任何具體理論束縛，本文公開的結果看起來與犬埃利希體一致，其使用針對其產(chǎn)生的抗體，以通過調(diào)理作用的過程獲得對細胞內(nèi)部的進入。本發(fā)明進一步提供了生產(chǎn)用于免疫原性組合物和/或疫苗自身的抗原的方法。在特定實施方案中，該方法包含在特定細胞系上生長犬埃利希體以生產(chǎn)抗原。在一些實施方案中，抗原與獸醫(yī)學合適的賦形劑混合。在更特定的實施方案中，本發(fā)明包括包含滅活的在狗骨髓細胞系上生長的犬埃利希體的組合物。本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗可以進一步包括佐劑。盡管關于何種犬埃利希體區(qū)別何種細胞感染的選擇性機制知之甚少，但適合于感染的細胞通常表達主要組織相容性復合物(MHC)II類抗原受體。Harris等人[fe1.1mmunol.1mmunopathoL , 96:239-243 (2003)]已證實犬埃利希體具有用于下調(diào)在它感染的細胞表面上的MHC II類受體表達的機制作為用于避免免疫監(jiān)督的可能機制。雖然明確源自蜱物種的細胞系不表達哺乳動物MHC II類受體，但Singu等人\_CellularMicrobiology, 8 (9)，1475-1487 (2006)]已證實犬埃利希體根據(jù)它正在感染脊椎動物還是無脊椎動物宿主來改變其表面蛋白表達。相應地，在另一個方面，本發(fā)明提供了適應犬埃利希體生長、而同時產(chǎn)生已對于疫苗使用優(yōu)化的犬埃利希體抗原的細胞和/或細胞系。如本文使用的，“受試者”指可以受犬埃利希體感染的任何物種。在某些實施方案中，受試者是非人動物受試者。在特定實施方案中，受試者是犬或貓。在某些實施方案中，動物受試者是犬。在其他實施方案中，動物受試者是貓。如本文使用的,術語“犬”包括所有馴養(yǎng)狗、灰狼犬(Canis lupus familiar is)或家犬(Canis familiaris)，除非另有說明。如本文使用的，“有效免疫量”可以取決于用于生成疫苗的犬埃利希體的一種或多種菌株而改變，并且可以是足以誘發(fā)保護性免疫應答的任何量。盡管如本文使用的，“保護性免疫應答”可以是在受試者中導致免于一種或多種感染適應癥的保護的免疫應答，但“保護性免疫應答”不要求免于任何感染適應癥的完全保護。相反，“保護性免疫應答”可以是足夠的免疫應答，從而使得在攻擊后，潛在感染的癥狀至少是減少的，和/或引起 癥狀的一種或多種潛在細胞、生理學和/或生物化學原因或機制是減少和/或消除的。應當理解的是，如在這個背景中使用的“減少的”意指相對于感染狀態(tài)，包括感染的分子狀態(tài)，不只是感染的生理學狀態(tài)。本發(fā)明的疫苗預期提供保護性免疫應答。如本文使用的，“引發(fā)最低的體液應答”意指當通過下述程序進行檢測時，在初次接種疫苗中給受試者(例如犬)施用包含犬埃利希體的疫苗組合物不導致在初次暴露于疫苗組合物后21天得自受試者的測試血清中針對犬埃利希體的抗體的檢測:使測試血清的1:40稀釋物暴露于固定的犬埃利希體，充分洗滌以去除所有未結合的材料，加入對于受試者物種合適的熒光標記的抗IgG抗體，充分洗滌以去除所有未結合的材料，并且隨后經(jīng)由對于犬埃利希體特異性的抗體，目視檢查由于與固定的犬埃利希體結合的熒光標記的抗IgG抗體的熒光。在特定實施方案中，給受試者施用疫苗的單個后續(xù)加強劑量接種疫苗仍不引發(fā)針對犬埃利希體的顯著體液應答，并且當通過上文對于初次疫苗進行的方法測定時，要求在暴露于加強劑量疫苗組合物后得自動物受試者的測試血清的1:160或更少的稀釋度，以檢測測試血清中針對犬埃利希體的抗體，如果它們是完全可檢測的。如本文使用的，術語“穩(wěn)定感染的”細胞系指在細胞培養(yǎng)的至少10次傳代自始至終保持感染的細胞系。杭原
