專利名稱：一種高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌株，屬于生物能源領(lǐng)域，主要通過從自然環(huán)境中進(jìn)行篩選的方法得到一株以環(huán)境中有機(jī)廢棄物為營養(yǎng)物質(zhì)、能將太陽光能轉(zhuǎn)換為清潔能源一氫能的光合細(xì)菌菌株，達(dá)到保護(hù)環(huán)境，實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用的目的。
背景技術(shù)：
氫是自然界存在最普遍的元素，據(jù)估計它構(gòu)成了宇宙質(zhì)量的75％，氫能具有許多優(yōu)點首先氫氣燃燒發(fā)熱值高。除核燃料外氫的發(fā)熱值是所有化石燃料、化工燃料和生物燃料中最高的，為142,351kJ/kg，是汽油發(fā)熱值的3倍。其次氫燃燒性能好，點燃快，與空氣混合時有廣泛的可燃范圍，而且燃點高，燃燒速度快。此外氫本身無毒，與其他燃料相比氫燃燒時最清潔，除生成水和少量氮化氫外不會產(chǎn)生諸如一氧化碳、二氧化碳、碳?xì)浠衔铩U化物和粉塵顆粒等對環(huán)境有害的污染物質(zhì)，而且燃燒生成的水還可繼續(xù)制氫，反復(fù)循環(huán)使用。同時氫能利用形式多，既可以通過燃燒產(chǎn)生熱能，在熱力發(fā)動機(jī)中產(chǎn)生機(jī)械功，又可以作為能源材料用于燃料電池，或轉(zhuǎn)換成固態(tài)氫用作結(jié)構(gòu)材料。用氫代替煤和石油，不需對現(xiàn)有的技術(shù)裝備作重大的改造。由以上特點可以看出氫是一種理想的新的含能體能源。
西方國家特別是美國特別重視氫能的開發(fā)和利用。美國于2001年5月17日出臺的《國家能源政策》，大膽提出了發(fā)展氫能、在未來徹底擺脫對進(jìn)口能源依賴的構(gòu)想。隨后，美能源部便開始著手對這一構(gòu)想進(jìn)行可行性和實施政策的研究。作為第一步，同年11月能源部召開了“國家氫能發(fā)展展望”研討會，并形成了題為《美國向氫經(jīng)濟(jì)過渡的2030年遠(yuǎn)景展望》的報告。2002年4月，能源部又組織召開了有220多位各界人士參加的“國家氫能發(fā)展藍(lán)圖”研討會，并在此基礎(chǔ)上于11月出臺了題為《國家氫能發(fā)展路線圖的》報告。2003年1月28日布什總統(tǒng)國情咨文講話中正式提出實施《國家氫燃料研究計劃》，為發(fā)展氫經(jīng)濟(jì)提供技術(shù)支撐。2004年2月，美國能源部出臺了《氫能技術(shù)研究、開發(fā)與示范行動計劃》，并將生物制氫技術(shù)作為該計劃的重要研發(fā)部分。該計劃的出臺是美國推動氫經(jīng)濟(jì)發(fā)展的又一重大舉措，標(biāo)志著美國發(fā)展氫經(jīng)濟(jì)已從政策評估、制定階段進(jìn)入到了系統(tǒng)化實施階段。
目前世界上氫的年產(chǎn)量在3600萬噸以上，主要來自化石燃料、生物質(zhì)和水，主要是采用傳統(tǒng)的物理化學(xué)方法如水電解、天然氣催化重整和熱裂解、煤炭氣化、石油腦的部分氧化等制取氫氣，傳統(tǒng)的制氫方法實質(zhì)上是以消耗大量化石能源為代價換取氫能，凈增能值低，經(jīng)濟(jì)適用性不強(qiáng)，同時對環(huán)境產(chǎn)生污染。運(yùn)用光電技術(shù)和電解技術(shù)結(jié)合的方法也可以制取氫氣，用太陽能光伏電池或太陽能熱收集器能產(chǎn)生較高的轉(zhuǎn)化效率，但由于地球表面太陽能輻射率僅為1kW·m-2，因此需要建造巨大的面積以收集足夠多的能量，這明顯限制了其商業(yè)運(yùn)用；同時這種方法的最重要的不利條件是需要非常高的投資成本和高技術(shù)要求，從而在技術(shù)方面阻礙了其在欠發(fā)達(dá)國家和地區(qū)對太陽光的運(yùn)用。而利用微生物法制取氫氣具有許多優(yōu)點使用豐富的可再生資源—生物質(zhì)和水為原料，直接或間接利用地球上最經(jīng)濟(jì)和最清潔的能源—太陽光，能治理環(huán)境污染，保護(hù)環(huán)境，經(jīng)濟(jì)適用性強(qiáng)，生產(chǎn)安全，設(shè)備簡單，操作方便，不需消耗大量的能量，成本低、投資省，光合產(chǎn)氫微生物種類繁多，利用前景廣闊，易于普遍推廣應(yīng)用。因此利用微生物法制取氫氣已成為可再生能源利用和開發(fā)領(lǐng)域的研究熱點。
