本發(fā)明涉及納米材料領(lǐng)域，特別涉及一種新型鈣鈦礦量子點的制備方法。

背景技術(shù)：

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展納米材料科學(xué)得到了迅猛的發(fā)展，大量的新型納米材料被開發(fā)，而帶有熒光效應(yīng)的發(fā)光納米材料的量子點更是引發(fā)大量研發(fā)人員的研究。這種體積小、發(fā)光強度高(發(fā)光強度與體積比)、激發(fā)光譜波長特異性高，而且自身還擁有量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)、介電限域效應(yīng)、量子隧道效應(yīng)、庫侖阻塞效應(yīng)等物理特征，使其成為納米材料科學(xué)的研究熱點，被廣泛應(yīng)用于傳感器及生物標記，在電子、電磁、航天、生物、醫(yī)療等方面有巨大的應(yīng)用前景。

例如：量子點特殊的光學(xué)性質(zhì)使得它在生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、藥物篩選、生物大分子相互作用等研究中有極大的應(yīng)用前景。而量子點中低的態(tài)密度和能級的尖銳化，導(dǎo)致了量子點結(jié)構(gòu)對其中的載流子產(chǎn)生三維量子限制效應(yīng)，從而使其電學(xué)性能和光學(xué)性能發(fā)生變化，而且量子點在正入射情況下能發(fā)生明顯的帶內(nèi)躍遷。這些性質(zhì)使得半導(dǎo)體量子點在單電子器件、存貯器以及各種光電器件等方面具有極為廣闊的應(yīng)用前景。

鈣鈦礦結(jié)構(gòu)近年來也是十分受到重視的光電材料，其光吸收率和電子遷移率之高，快速提升太陽能板的光電轉(zhuǎn)換效率。鈣鈦礦的納米特性也比較明顯，鈣鈦礦的三代鹵化物有明亮的激發(fā)光譜，我們這里主要研究的就是鈣鈦礦的納米粒子特性。通過研究鈣鈦礦的納米特性，發(fā)光光譜，發(fā)光機制和鈣鈦礦的基本結(jié)構(gòu)，利用其特性在生化領(lǐng)域進行應(yīng)用研究。

被忽視的生物方面近些年的應(yīng)用十分少，與火熱的電子、電磁、led、航天、能源方面相比簡直是冷淡，但是這并不意味著鈣鈦礦量子點不能再生物領(lǐng)域應(yīng)用，2015年浙江理工大學(xué)的碩士論文里就有有關(guān)鈣鈦礦量子點的醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用，雖然不是直接的生物方面但是這證明在生物方面是有應(yīng)用前景的，只要通過研究一定可以讓鈣鈦礦量子點在生物領(lǐng)域展現(xiàn)它的力量。

而作為新型量子點的鈣鈦礦是近幾年被發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用的，主要的應(yīng)用方向是電子、半導(dǎo)體、電池，薄膜等，尤其是太陽能電池方面尤為火爆，而純粹的納米生物材料應(yīng)用卻是很少的。

在生物上面的主要應(yīng)用是應(yīng)有鈣鈦礦治療骨質(zhì)酥松，而且他們使用的是鈣鈦礦結(jié)構(gòu)的生物材料mtio3(m＝ba，ca，sr)，這是直接使用鈣鈦礦的外形，甚至是直接使用鈣鈦礦，而量子點的性質(zhì)和熒光發(fā)射狀態(tài)是和量子點的結(jié)構(gòu)與表面性質(zhì)有關(guān)，因為兩個的結(jié)構(gòu)相似所以cszncl3這個有明顯的鈣鈦礦性質(zhì)，所以連合成方法都可以參考鈣鈦礦的合成方法。

現(xiàn)有液相高溫合成鈣鈦礦量子點的制備過程中操作復(fù)雜，使用設(shè)備多，造價高，合成的鈣鈦礦發(fā)光量子點，穩(wěn)定性低，發(fā)光效率低，均質(zhì)性差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是要解決上述背景技術(shù)中現(xiàn)有液相高溫合成鈣鈦礦量子點的制備過程中操作復(fù)雜，使用設(shè)備多，造價高，合成的鈣鈦礦發(fā)光量子點，穩(wěn)定性低，發(fā)光效率低，均質(zhì)性差等問題，而提供一種新型鈣鈦礦量子點的制備方法。

