一種突變的海藻糖合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種突變的海藻糖合酶及其表達(dá)基因與應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 海藻糖是一種十分安全可靠的非還原性雙糖，費(fèi)雷德里克率先應(yīng)用核磁共振技術(shù) 對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了探究，有2個(gè)吡喃型葡萄糖單體通過1，1糖苷鍵連結(jié)而成的雙糖。十九 世紀(jì)上半葉由威格斯從一種黑麥的麥角菌中把海藻糖第一次提取獲得，并且已經(jīng)證實(shí)了海 藻糖對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性保護(hù)作用。又因?yàn)槠淠透珊?、抗低溫、抗?yán)寒等特 性，被很多人稱為"生命之糖"。海藻糖能使生物體忍受高溫、高寒、高滲透壓及干燥失水等 惡劣的環(huán)境條件，原因是它能夠產(chǎn)生一種膜附著在細(xì)胞表面，較好地維持蛋白分子不發(fā)生 變性，進(jìn)而使得動(dòng)植物生命特性得以存在。這一獨(dú)特的功能特性，使得海藻糖除了可以作為 蛋白質(zhì)藥物、酶、疫苗和其他生物制品的優(yōu)良活性保護(hù)劑以外，還是保持細(xì)胞活性、保濕類 化妝品的重要成分，更可作為防止食品劣化、保持食品新鮮風(fēng)味、提升食品品質(zhì)的獨(dú)特食品 配料。因此海藻糖可廣泛的應(yīng)用到醫(yī)藥、化妝品業(yè)以及食品行業(yè)，具有誘人的開發(fā)應(yīng)用前景 和巨大的經(jīng)濟(jì)效益。
[0003] 鑒于海藻糖廣泛而重要的應(yīng)用價(jià)值，尋找海藻糖高效方便、低成本生產(chǎn)方法的研 究被廣泛重視。目前海藻糖的生產(chǎn)方法主要有酵母提取法、發(fā)酵法、酶合成法。其中酶法生 產(chǎn)海藻糖具有較高的特異性和快速溫和等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研發(fā)海藻糖工業(yè)化生產(chǎn)的熱點(diǎn)并 作為短期可見效的可行性途徑之一。
[0004] 海藻糖合酶(Trehalose synthase,TreS)是一種分子內(nèi)葡糖苷轉(zhuǎn)移酶，它只需要 一步反應(yīng)就可以將麥芽糖的α-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α_1，1糖苷鍵生成海藻糖。該酶反應(yīng)流程 短，易調(diào)控，不需要消耗高能物質(zhì)，不需要磷酸鹽共存，只需要一種酶一步反應(yīng)就能獲得海 藻糖，因此海藻糖合酶轉(zhuǎn)化法是適宜工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的方法，有著良好的應(yīng)用前景，受到 廣泛的關(guān)注。到目前為止，國(guó)內(nèi)外有報(bào)道的能夠產(chǎn)海藻糖合酶的微生物已經(jīng)超過15種。不同 微生物來源的海藻糖合酶的催化效率、酶學(xué)性質(zhì)各有不同，但其在反應(yīng)過程中均伴有副產(chǎn) 物的產(chǎn)生，有的高達(dá)20%，一般為5%_10%左右，這對(duì)下游產(chǎn)物的分離純化帶來了難度，同 時(shí)提尚了海澡糖的生廣成本。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種突變的海藻糖合酶及其表達(dá)基因與應(yīng) 用。該突變的海藻糖合酶副產(chǎn)物葡萄糖的生成量降低，海藻糖的轉(zhuǎn)化率提高。該海藻糖合酶 由來源于施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri Qlu3)的海藻糖合酶經(jīng)定點(diǎn)突變?chǔ)?09Ε獲 得。
[0006] 本發(fā)明技術(shù)方案如下：