目前利用太陽能制氫的方法有太陽能熱分解水制氫、太陽能發(fā)電電解水制氫、陽光催化光解水制氫、太陽能生物制氫等等。其中以太陽能生物制氫展示了最廣闊的前景。
在太陽能光生物制氫技術(shù)中光合細(xì)菌因能分解有機(jī)物質(zhì)，轉(zhuǎn)化和利用太陽光能為氫能而具有獨(dú)特的優(yōu)勢，即在光能的驅(qū)動下以有機(jī)物為原料，分解有機(jī)物獲得氫氣，屬于光能異養(yǎng)型。在微生物產(chǎn)氫系統(tǒng)中，光合細(xì)菌制氫被認(rèn)為是最有前途的微生物產(chǎn)氫方法，這是由于(1)光合細(xì)菌制氫具有高的理論光氫轉(zhuǎn)化量；(2)不產(chǎn)生O2，避免了O2造成的微生物失活問題；(3)光能利用中的光譜范圍寬；(4)具有消耗廢水處理過程中排放的有機(jī)底物的能力。實現(xiàn)了有機(jī)廢物的綜合利用和環(huán)境保護(hù)的目的，因此這對可再生能源的開發(fā)和可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的實現(xiàn)將是很有前途的處理技術(shù)。國外文獻(xiàn)報道光合細(xì)菌產(chǎn)氫速率一般為0.00518-1.58mg·h-1·l-1，這類光合細(xì)菌產(chǎn)氫效率仍然較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從自然環(huán)境中篩選獲得一種具有高效產(chǎn)氫特性和降解有機(jī)廢棄物能力的光合細(xì)菌菌株。
本發(fā)明所述光合細(xì)菌菌株是指沼澤紅假單胞菌株，該菌株已在北京中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年3月1日，保藏號CGMCC No.1947；具體內(nèi)容為沼澤紅假單胞菌CQK 01，Rhodoseudomonas palustris CQK 01，CGMCC No.1947。
本發(fā)明技術(shù)方案是采集自然環(huán)境中的淤泥，對菌源進(jìn)行富集增殖培養(yǎng)，獲得大量光合細(xì)菌菌種，對培養(yǎng)液進(jìn)行反復(fù)篩選和分離純化，獲得一株無毒性，產(chǎn)氫能力高，能吸收和轉(zhuǎn)化太陽光能，有效分解和利用各種有機(jī)物質(zhì)的光合細(xì)菌菌株，對該菌種進(jìn)行生理生化特性分析和16S rDNA序列分析并與NCBI的BLASTn比對分析，按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)關(guān)于光合細(xì)菌分類的方法進(jìn)行生理和形態(tài)特征鑒定，判定該菌種屬于紅螺菌目、紅螺菌科、紅假單胞菌屬，種名為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)CQK 01株。
光合細(xì)菌Rhodopseudomonas palustris CQK 01的生物學(xué)特性(1)本產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌種的形態(tài)特征本產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌種在形態(tài)上該菌株為橢圓形，細(xì)胞形態(tài)較大，長約4.0μm左右，寬約2.5μm左右，革蘭氏染色為陰性，鞭毛多而長，周生，細(xì)胞運(yùn)動性強(qiáng)，電鏡下可見細(xì)胞表面分泌有大量的粘液；菌落形態(tài)小而薄，直徑為100-200μm，紫紅色，表面濕潤，極易挑取，細(xì)胞易分散；光學(xué)顯微鏡下可見以二等分裂方式或出芽生殖方式繁殖。