本發(fā)明的犬埃利希體抗原可以從任何數(shù)量的犬埃利希體來源或菌株中分離。此類犬埃利希體菌株的例子包括但不限于 Ebony、Broadfoot、Florida、Israel 611、Kogashima 1、Louisiana、Oklahoma、Venzuela、North Carolina State University (NCSU)菌株 Jake 以及NCSU分離物Demon、D J和Fuzzy。在特定實施方案中，抗原可以是犬埃利希體菌苗。在另外實施方案中，抗原可以由已通過可獲得的任何合適方法滅活的犬埃利希體細菌分離或衍生。此類方法的例子包括但不限于熱、甲醛、福爾馬林、二乙烯胺、輻射和丙內(nèi)酯處理。在特定實施方案中，犬埃利希體細菌可以通過福爾馬林處理滅活。在特定實施方案中，犬埃利希體抗原可以包含當一種或多種抗原提供給受試者時，未由受試者識別為外來的一種或多種抗原，即受試者未增強(mount)針對一種或多種抗原的體液應答或?qū)⒃鰪娽槍σ环N或多種抗原的最低的體液應答。在一些實施方案中，一種或多種犬埃利希體抗原將 不引發(fā)針對一種或多種犬埃利希體抗原的抗體的產(chǎn)生，或可替換地，將引發(fā)針對一種或多種犬埃利希體抗原的最低的抗體的產(chǎn)生。此外，此類犬埃利希體抗原將引發(fā)針對一種或多種犬埃利希體抗原的保護性免疫應答。本發(fā)明包括用于免于埃利希病類型的給犬接種疫苗的免疫原性組合物，其包含在犬中導致免疫應答的試劑，利用在犬中引發(fā)很少至無體液免疫應答，但仍在犬中引發(fā)保護性免疫應答的試劑作為試劑。在特定實施方案中，該保護性免疫應答至少部分是由于細胞介導的免疫應答。細朐
本發(fā)明的犬埃利希體細菌可以在合適的細胞和/或細胞系上生長。相應地，來自犬埃利希體的抗原可以由在細胞系上生長或繁殖的犬埃利希體細菌產(chǎn)生。此類細胞和細胞系的例子包括原代細胞(例如巨噬細胞)和/或細胞系和/或連續(xù)細胞系例如下文列出的那些:
原代細胞系:
犬血液巨曬細胞，參見例如[Nyindo,等人Am.J.Vet.Res.32:1651-1658(1971)]。.腹膜巨卩遼細胞，參見例如[Stephenson和Osterman,如.J.Vet.Res.38:1815-1819(1977)]。連續(xù)細朐系:
人/犬雜交細胞系[參見例如，Stephenson和Osterman, J.Vet.Res.41:234-240(1980)]ο.犬巨卩遼細胞細胞系(DH-82)[參見例如，Dawson,等人，J Infect.Dis.163:564-567(1991)]。.鼠腹膜巨噬細胞；小鼠/狗雜交細胞系(MDH-SP)，[參見例如，Holland和 Ristic, Abstr 55,第 89 頁，Program and Abstracts of the IVth InternationalSymposium on Rickettsiae and Rickettsial Diseases,Piestany Spa,Czech and SlovakFederal Republics]。.小鼠巨曬細胞細胞系[參見例如，Keysary,等人，/ VEt Diagn Invest13:521-523(2001)]ο.狗骨髓細胞系(DBM細胞)[參見例如，Gaunt等人7； Clin Micr0.34(6):1429-1432(1996)]。.