本發(fā)明所需的材料如下：

碳酸銫(cs2co3，aldrich，99.9％)，油酸(oa，sigma-aldrich，90％)，十八碳烯(ode，sigma-aldrich，90％)，油胺(oam，acrosorganic，80-90％)，氯化鉛(zncl2，abcr，99.999％)，溴化鉛(znbr2，abcr，98％)，碘化鉛(zni2，abcr，99.999％)，甲苯(分析純)，正己烷(分析純)，丙酮(分析純)，三辛基膦(top，strem，97％)，蒸餾水，乙醇(分析純，95％)；

本發(fā)明所需的器材如下：

一種新型鈣鈦礦量子點的制備方法，包括以下步驟：

1、油酸銫的合成：稱量碳酸銫0.386g，油酸1.27ml，十八碳烯18.73ml，加入到干燥的50ml三頸瓶中，開啟攪拌在80℃下通1h氬氣，然后將溫度升高到150℃，等到碳酸銫全部溶解，將制得的油酸銫裝入干燥的50ml血清瓶中保存；

2、將znbr2：0.0745g，ode：12ml分別加入到干燥的50ml三頸瓶中，開啟攪拌在80℃下通入氬氣1小時，然后將溫度提升到120℃，加入0.5ml油酸和1.5ml油胺(比例為0.5:1.5)，當(dāng)znbr2完全溶解后將溫度提上到180℃快速加入1ml油酸銫原液，反應(yīng)1分鐘后用水浴進行冷卻，完全冷卻至室溫后取出三頸瓶，將反應(yīng)混合溶液倒入干燥的離心管中，然后將15ml甲苯溶液倒入三頸瓶中溶解剩余的反應(yīng)混合溶液后，將甲苯溶液倒入剛剛倒入反應(yīng)混合溶液的離心管中，將其混勻后在8500轉(zhuǎn)下離心10分鐘，離心后將甲苯上清液倒入干燥的血清瓶中，以備觀察，剩余沉淀使用15ml正己烷溶解分散后8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心后將正己烷上清裝入另一個干燥的50ml血清瓶中沉淀使用10ml正己烷分散后裝入第三支50ml血清瓶中，血清瓶使用硅膠墊令其瓶身與瓶蓋之間沒有間隙，防止揮發(fā)或空氣中的成分令其淬滅，同時瓶子使用錫箔紙包起來避光保存以延長熒光壽命，以備長時間的測試和觀察。

配體對量子點制備的影響：

作為配體的油酸和油胺本身并不參與反應(yīng)，但是身為輔助分散試劑的油酸和油胺卻可以影響最后成型量子點的形狀和基本狀態(tài)，影響配體的配位能力、自發(fā)耦合、量子點之間的螯合等因素，可以導(dǎo)致量子點的產(chǎn)量減低，穩(wěn)定性降低，發(fā)光效率降低。

在鈣鈦礦量子點的合成過程中，雖然不同時添加兩種輔助原料也可以合成出鈣鈦礦量子點，但是僅僅一天過后，經(jīng)過兩次高速離心的澄清液體中就會出現(xiàn)大量的白色沉淀物，同時肉眼可見的大幅度降低發(fā)光程度(紫外手電照射下)。

在鈣鈦礦量子點的合成過程中，雖然不同時添加兩種輔助原料也可以合成出鈣鈦礦量子點，但是僅僅一天過后，經(jīng)過兩次高速離心的澄清液體中就會出現(xiàn)大量的白色沉淀物，同時肉眼可見的大幅度降低發(fā)光程度(紫外手電照射下)。

實驗數(shù)據(jù)顯示，全油胺的實驗結(jié)果遠遠好于全油酸的實驗結(jié)果，導(dǎo)致這個的原因來自于油胺的制備。油胺通常由油酸與氨反應(yīng)、脫水再經(jīng)選擇性加氫制得，這導(dǎo)致油胺中含有影響實驗的油酸或是其他胺類物質(zhì)，相比之下油酸中的其他物質(zhì)并不能起到分散劑的作用。