(2)本產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌種的營養(yǎng)及類型本產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌種為兼性厭氧生活方式，但在好氧條件下不產(chǎn)生氫氣，在厭氧光照條件下能分解各種有機(jī)物質(zhì)產(chǎn)生氫氣。
在固體平板培養(yǎng)基表面，接種該菌種后，在厭氧條件下其生長較緩慢，在初期為無色的小菌落，在后期菌落形態(tài)變化不大，但色澤逐漸轉(zhuǎn)化為紫紅色，菌落易于挑取，盡管細(xì)胞產(chǎn)生粘液，但菌種細(xì)胞容易被分散成菌懸液。同時該菌種在好氧條件下也能夠生長，表明該光合細(xì)菌屬于兼性厭氧。該菌種在液體培養(yǎng)基中生長較固體培養(yǎng)基上生長快。
該菌株對底物的利用類型廣泛，能有效分解和利用葡萄糖、酒石酸鈉、乙酸鈉、丙酸鈉等有機(jī)物質(zhì)，表明該菌株利用和代謝這類有機(jī)物質(zhì)的能力較強(qiáng)，其中特別嗜好利用葡萄糖和多種有機(jī)酸，這有利于在環(huán)境污染治理中的應(yīng)用。
該菌種在液體培養(yǎng)基中能利用亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽作電子供體而進(jìn)行緩慢生長，但不能利用硫化物作電子供體。
該菌種能利用多種氮源進(jìn)行生長，但不能代謝利用硝酸鹽的無機(jī)金屬鹽進(jìn)行生長，其中尿素和銨鹽是最適氮源類型。
(3)Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫過程中所需要的培養(yǎng)條件①本菌種產(chǎn)氫過程中對有機(jī)底物的要求研究表明該菌種能利用有機(jī)底物的濃度范圍為1.98-35.64g/l(以葡萄糖為例)，其中適宜底物濃度范圍為11.880-27.72g/l。在特定培養(yǎng)條件下Zn2+、Fe2+對Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫行為有較大影響，本菌種代謝中對Fe2+需求量大，當(dāng)Fe2+達(dá)150μmol/l時產(chǎn)氫量最高。對Zn2+需求量較小，當(dāng)Zn2+為0.031μmol/l時，產(chǎn)氫量最高，較高的Zn2+濃度明顯抑制該菌種的產(chǎn)氫代謝。
②溫度對Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫代謝的影響溫度主要是影響光合細(xì)菌產(chǎn)氫代謝中酶催化活性。在特定培養(yǎng)條件下溫度對Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫性能的影響為溫度為25℃時，本菌種產(chǎn)氫能力最佳，達(dá)53.75mlH2/(100ml culture medium)，溫度低于或高于25℃時，光合細(xì)菌產(chǎn)氫量皆呈下降趨勢，但實際應(yīng)用中還需考慮菌種產(chǎn)氫代謝速率。研究表明本菌種的生長溫度范圍為10-43℃，產(chǎn)氫適宜溫度范圍為20-35℃。