貓胚胎成纖維細胞細胞系(FEF)[參見例如，Battles等人，WO 2009/036177Al]。.蜱細胞系(IDE8 和 ISE6)[參見例如，Munderloh，等人 U.S.5,869,335]。在本發(fā)明的一個方面，細胞系是巨噬細胞樣細胞系，其表達類似于由犬巨噬細胞表達的那些的表面受體。在相關實施方案中，細胞系是巨噬細胞細胞系。在這個類型的特定實施方案中，采用的細胞系是具有ATCC登記號CRL-10389的DH-82細胞系。本發(fā)明包括已在單核 細胞或巨噬細胞樣哺乳動物細胞系上生長的犬埃利希體。在某些情況下，這些細胞系 已永生化，以便提供用于制造疫苗的連續(xù)和可靠的生長基質(zhì)。永生化細胞可以由腫瘤性轉化祖細胞如由Wellman等人[J/ Vitro Cell Develop Biol24:223-228, (1988)]描述的DH-82細胞系產(chǎn)生。細胞可以通過使用病毒基因得到永生化。猿猴病毒40 (SV40) T抗原已顯示為產(chǎn)生永生化細胞的非常可靠的途徑，并且與SV40轉化的人細胞雜交的犬腹膜巨噬細胞的體細胞雜交物通過Stephenson等人[辦？ J Vet Res41(2):234-40, (1980)]以連續(xù)方式用于生長犬埃利希體。廣泛范圍的試劑可以用于永生化細胞，包括不同病毒、X射線、有機溶劑、金屬化合物和核酸。這些方法已由Rhim [AnnalsNY Acad of Sc1.919:16-25(2000)]廣泛綜述。在本發(fā)明的特定實施方案中，犬埃利希體在此類細胞系中生長，并且隨后滅活以形成犬埃利希體菌苗抗原。在特定實施方案中，細胞系是狗骨髓(DBM)細胞系。在特定實施方案中，DBM細胞系是由 Gaunt 等人[7； Clin.Microbi0.34 (6): 1429-1432，(1996)]描述的細胞系。在特定實施方案中，DBM細胞系是保藏菌株ATCC登記號PTA-10545。在特定實施方案中，細胞系是由犬埃利希體穩(wěn)定感染的DBM細胞系。在這個類型的特定實施方案中，細胞相關的犬埃利希體是保藏的且具有ATCC登記號PTA-10546。在可替換的實施方案中，細胞系是昆蟲細胞系。在這個類型的特定實施方案中，昆蟲細胞系是蜱細胞系。在一個特定實施方案中，昆蟲細胞系是從肩突硬蜱{Ixodes scapularis)分離的IDE8蜱細胞系，其已由ATCC保藏且具有ATCC登記號CRL-11973。犬埃利希體的繁殖由犬埃利希體感染的細胞培養(yǎng)物可以在燒瓶中生長，并且隨后傳至更大燒瓶，以獲得制備免疫原性組合物和/或疫苗所需的更大體積的材料?？商鎿Q地，受感染的細胞培養(yǎng)物可以從燒瓶傳至后續(xù)滾瓶、旋轉瓶、細胞立方體、生物反應器或能夠大規(guī)模生長細胞培養(yǎng)物的任何裝置內(nèi)，以便產(chǎn)生摻和免疫原性組合物和/或疫苗所需的合適量的材料。受感染的培養(yǎng)物可以在合適培養(yǎng)基中冷凍且以后用于感染細胞培養(yǎng)物。細胞可以貼壁且附著至生長燒瓶或裝置，包括附著至微載體，或可替換地，在懸浮液中漂浮。用于取出貼壁細胞的方法包括但不限于使用機械細胞刮棒從燒瓶中手動刮取，或用胰蛋白酶溶液處理以使其從燒瓶中取出，且隨后用蛋白溶液中和未使用的胰蛋白酶。細胞隨后可以離心以濃縮且重懸浮于合適的冷凍培養(yǎng)基中。冷凍培養(yǎng)基包括但不限于含有10-90%胎牛血清和1-20%二甲亞砜(DMSO)的培養(yǎng)基?？