[0007] 一種突變的海藻糖合酶的表達(dá)基因，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一種突變的海藻糖合酶，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]本發(fā)明所述海藻糖合酶是通過Quick change定點(diǎn)突變的方法對(duì)關(guān)鍵氨基酸309位 的丙氨酸突變?yōu)楣劝彼?，然后轉(zhuǎn)入大腸桿菌進(jìn)行高效表達(dá)后，利用鎳柱親和層析，離子交換 層析，分子篩等一系列純化手段，最終獲得高純度的海藻糖合酶突變體蛋白。上述重組蛋白 反應(yīng)2h即可達(dá)到最大轉(zhuǎn)化率，海藻糖轉(zhuǎn)化率即可達(dá)到74.7%，副產(chǎn)物僅為1.1%。上述重組 蛋白在50°C金屬浴中放置30min海藻糖轉(zhuǎn)化率依然可以達(dá)到51.2%。上述重組蛋白最適反 應(yīng)溫度為35°C。上述重組蛋白最適反應(yīng)pH為7.0-8.0。
[0010] -種插入上述突變的海藻糖合酶的表達(dá)基因的重組載體。
[0011] -種轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系，含有上述重組載體。
[0012] 上述突變的海藻糖合酶的表達(dá)基因、重組載體或轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系在制備海藻糖合酶 中的應(yīng)用。
[0013] 上述突變的海藻糖合酶在制備海藻糖中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明所述的海藻糖合酶，由施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)Qlu3中獲 得，具體方法為:對(duì)商品化的pET-15b載體的多克隆位點(diǎn)進(jìn)行改造，刪除掉多余的酶切位點(diǎn)， 保留BamHI，XhoI，EcolI，Hindin酶切位點(diǎn)，并在其中加入了Prescission酶切位點(diǎn)，獲得 pGLOl載體。將該基因連接到pGLOl載體上構(gòu)建成質(zhì)粒，然后利用Quick change定點(diǎn)突變的 方法對(duì)關(guān)鍵氨基酸309位的丙氨酸(A)突變谷氨酸(E)，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21DE(3)中進(jìn)行 原核表達(dá)。然后通過鎳柱親和層析，Source-Q離子交換層析，Superdex-200分子篩層析的方 法分離獲得高純度的突變體海藻糖合酶。
[0015] 有益效果
[0016] 本發(fā)明首次根據(jù)(Pseudomonas stutzeri)Qlu3預(yù)測(cè)的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，對(duì)其活性 中心進(jìn)行關(guān)鍵氨基酸的定點(diǎn)突變，獲得了海藻糖合酶的突變體蛋白，該突變的海藻糖合酶 制備方法簡(jiǎn)便，產(chǎn)量大，純度高，熱穩(wěn)定性好，并且海藻糖轉(zhuǎn)化率由野生型的71.5%提高到 74.7%，副產(chǎn)物由野生型的3.6%降低至1.1 %，較野生型海藻糖合酶，突變體的海藻糖轉(zhuǎn)化 率提高了4.5%，副產(chǎn)物葡萄糖的生成量降低了69.4%。可以降低海藻糖與葡萄糖的分離成 本，為海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ);也為其他相似蛋白提高轉(zhuǎn)化率提供了可行性方法。
【附圖說明】
[0017] 圖1是PCR擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果照片；
[0018] 圖中：M、Marker，T為TreS-pET-15b 的目的條帶；
[0019]圖2為鎳柱純化后海藻糖合酶SDS-PAGE電泳結(jié)果圖片；
[0020]圖中，ce:破碎后全菌液，s:高速離心后上清，elu:鎳柱洗脫后蛋白；
[0021 ]圖3為通過高效液相測(cè)定的葡萄糖、麥芽糖和海藻糖的標(biāo)樣峰狀結(jié)果圖；
[0022] 圖4為通過高效液相測(cè)定反應(yīng)結(jié)束后葡萄糖、海藻糖和麥芽糖的峰狀結(jié)果圖；
[0023] 圖5A為純化后海藻糖合酶酶活最適反應(yīng)溫度曲線圖；
[0024]圖5B純化后海藻糖合酶酶活溫度穩(wěn)定曲線圖；
[0025]圖6A為純化后海藻糖合酶最適反應(yīng)pH曲線圖；
[0026]圖6B純化后海藻糖合酶pH穩(wěn)定曲線圖；
[0027]圖7A為純化后海藻糖合酶與突變體反應(yīng)時(shí)間對(duì)海藻糖轉(zhuǎn)化率影響的曲線圖；
[0028] 圖中：TreS為野生型海藻糖合酶，TreSA309E為突變的海藻糖合酶；