③培養(yǎng)基初始pH值對Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫影響由生化反應(yīng)動力學(xué)可知光合細(xì)菌產(chǎn)氫代謝中酶活性受pH影響較大。在特定培養(yǎng)條件下，當(dāng)初始pH為7、8、9時，Rhodopseudomonas palustrisCQK 01的產(chǎn)氫能力較強(qiáng)，特別是pH值略偏堿性為8時，光合細(xì)菌的產(chǎn)氫能力達(dá)到最大，為33.47mlH2/(100ml culture medium)。因此本菌種能生長的pH范圍為4-9.5，其中有利于Rhodopseudomonas palustris CQK01產(chǎn)氫和生長的適宜pH范圍為6.0-8.5。
同時研究發(fā)現(xiàn)本菌種產(chǎn)氫代謝的發(fā)酵液pH值基本維持在5.0-6.2之間，總體上隨初始pH值的增加而呈增加的趨勢。當(dāng)培養(yǎng)液pH值酸性較強(qiáng)時，菌種可通過物質(zhì)代謝途徑或方向的變化，自動調(diào)節(jié)溶液的pH值，但這種調(diào)節(jié)能力很有限，因為在實驗中發(fā)現(xiàn)當(dāng)pH過于偏酸，培養(yǎng)液中出現(xiàn)大量的死菌，當(dāng)pH值為9時，菌種生長較快，但隨后培養(yǎng)液中很快出現(xiàn)大量死菌，極大地影響本菌種的產(chǎn)氫能力。
④光照強(qiáng)度對Rhodopseudomonas palustris CQK 01生長和產(chǎn)氫性能的影響Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫代謝中需要光能作為驅(qū)動力。研究表明本菌種生長和產(chǎn)氫過程中所需的光照強(qiáng)度為0-9000lx，其中適宜的光照強(qiáng)度為2000-5000lx。特定條件下光照強(qiáng)度對本菌種產(chǎn)氫行為的影響表現(xiàn)為該菌種在黑暗厭氧條件下基本不生長或生長緩慢，當(dāng)光照度為4000lx時，獲得的產(chǎn)氫量達(dá)到最大，為49.57mlH2/(100ml culturemedium)，為最佳的光照度，當(dāng)光照度低于或高于4000lx時，都將限制或抑制光合細(xì)菌生理活動向合成氫氣的方向進(jìn)行。
同時本發(fā)明人利用液體培養(yǎng)基檢測其產(chǎn)氫能力，發(fā)現(xiàn)在獨(dú)特的培養(yǎng)基配方中該菌種才具有較高的產(chǎn)氫能力和生長能力。
(4)Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫過程中的培養(yǎng)基該菌種產(chǎn)氫所用的培養(yǎng)基設(shè)有嚴(yán)格限制，它可以采用現(xiàn)有技術(shù)中一般的組合培養(yǎng)基，但不能得到該菌種最佳的產(chǎn)氫能力，本發(fā)明人通過研究后發(fā)現(xiàn)，根據(jù)該光合細(xì)菌生長所需要的特殊的營養(yǎng)及保證最有利的產(chǎn)氫條件，應(yīng)適當(dāng)添加一定比例的微量元素(如鋅、鉬等)和生長因子。因為元素(鐵、鈣和鎂等)對Rhodopseudomonas palustris CQK 01產(chǎn)氫具有較大的促進(jìn)作用，同時適量的鈣鹽可在一定程度上提高本菌種的生長能力和維持細(xì)胞活性存在，但這類無機(jī)鹽濃度必須遵循本培養(yǎng)基配方嚴(yán)格的限制，否則將影響產(chǎn)氫光合細(xì)菌的生長和產(chǎn)氫能力。另外，由于該菌種缺乏自身合成生長因子的能力，因此在培養(yǎng)基中需要適當(dāng)補(bǔ)充生長因子如生物素、煙酸和牛肉膏等。
本發(fā)明所述菌株Rhodopseudomonas palustris CQK 01在產(chǎn)氫方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢，檢測到該菌種在特定條件下，其產(chǎn)氫能力達(dá)22.32mg·h-1·l-1，國外文獻(xiàn)報道光合細(xì)菌產(chǎn)氫速率一般為0.00518-1.58mg·h-1·l-1，與國內(nèi)外同類光合細(xì)菌菌種產(chǎn)氫能力比較處于前列。同時本菌種的產(chǎn)氫能力通過基因工程還有進(jìn)一步改進(jìn)和提高的潛力。
