專利名稱：一種在有機(jī)相中酶催化合成海藻糖不飽和脂肪酸二酯的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種有機(jī)相中利用脂肪酶催化合成非離子多功能型表面活性劑海藻 糖不飽和脂肪酸酯的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
糖脂肪酸酯是由糖和脂肪酸縮合而成的一類可食用的具有特殊功能的表面活性 劑，由于具有良好的乳化性、稠化性和膨化性而被廣泛用于食品業(yè)、化妝品業(yè)和洗滌業(yè)。目 前，市售的糖脂肪酸酯多采用化學(xué)法合成，但化學(xué)法常常伴隨著產(chǎn)率低、產(chǎn)物復(fù)雜、產(chǎn)物色 澤深，分離純化困難等缺點(diǎn)，與之相比，酶法具有反應(yīng)選擇性高、條件溫和、產(chǎn)品副產(chǎn)物少、 色澤淺和產(chǎn)物易純化等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)發(fā)展的方向。因此，近年來有關(guān)糖脂肪酸酯酶法 合成的研究報(bào)道越來越多。
海藻糖不飽和脂肪酸酯是由海藻糖和不飽和脂肪酸縮合而成。海藻糖是一種非還 原性對稱結(jié)構(gòu)二糖，不受美拉德反應(yīng)的影響，且具有保濕性、抗凍性、維持細(xì)胞滲透壓、抗菌 性等特性，而不飽和脂肪酸具有抗衰老、治療和預(yù)防疾病的功效，因此，海藻糖不飽和脂肪 酸酯是一種新型的具有特殊營養(yǎng)功能的表面活性劑。此外，由于海藻糖是對稱結(jié)構(gòu)，可以構(gòu) 建雙子型表面活性劑海藻糖不飽和脂肪酸二酯，進(jìn)而拓展海藻糖和不飽和脂肪酸在食品、 醫(yī)藥和化妝品中的應(yīng)用范圍。
近年來，隨著海藻糖價(jià)格的不斷降低，對海藻糖脂肪酸酯的研究也越來越多。如 對海藻糖月桂酸單酯、棕櫚酸單酯、豆蔻酸單酯、硬脂酸單酯、油酸單酯、亞油酸單酯和亞麻 酸單酯等的報(bào)道，以及對海藻糖丁酸二酯、月桂酸二酯和硬脂酸二酯等的報(bào)道。然而，對海 藻糖不飽和脂肪酸二酯的研究至今尚未報(bào)道。本發(fā)明在丙酮中利用N0V0435催化合成不 飽和脂肪酸二酯，并確定最佳生產(chǎn)工藝條件和分離純化方法。該方法步驟簡單，條件也比 較溫和，符合綠色化學(xué)的發(fā)展方向，并且由于它不需進(jìn)行官能團(tuán)保護(hù)，可以大量減少反應(yīng)步 驟，此外，所選用的丙酮與以往報(bào)道中使用的DMF和叔丁醇等有機(jī)溶劑相比，毒性小、沸點(diǎn) 低、易揮發(fā)，在產(chǎn)品中容易除去，被歐共體承認(rèn)在食品添加劑制造上是安全的，可以應(yīng)用在 食品、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供酶法合成非離子型表面活性劑海藻糖不飽和脂肪酸二酯及 其分離純化的方法，并通過單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳生產(chǎn)工藝條件。本方法條件溫和、步驟簡 單、選擇性強(qiáng)和反應(yīng)效率高，所得產(chǎn)物成分簡單便于分離純化，明顯優(yōu)于化學(xué)法，可以應(yīng)用 于工業(yè)化生產(chǎn)。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種在有機(jī)相中酶催化合成海藻糖不飽和脂肪酸二酯的方 法，采用在恒溫水浴條件下，在丙酮中采用脂肪酶N0V0435催化酯化，間歇反應(yīng)合成海藻糖 不飽和脂肪酸二酯，生產(chǎn)工藝條件為3
(1)海藻糖起始濃度為6-50mmol/L ；
(2)不飽和酸起始濃度為48-120mmol/L ；
(3)催化劑脂肪酶N0V0435添加量為10_30g/L ；
(4)分子篩的添加量為20_100g/L ；
(5)恒溫振蕩水浴條件45-60°C，100-200rpm ；
(6)反應(yīng)時(shí)間為 6_120h。
分離純化工藝條件為
(1)將收集的反應(yīng)液減壓蒸餾，回收溶劑丙酮，同時(shí)得到液態(tài)物質(zhì)；
(2)將得到的液態(tài)物質(zhì)采用氯仿溶解后，利用薄層色譜檢測，硅膠柱層析分離純 化，收集海藻糖不飽和脂肪酸二酯產(chǎn)品。
所用不飽和脂肪酸為油酸、亞油酸、花生油酸和芥酸。
所述方法的優(yōu)化工藝條件為
(1)海藻糖起始濃度為25mmol/L ；
(2)不飽和酸起始濃度為100mmol/L ；
(3)催化劑脂肪酶N0V0435添加量為20mmol/L ；
(4)分子篩的添加量為60g/L ；
(5)恒溫振蕩水浴條件55°C，150rpm ；
(6)反應(yīng)時(shí)間為7濁。