梢允褂闷渌线m的冷凍保護劑，其可能更適合于不同細胞系且在解凍和重新起始培養(yǎng)后導致高水平的活力。為了起始受感染的培養(yǎng)，未受感染的細胞可以從冷凍器中取出且在合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)。例如，將含有I X IO5 DBM細胞的I mL小瓶快速解凍，且置于含有合適培養(yǎng)基的T-75組織培養(yǎng)瓶(75cm2表面積)內(nèi)用于生長DBM細胞。在一個特定實施方案中，培養(yǎng)基是Fischer’ s完全生長培養(yǎng)基。例如，通過將200 mL馬血清加入770 mL Fischer’ s培養(yǎng)基中制備用于DBM細胞的一升Fischer’s完全生長培養(yǎng)基。通過加入10 mL 2 mg/mL氫化可的松溶液、10 mL 200 mM谷氨酰胺溶液和10 mL IM HEPES溶液完成培養(yǎng)基。一旦DBM培養(yǎng)物達到合適的匯合水平(10-90%)，培養(yǎng)物就準備受感染。從冷凍器取出受感染培養(yǎng)物的小瓶，快速解凍且分配到生長培養(yǎng)物上。培養(yǎng)物在36 土 2°C在含或不含CO2補充的加蓋或通風燒瓶中生長。培養(yǎng)物根據(jù)本領域技術人員的常見方法根據(jù)需要通過將細胞傳至新鮮培養(yǎng)基內(nèi)得到維持。在幾周后，可以通過使用抗犬埃利希體抗體或其他合適方法的間接熒光顯微鏡檢查，就感染水平檢查培養(yǎng)物。培養(yǎng)物可以達到90%或更高的感染水平。更高的感染水平是更希望的，因為它導致更高的抗原材料產(chǎn)量/培養(yǎng)物體積。通過培養(yǎng)物移至更大燒瓶、滾瓶或其他合適 培養(yǎng)容器，可以將受感染培養(yǎng)物傳至更大體積的培養(yǎng)物。細胞培養(yǎng)物通過犬埃利希體的感染可以通過幾種方法進行測定，包括但不限于用染料例如吉姆薩染料、Camco Difquick染料或吖啶橙染色的細胞的顯微鏡分析。此外，對于犬埃利希體特異性的抗體可以用熒光標記直接或間接標記，并且用熒光光學顯微鏡和在對于特定熒光標記合適的波長顯現(xiàn)。其他技術可以用于測定培養(yǎng)物的感染水平，包括但不限于定量聚合酶鏈式反應(qPCR)或PCR。未感染的細胞可以根據(jù)需要加入培養(yǎng)物中，以便維持培養(yǎng)物中的特定感染水平。當達到受感染培養(yǎng)物的合適體積時，可以通過多種方法滅活培養(yǎng)物，包括但不限于熱或化學方法。在滅活前，可以滴定培養(yǎng)物以測定培養(yǎng)物中的感染性顆粒的量，作為測定將多少滅活后培養(yǎng)物加入摻和物中的方法。用于滴定受感染培養(yǎng)物的方法在下文實施例中提供。在某些實施方案中，將福爾馬林加入培養(yǎng)物中至0.05%的終濃度，并且培養(yǎng)物在36 土 2°C混合三天?？梢允褂玫钠渌祟悳缁顒┌ǖ幌抻?乙撐亞胺(ΕΙ，ΒΕΙ)、β丙內(nèi)酯和苯酚。抗生素也可以用于滅活培養(yǎng)物，如去氧土霉素或犬埃利希體對其敏感的任何其他抗生素。培養(yǎng)物可以通過任何數(shù)量的方法進行測試以測定活力。此類方法包括但不限于在細胞培養(yǎng)物上的反向滴定，關于承受非穿透性染料的膜完整性，和注射到狗內(nèi)且監(jiān)測感染的典型體征。一旦滅活，培養(yǎng)物就可以通過任何多種方法進行濃縮。例如，非存活犬埃利希體的濃縮可以通過離心、超濾或蒸發(fā)完成。在一個特定實施方案中，由犬埃利希體感染的DBM細胞是滅活的，且隨后以1400 X g離心15分鐘，以沉淀全細胞。