由于本篩選純化得到的Rhodopseudomonas palustris CQK 01是以有機(jī)底物為碳源、混合多種氮源、無機(jī)鹽及生長因子等而得到，除在產(chǎn)生氫能方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢外，同時能分解有機(jī)物，特別是降低有機(jī)廢水的COD值，研究發(fā)現(xiàn)該菌種對有機(jī)物質(zhì)的分解和利用率最高可達(dá)到98％以上，而文獻(xiàn)報道光合細(xì)菌對底物的轉(zhuǎn)換率最高可達(dá)到80％，因此本菌種在轉(zhuǎn)化和利用有機(jī)底物方面具有很大的優(yōu)勢，同時研究發(fā)現(xiàn)本菌種特別適合分解和利用厭氧發(fā)酵后的有機(jī)廢水，能進(jìn)一步降低廢液中的有機(jī)物含量，取得良好的凈化性能，充分利用了生物質(zhì)能，實現(xiàn)了化害為寶，保護(hù)環(huán)境的目的。因此在環(huán)境保護(hù)和實現(xiàn)資源的可持續(xù)利用方面具有廣闊的應(yīng)用前景和社會價值。
Rhodopseudomonas palustris CQK 01在產(chǎn)氫過程中吸收太陽光能，充分利用太陽光能進(jìn)行自身生長的同時通過能量聚集系統(tǒng)收集和轉(zhuǎn)化能量于氫氣中，研究發(fā)現(xiàn)Rhodopseudomonas palustris CQK 01對太陽光能的轉(zhuǎn)化效率為5.6-11.2％。據(jù)報道輻射到地球上的太陽光能量是地球上最大的可再生能源，約5.7×1024J/年，比人類消耗的總能量的10000倍還多。我國幅員遼闊、日照時間長，特別是廣大的西部地區(qū)具有豐富的太陽光能資源，因此合理而高效地轉(zhuǎn)化和利用太陽光能對可持續(xù)發(fā)展和促進(jìn)西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實施具有重要的意義。本菌種的篩選成功和進(jìn)一步在基因工程、生化工程、化工傳遞和工程熱物理等方面的研究和應(yīng)用將對實現(xiàn)這一戰(zhàn)略奠定良好的基礎(chǔ)。其次，本菌種在環(huán)境保護(hù)方面具有廣闊的應(yīng)用潛力，研究發(fā)現(xiàn)該菌種對有機(jī)物質(zhì)的分解和利用率最高可達(dá)到98％。特別適合分解和利用厭氧發(fā)酵后的有機(jī)廢水，能進(jìn)一步降低廢液中的有機(jī)物含量，取得良好的凈化性能，充分利用了生物質(zhì)能，實現(xiàn)了化害為寶，保護(hù)環(huán)境的目的。
具體實施例方式
實施例(1)采集菌源采集重慶市周邊地區(qū)的農(nóng)田、污水溝等上表層淤泥為菌源，過濾或靜置樣品，收集上清液，顯微鏡下初步鏡檢微生物的種類和數(shù)量分布，發(fā)現(xiàn)有大量的其它雜菌，如念珠藻菌、綠藻等，光合細(xì)菌數(shù)量很少。
(2)光合細(xì)菌的增殖培養(yǎng)取上述上清夜適量分別倒入4只干凈無菌的250ml的三角瓶中(每個菌源各培養(yǎng)2瓶)，同時加入適量新鮮滅菌的培養(yǎng)基于瓶中，充入氬氣排除空氣，貼好標(biāo)簽，進(jìn)行靜置厭氧培養(yǎng)，菌種培養(yǎng)中以日光燈為光源，當(dāng)培養(yǎng)液顏色逐漸變紫紅，在瓶壁上有紅色菌吸附生長時，取適量上述培養(yǎng)液和已滅菌的新鮮培養(yǎng)液加入滅菌的干凈培養(yǎng)瓶中，充入氬氣創(chuàng)造厭氧環(huán)境，進(jìn)行再次光照靜置轉(zhuǎn)化培養(yǎng)，直到光學(xué)顯微鏡下觀察到大量的優(yōu)勢菌種為桿形或橢圓形細(xì)菌為止。