分離純化工藝條件為
(1)硅膠柱層析流動(dòng)相條件氯仿甲醇=8:1;
(2)薄層層析檢測的展開劑條件氯仿甲醇=8 1。
將收集的反應(yīng)液減壓蒸餾，回收溶劑丙酮，同時(shí)得到液態(tài)物質(zhì)，再把得到的液態(tài)物 質(zhì)用氯仿溶解后，利用薄層色譜檢測，硅膠柱層析分離純化，收集海藻糖不飽和脂肪酸二酯 產(chǎn)品，同時(shí)分離出未反應(yīng)的不飽和脂肪酸和有機(jī)溶劑，前者可繼續(xù)參與反應(yīng)，后者經(jīng)減壓蒸 餾可重復(fù)使用。
脂肪酶催化海藻糖脂肪酸二酯合成方法的研究包括設(shè)計(jì)單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化得到反 應(yīng)時(shí)間、酸醇摩爾比、脂肪酶添加量、分子篩添加量，并確定產(chǎn)物的分離純化方法。
反應(yīng)時(shí)間的確定實(shí)驗(yàn)中采用的反應(yīng)時(shí)間分別是他、1池、24h、幼h、7 、邪h和 120h,結(jié)果發(fā)現(xiàn)達(dá)到72h時(shí)，酯化反應(yīng)趨于平衡，因此優(yōu)選時(shí)間為72h。
反應(yīng)溫度的確定實(shí)驗(yàn)中采用的反應(yīng)溫度分別為45°C、50°C、55°C和60°C，結(jié)果發(fā) 現(xiàn)55°C時(shí)產(chǎn)率最高，因此優(yōu)選溫度為55°C。
催化劑脂肪酶N0V0435添加量的影響實(shí)驗(yàn)中選用的脂肪酶添加量分別為10g/L、 15g/L、20g/L和30g/L，添加量越多，轉(zhuǎn)化率越高，當(dāng)添加量大于20g/L時(shí)，產(chǎn)率趨于穩(wěn)定，考 慮到生產(chǎn)成本，因此選用20g/L。
海藻糖濃度的確定實(shí)驗(yàn)中選擇的海藻糖濃度分別為6mmol/L、12. 5mmol/L、 18mmol/L、25mmol/L、38mmol/L和50mmol/L，結(jié)果表明當(dāng)海藻糖濃度為25mmol/L時(shí)，轉(zhuǎn)化率 最高，因此海藻糖添加量選為25mmol/L。
酸醇摩爾比的影響反應(yīng)中添加的不飽和酸和海藻糖的摩爾比分別為2、3、4和5， 起初，隨著酸醇摩爾比的增加，轉(zhuǎn)化率不斷升高，但當(dāng)酸醇摩爾比大于4時(shí)，產(chǎn)率略有下降，因此所選酸醇摩爾比為4 1。
分子篩添加量的影響反應(yīng)中添加的分子篩濃度分別為20g/L、40g/L、60g/L、 80g/L和100g/L，隨著分子篩添加量的增加，反應(yīng)轉(zhuǎn)化率先升高后降低，當(dāng)分子篩濃度為 60g/L時(shí)，產(chǎn)率最高，因此優(yōu)先選擇分子篩濃度為60g/L。
最佳工藝條件的確定通過單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化出丙酮中脂肪酶催化合成海藻糖不 飽和脂肪酸二酯的最佳工藝條件當(dāng)脂肪酶添加量為20g/L，分子篩濃度為60g/L，酸醇摩 爾比為4 1時(shí)，海藻糖濃度25mmol/L，55°C水浴振蕩150rpm反應(yīng)72h，海藻糖芥酸二酯的 轉(zhuǎn)化率達(dá)到51. 53%。
反應(yīng)液的分離純化方法經(jīng)大量實(shí)驗(yàn)優(yōu)化出了薄層色譜分析海藻糖不飽和脂肪酸 酸酯的展開劑條件氯仿甲醇=8 1 (ν/ν)，將此展開劑條件作為柱層析的流動(dòng)相條件， 即可分離純化出海藻糖不飽和脂肪酸二酯。將除去酶和分子篩的酶促反應(yīng)液，通過減壓蒸 餾除去反應(yīng)溶劑丙酮后，加入氯仿溶解，經(jīng)硅膠柱層析后，通過薄層檢測，收集不同段的組 分，即可得到海藻糖不飽和脂肪酸酸二酯。收集的二酯在HPLC檢測下的純度均達(dá)到99%以 上，如圖1所示。
本發(fā)明的有益效果采用本發(fā)明在有機(jī)溶劑中利用脂肪酶催化制備海藻糖不飽和 酸酯的方法，可以大大提高二酯的轉(zhuǎn)化率，如四種不飽和脂肪酸二酯的轉(zhuǎn)化率均超過51 %， 純度均達(dá)到99%以上。本發(fā)明方法不僅具有酶法生產(chǎn)的條件溫和、綠色安全和產(chǎn)品容易純 化等特點(diǎn)，而且具有反應(yīng)產(chǎn)率高、步驟簡單和高選擇性等優(yōu)點(diǎn)，符合綠色化學(xué)的發(fā)展方向。 此外，選擇的有機(jī)溶劑丙酮被允許應(yīng)用在食品工業(yè)中，得到的海藻糖不飽和脂肪酸二酯產(chǎn) 品可作為新型功能性表面活性劑應(yīng)用于食品業(yè)、化妝業(yè)和醫(yī)藥業(yè)。