將上清液棄去且將沉淀重懸浮于不含血清的Fischer’ s培養(yǎng)基中。慶大霉素或類似防腐劑可以在滅活后加入，以避免污染物質(zhì)(issues)。將培養(yǎng)物重懸浮于不含血清的Fischer’ s培養(yǎng)基中至原始體積的十分之一，以便濃縮滅活的培養(yǎng)物且使得其更易于處理。在滅活的濃縮物中可獲得的抗原量可以通過任何數(shù)量的方法進行測定，包括層析、光譜法或多種類型的特異性免疫測定。大量抗原可以與稀釋劑和佐劑摻和，以制備可接受的疫苗。免疫原性組合物和疫苗
如上所示，包含本發(fā)明的抗原(例如犬埃利希體菌苗)的免疫原性組合物和/或疫苗可以但不一定進一步包括一種或多種藥學可接受的佐劑。藥學可接受的佐劑的例子是本令頁域眾所周知的，參見例如 Remington’s Pharmaceutical Sciences,第 18 版(1990, MackPublishing C0., Easton, Pa.)和 Goodman 和 Gilman’s, The Pharmacological Basis ofTherapeutics (第10版2001)。在特定實施方案中，佐劑可以是刺激細胞介導的免疫應答但不刺激體液免疫應答的佐劑。進一步包含佐劑的本發(fā)明的免疫原性組合物和/或疫苗可以包含在水中一般不可溶的一種或多種元素。在特定實施方案中，佐劑是溶解于非極性溶劑中的非極性溶質(zhì)。非極性溶劑的例子包括但不限于己烷、苯、甲苯、二乙醚、氯仿和乙酸乙酯。在一個此類實施方案中，溶劑是氯仿溶劑系統(tǒng)。氯仿在一些情況下可以是優(yōu)選的，因為它是不易燃的且更適合于制造獸醫(yī)學生物制品。本文例舉的佐劑是在氯仿溶劑系統(tǒng)中的海藻糖6，6' -二霉菌酸酯。非極性溶劑 在水中一般不可溶，且因此具有相對低介電常數(shù)但在水中具有良好可溶性的極性溶劑的使用可以用于溶劑系統(tǒng)中，以增加佐劑混合物在水溶液中的可溶性。極性溶劑的例子包括但不限于甲醇、乙醇、異丙醇、二甲亞砜和二甲基甲酰胺。在特定實施方案中，非極性溶劑是索狀因子[例如海藻糖6，6' -二霉菌酸酯]。其他非極性溶劑可以用于刺激細胞介導的免疫，包括但不限于純化皂苷的疏水餾分、細菌脂肽(Pam3CSK4)和單磷酰脂質(zhì)A。在特定實施方案中，索狀因子溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中。在特定實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)包含約65-95%氯仿體積/體積。相應地，氯仿溶劑系統(tǒng)的某些實施方案包括但不限于包含氯仿和甲醇的溶劑系統(tǒng)。在非限制性例子中，氯仿溶劑系統(tǒng)可以包含約70% - 95%氯仿和/或約5% - 30%甲醇體積/體積。在這個類型的某些實施方案中，氯仿溶劑系統(tǒng)進一步包含0.5 - 5.0 %水體積/體積。在一個非限制性例子中，氯仿溶劑系統(tǒng)可以包含按體積計九十份氯仿、按體積計十份甲醇和按體積計一份水[即分別約90%氯仿:10%甲醇:1.0%水體積/體積]。在特定實施方案中，佐劑可以包含溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中的索狀因子和/或其他佐劑。在一個此類實施方案中，佐劑是溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中的海藻糖6，6' -二霉菌酸酯:90 mL氯仿:10mL甲醇:I mL水。