(3)光合細(xì)菌的分離純化主要采用梯度稀釋平板菌落分離法，利用雙層平板固體培養(yǎng)基為菌種的生長繁殖提供厭氧環(huán)境。首先制作基礎(chǔ)營養(yǎng)固體平板，待培養(yǎng)基平板冷卻后分別接種光合細(xì)菌增殖培養(yǎng)液的各梯度稀釋液，待平板表面稍蒸發(fā)后，倒入35-45℃左右的覆蓋培養(yǎng)基，蓋上培養(yǎng)皿皿蓋，正置冷卻。將接種后含雙層固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿置于30℃的光照恒溫培養(yǎng)箱中光照培養(yǎng)4-7天；待長出菌落后，挑選生長快，菌落形態(tài)單一而大、菌落顏色為紅色者為目的菌種，進(jìn)行多次的分離轉(zhuǎn)化，直到得到顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)皆為短桿形或橢圓形的菌落即判定得到純菌種。
(4)光合細(xì)菌的鑒定按照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》(第八版)關(guān)于光合細(xì)菌分類的方法進(jìn)行生理和形態(tài)特征鑒定，同時提取16S rDNA基因序列進(jìn)行分析并與NCBI(TheNational Center for Biotechnology Information，American)上BLASTn中標(biāo)準(zhǔn)菌的基因序列進(jìn)行比對，測得構(gòu)成該菌株該菌株16S rDNA基因序列片段為1453bp，經(jīng)過與NCBI的BLASTn比對分析，發(fā)現(xiàn)該菌株與沼澤紅假單胞Rhodopseudomonas palustris 16srDNA基因序列具有99％以上的同源性。綜合其生理生化和培養(yǎng)特性以及特異基因序列的比對結(jié)果，可以判斷該菌種屬于紅螺菌目、紅螺菌科、紅假單胞菌屬中的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，并命名為Rhodopseudomonas palustrisCQK 01。
(5)本產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌種的保藏本菌種可采用多種方法進(jìn)行保藏，如液體石蠟封藏4℃冰箱保藏、液氮冷凍甘油保藏、砂土保藏等等，一般要求保持厭氧條件以保證該菌種的產(chǎn)氫酶活性。同時使用保藏菌種時，最好將該菌種進(jìn)行一定時期的復(fù)壯或復(fù)活，能進(jìn)一步縮短該菌種在實際應(yīng)用中的延遲期，提高菌種的活性。
權(quán)利要求
1.一種高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌株，其特征為該菌株是沼澤紅假單胞菌(Rhodoseudomonas palustris)CQK 01株，保藏日期是2007年03月01日，其保藏號為CGMCC No.1947。
全文摘要
本發(fā)明是一種高效產(chǎn)氫光合細(xì)菌菌株，屬于紅螺菌目、紅螺菌科、紅假單胞菌屬，種名為沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQK01株，保藏號為CGMCC No.1947。利用本發(fā)明菌株可高效產(chǎn)氫，其產(chǎn)氫能力達(dá)22.32mg·h
文檔編號C02F3/34GK101050443SQ200710078268
公開日2007年10月10日 申請日期2007年3月9日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月9日
發(fā)明者廖強(qiáng), 王永忠, 朱恂, 王中康 申請人:重慶大學(xué)