圖1分離純化出的海藻糖芥酸二酯的HPLC圖譜具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
反應(yīng)初始在反應(yīng)器中當(dāng)加酶量為30g/L，以芥酸為原料，酸醇比為4 1，分子篩量 為60g/L時(shí)，海藻糖濃度為25mmol/L，55°C水浴振蕩150rpm反應(yīng)72h，得到海藻糖芥酸二 酯，經(jīng)HPLC檢測海藻糖二酯的產(chǎn)量達(dá)到51%，分離純化后二酯純度達(dá)到99%以上。
實(shí)施例2 反應(yīng)條件同實(shí)施例1，以油酸為原料，得海藻糖油酸二酯。
實(shí)施例3 反應(yīng)條件同實(shí)施例1，以亞油酸為原料，得海藻糖亞油酸二酯。
實(shí)施例4 反應(yīng)條件同實(shí)施例1，以花生油酸為原料，得海藻糖花生油酸二酯。
權(quán)利要求
1.一種在有機(jī)相中酶催化合成海藻糖不飽和脂肪酸二酯的方法特征是，在恒溫水浴振 蕩條件下，在丙酮中利用脂肪酶N0V0435催化酯化，間歇反應(yīng)得到海藻糖不飽和脂肪酸二 酯。生產(chǎn)工藝條件為(1)海藻糖起始濃度為6-50mmol/L；(2)不飽和脂肪酸起始濃度為48-120mmol/L；(3)催化劑脂肪酶N0V0435添加量為10-30g/L；(4)分子篩的添加量為20-100g/L；(5)恒溫振蕩水浴條件45-60°C，100-200rpm；(6)反應(yīng)時(shí)間為6-120h。分離純化工藝條件為(1)將所得的反應(yīng)液減壓蒸餾，回收溶劑丙酮，同時(shí)得到液體物質(zhì)；(2)將收集的液體物質(zhì)用氯仿溶解后，利用薄層層析檢測，硅膠柱層析分離純化，收集 海藻糖不飽和脂肪酸二酯產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是所選用不飽和脂肪酸為油酸、亞油酸、花生油 酸和芥酸。
3.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是生產(chǎn)工藝條件為(1)海藻糖起始濃度為25mmol/L；(2)不飽和酸起始濃度為IOOmmol/L；(3)催化劑脂肪酶N0V0435添加量為20g/L；(4)分子篩的添加量為60g/L；(5)恒溫振蕩水浴條件55°C，150rpm；(6)反應(yīng)時(shí)間為72h。分離純化工藝條件為(1)薄層層析檢測的展開劑為氯仿甲醇=8:1;(2)硅膠柱層析流動(dòng)相為氯仿甲醇=8 1。
4.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是所選用的海藻糖屬于非還原性對稱結(jié)構(gòu)二 糖，且不受美拉德反應(yīng)的影響。
5.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是所得到的海藻糖不飽和脂肪酸酸二酯是一類 雙子型表面活性劑。
6.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是產(chǎn)物表現(xiàn)出很強(qiáng)的表面活性和乳化性特，同 時(shí)，呈現(xiàn)出非常好的抗菌性、抗癌性和高效的藥物輸送功能。
7.根據(jù)權(quán)利1要求所述的方法，其特征是在丙酮中利用N0V0435催化海藻糖和不飽和 脂肪酸反應(yīng)的產(chǎn)物中，二酯是唯一的產(chǎn)品。
全文摘要
一種在有機(jī)相中酶催化合成海藻糖不飽和脂肪酸二酯的方法，屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明在丙酮中利用脂肪酶NOVO435催化合成了海藻糖油酸二酯、亞油酸二酯、花生油酸二酯和芥酸二酯，確定了產(chǎn)物的最佳生產(chǎn)工藝條件和分離純化方法。在最佳工藝條件下，海藻糖油酸二酯、亞油酸二酯、花生油酸二酯和芥酸二酯的產(chǎn)率分別達(dá)到56.72％、55.65％、53.21％和51.53％，分離純化后的二酯純度均達(dá)到99％以上。本發(fā)明方法具有條件溫和、步驟簡單、轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品綠色安全，易分離純化等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)B01F17/00GK102031278SQ20101022264
公開日2011年4月27日 申請日期2010年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月1日
發(fā)明者馮骉, 張曉鳴, 李舒生, 賈承勝 申請人:江南大學(xué)