[0029] 圖7B為純化后海藻糖合酶與突變體反應(yīng)時(shí)間對(duì)葡萄糖轉(zhuǎn)化率影響的曲線圖；
[0030] 圖中：TreS為野生型海藻糖合酶，TreSA309E為突變的海藻糖合酶。
【具體實(shí)施方式】
[0031]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步闡述，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限于 此。
[0032]實(shí)施例1:克隆得到突變的海藻糖合酶基因。
[0033] 依據(jù)NCBI上公開的施氏假單胞菌(Pseudomonas stutzeri)海藻糖合酶全長(zhǎng)核苷 酸序列設(shè)計(jì)突變點(diǎn)處的引物，引物序列如下：
[0034] 上游引物:GTGGCCCTCCGACCAttcGGTGCC
[0035] 下游引物：CGTGCCGAGGGCACCgaaTGGTCG
[0036] 以構(gòu)建好的tres-pGLOl質(zhì)粒為模板，利用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如 下：
[0038] 上述PCR反應(yīng)按照如下程序進(jìn)行：
[0039] 98°C 預(yù)變性 3min; 98°C 變性 10s，58°C 退火 30s，72°C 延伸 4min，25 個(gè)循環(huán)；72°C 終延 伸lOmin。
[0040] PCR結(jié)束后通過lwt%的瓊脂糖凝膠電泳分析片段長(zhǎng)短。
[0041 ]實(shí)施例2:將突變的海藻糖合酶基因轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主中，獲得陽性表達(dá)菌株。
[0042] PCR產(chǎn)物經(jīng)Dpnl內(nèi)切酶酶切反應(yīng)，酶切反應(yīng)體系如下：
[0043] PCR產(chǎn)物的酶切體系：
[0045] 充分混勻后離心數(shù)秒，將管壁液滴收到管底，37°C連接反應(yīng)30min。
[0046] 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
[0047] (1)感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0048] ①挑取大腸桿菌BL21(DE3)(購(gòu)自上海前塵生物科技有限公司）單菌落(或挑取保 存菌種)接種至l〇ml液體LB培養(yǎng)基中，37°C，210rpm過夜培養(yǎng)；
[0049] ②取5ml菌液接種于500ml LB培養(yǎng)基中，37°C，210rpm，搖70-80min至0D6QQ達(dá)到 0.375；
[0050] ③將菌液放置于冰水混合物上lOmin，同時(shí)預(yù)冷50ml離心管；
[00511④將菌液轉(zhuǎn)移到離心管中，4°C，3700rpm，lOmin收集菌體，棄上清；
[0052]⑤每個(gè)離心管中加入大約10ml冰預(yù)冷的激活緩沖液(0.1M CaCl2)，用滅過菌的 5ml槍尖打散沉淀，然后再向每個(gè)管中加大約30ml冰預(yù)冷的激活緩沖液，顛倒混勻，冰上靜 置20min;
[0053] ⑥4°C，3700rpm，離心10min;棄上清，將殘液倒凈，按500ml菌液12ml冰預(yù)冷儲(chǔ)存 buffer(0.1M CaCl2，體積百分比15 %甘油）的量，將沉淀打散，（分次轉(zhuǎn)移，然后吹吸打散）。 [0054] ⑦將感受態(tài)細(xì)胞分裝到冰預(yù)冷的滅菌EP中，每管100微升，置于冰上(0°C)30min。
[0055] ⑧感受態(tài)-80°C凍存，制得感受態(tài)細(xì)胞BL21 (DE3)。
[0056]注意：整個(gè)過程盡量讓細(xì)胞處于低溫，所用的槍尖，離心管，EP管和buffer等均要 滅菌，整個(gè)過程都在超凈臺(tái)里操作，感受態(tài)細(xì)胞做完后要test其效率和是否染菌。
[0057] (2)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化
[0058] ①將15yL連接產(chǎn)物加入lOOyL新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞BL21DE(3)中，輕輕混勻，冰 浴30min。
[0059] ②42°C熱激90s，然后迅速置于冰浴中冷卻3min。
[0060] ③加入200yL LB液體培養(yǎng)基，37