在特定實施方案中，疫苗組合物可以包含一種或多種藥學或獸醫(yī)學可接受的載體或稀釋劑?？梢杂糜谝呙缃M合物制劑中的載體或稀釋劑的非限制性例子包括水、葡萄糖溶液、右旋糖/鹽水、鹽水、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、HEPES緩沖液、Fischer’ s培養(yǎng)基、Hank’ s溶液和Ringer’ s溶液。此類制劑可以含有藥學可接受的輔助物質(zhì)以增強穩(wěn)定性、可遞送性或可溶性，如緩沖試齊IJ、張力調(diào)節(jié)齊U、濕潤劑、去污劑等。添加劑還可以包括另外的活性成分如殺菌劑或穩(wěn)定劑。例如，溶液可以含有硫柳汞、慶大霉素、乙酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、脫水山梨糖醇酐單月桂酸酯或三乙醇胺油酸酯。組合物可以通過常規(guī)已知滅菌技術進行滅菌。在特定實施方案中，考慮疫苗組合物可以進一步包含其他活性組分如但不限于針對下述的抗病原體組分，或抗原組分和/或其減毒和/或殺死的分離物:狂犬病病毒、萊姆病(伯氏疏螺旋體(ΒοιτθΙΛει /wrgt/or/eri))、犬痕熱病毒、犬博德特菌屬、犬細小病毒、犬腺病毒、犬冠狀病毒、犬巴貝蟲(Babesia、嗜吞噬細胞無形體iAnapIasmaphagocytophiluni)、貫第蟲罵{Giardia);問號鉤端螺旋體(Jeptospira interrogans)如血清變型犬型、出血性黃痕型(icieroAaefflorrAagiae)、波摩那型ipomona)、感冒傷寒型igrippotyphosa')或布拉迪斯拉發(fā)型(Jjratislava)等,或其任何組合。在一些實施方案中，疫苗和/或免疫原性組合物可以以劑量單位形式配制，以促進施用且確保劑量的一致性。此處，當劑量單位涉及疫苗組合物時，它指適合作為用于受試者的單位劑量的物理上不連續(xù)單位，每個單位含有計算為與佐劑、載體和/或媒介物結合的產(chǎn)生所需免疫原性效應的預定量的犬埃利希體抗原。在某些實施方案中，免疫原性組合物和/或佐劑是凍干的。在某些實施方案中，根據(jù)通過可能暴露于犬埃利希體攜帶者的時間決定的時間表，疫苗和/或免疫原性組合物可以以有效量腸胃外施用，例如肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)等，或免疫原性組合物和/或疫苗可以以有效量經(jīng)口或鼻內(nèi)施用。以這種方式，在自然暴露前，處理的受試者可以具有時間以構建免疫。例如，典型的治療時間表可以包括在潛在暴露前至少42天的皮下注射。在實施方案中，可以給受試者提供疫苗組合物的超過一次施用。作為非限制性例子，在受試者的潛在暴露前約42天的第一次施用和在約21天的第二次。然而，免疫的發(fā)作可以在更快速的時間過程中發(fā)生。疫苗的施用
本發(fā)明的疫苗可以作為液體、乳狀液、干燥粉末包括作為凍干粉末和/或在薄霧中通過任何腸胃外途徑、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮內(nèi)、通過劃破、皮下、肌內(nèi)施用，或通過粘膜途徑例如經(jīng)口、鼻內(nèi)、作為氣溶膠、通過滴眼劑、通過卵內(nèi){jn ow)施用接種，或作為冷凍干燥粉末植入。ATCC 保藏
下述生物學材料的培養(yǎng)物已在滿足用于專利程序目的的微生物保藏的國際承認的布達佩斯條約的要求的條件下由下述國際保藏中心通過下述保藏:
Board of Supervisors,
Louisiana State University and Agricultural and Mechanical College and LSUAgricultural Center，104 Efferson Hall，
Baton Rouge，Louisiana，70803
美國典型培養(yǎng)物中心(ATCC)10801 University Boulevard, Manassas， Va.20110-2209，U.S.A.。
權利要求
1.包含有效免疫量的滅活的來自犬埃利希體的抗原的疫苗組合物；其中當所述疫苗作為初次疫苗施用時，所述抗原在受試者中引發(fā)保護性免疫應答，但引發(fā)最低的體液應答。
2.權利要求1的疫苗組合物，其中所述抗原由在犬細胞上傳代的犬埃利希體生成。
3.權利要求2的疫苗組合物，其中所述犬細胞是狗骨髓細胞。
4.權利要求2的疫苗組合物，其中所述犬細胞具有ATCC登記號PTA-10545。
5.權利要求4的疫苗組合物，其中所述抗原是用福爾馬林滅活的。
6.權利要求5的疫苗組合物,其中所述疫苗組合物進一步包含親脂佐劑。
7.權利要求6的疫苗組合物，其中所述佐劑包含海藻糖6，6'- 二霉菌酸酯。
8.權利要求6的疫苗組合物，其中非極性溶劑包含所述親脂佐劑與所述疫苗。
9.權利要求8的疫苗組合物，其中所述非極性溶劑是氯仿溶劑系統(tǒng)。
10.權利要求9的疫苗組合物，其中所述氯仿溶劑系統(tǒng)包含約65-95%氯仿體積/體積。
11.權利要求10的疫苗組合物，其中所述氯仿溶劑系統(tǒng)進一步包含約5.0-30%甲醇體積/體積。
12.權利要求11 的疫苗組合物，其中所述氯仿溶劑系統(tǒng)分別包含約90%氯仿:10%甲醇:1.0%水體積/體積。
13.疫苗組合物，其包含 (a)福爾馬林滅活的在具有ATCC登記號PTA-10545的細胞中生長的細胞相關的犬埃利希體；和(b)包含溶解于90:10:1氯仿:甲醇:水中的海藻糖6，6'- 二霉菌酸酯的佐劑。
14.細胞相關的犬埃利希體，其具有PTA-10546的ATCC登記號。
15.細胞，其具有PTA-10545的ATCC登記號。
16.佐劑，其包含溶解于氯仿溶劑系統(tǒng)中的海藻糖6，6'- 二霉菌酸酯。
17.針對犬埃利希體給受試者接種疫苗的方法，其包括給所述受試者施用權利要求1的疫苗組合物。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述疫苗組合物的第二個劑量在所述疫苗組合物的第一個劑量后約21天提供。
19.用于產(chǎn)生權利要求1的疫苗組合物的方法，其包括在犬細胞上生長犬埃利希體以產(chǎn)生所述抗原；和隨后將所述抗原與獸醫(yī)學合適的賦形劑混合。
20.用于產(chǎn)生犬埃利希體抗原的方法，其包括在權利要求15的細胞上生長犬埃利希體，以產(chǎn)生所述抗原。
全文摘要
描述了包含有效免疫量的犬埃利希體菌苗的疫苗和/或免疫原性組合物。此外，還公開了通過提供該疫苗和/或免疫原性組合物針對犬埃利希體免疫受試者的方法。
文檔編號C12R1/01GK103200960SQ201180042339
公開日2013年7月10日 申請日期2011年6月29日 優(yōu)先權日2010年7月2日
發(fā)明者K.A.奧康奈爾, R.N.拉馬尚德拉, S.D.高恩特, R.E.科斯特韋特, T.L.沃斯莫恩 申請人:英特維特國際股份有限公司, 路易斯安那州大學及農(nóng)業(yè)和機械學院管理委員會