當(dāng)然，與油酸：油胺＝0.5:1.5的數(shù)據(jù)相比，有明顯的下降，故而可以分析出，油酸和油胺的單獨使用遠遠沒有同時使用效果好，同時測定出油酸：油胺＝0.5:1.5時的效果最佳。

溫度對量子點制備的影響：

反應(yīng)時的溫度可以大幅度的影響反應(yīng)過程中的量子點性能，分散后的溶液中含有大量的活性粒子，溫度的高低影響這些離子的運動快慢和碰撞幾率還有耦合幾率。低溫度下離子之間碰撞概率較低，而且即使相互接觸了也不一定可以耦合，(自帶攪拌，所以即使溫度低離子之間還是可以碰撞，只不過各自能量低不一定可以耦合)，而高的溫度雖然使粒子的能量變高，但是過高的溫度和離子速度也大大的增加了離子之間的結(jié)合難度，同時也容易出現(xiàn)配體和配體之間的螯合淬滅，影響量子點的穩(wěn)定性和發(fā)光效率。

鹵素替換對量子點的影響：

影響主要發(fā)光性質(zhì)的就是量子點中的鹵素，為了有多種多樣的量子點顏色必須替換掉原本量子點中的鹵素，或者進行鹵素混合形成cszncl3、csznclxbr(3-x)、csznbr3、csznbrxi(3-x)、cszni3等等混合量子點。

實驗中鹵素是有znx2提供的，而不同的znx2在實驗中的條件是不一樣的，資料中顯示通常情況下需要使用top才能進行反應(yīng)。

但是top的強氧化性會有一些其他影響，同時對實驗本身的操作應(yīng)也增添了很多的負擔(dān)和危險性，同時top的存在也對實驗的擴大有著較大的阻礙，top的添加和儲存對于大規(guī)模工廠化有著較大的影響，無論是管線、設(shè)備、成本(包括設(shè)備成本、材料成本、維護成本)，所以改良條件成了實驗關(guān)鍵。

油酸和油胺都有分散劑的作用，top本身也是輔助分散的作用，前文中提到過經(jīng)過改良的油胺和油酸通過調(diào)節(jié)比例可以提高其分散效率。這里比較的就是用經(jīng)過改進比例的油酸和油胺，取消top的使用。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明的制備方法其操作簡單，實驗器材成本低廉，制備出了具有極好穩(wěn)定性和發(fā)光性能的發(fā)光鈣鈦礦量子點，通過油相合成的無機鈣鈦礦量子點，在較長的時間段內(nèi)可以保持較好的發(fā)光量子點特性，同時也具有較好的紫外吸收，對之后的應(yīng)用也有很好的幫助。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖2是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖3是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖4是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖5是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖6是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖7是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖8是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖9是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖10是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖11是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖12是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖13是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖14是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖15是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖16是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖17是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

圖18是本發(fā)明實驗數(shù)據(jù)示意圖。

具體實施方式

請參閱圖1、圖2、圖3、圖4、圖5、圖6、圖7、圖8、圖9、圖10、圖11、圖12、圖13、圖14、圖15、圖16、圖17和圖18所示，一種液相高溫合成鈣鈦礦量子點的制備方法，包括以下步驟：

1、油酸銫的合成：稱量碳酸銫0.386g，油酸1.27ml，十八碳烯18.73ml，加入到干燥的50ml三頸瓶中，開啟攪拌在80℃下通1h氬氣，然后將溫度升高到150℃，等到碳酸銫全部溶解，將制得的油酸銫裝入干燥的50ml血清瓶中保存；

2、將znbr2：0.0745g，ode：12ml分別加入到干燥的50ml三頸瓶中，開啟攪拌在80℃下通入氬氣1小時，然后將溫度提升到120℃，加入0.5ml油酸和1.5ml油胺(比例為0.5:1.5)，當(dāng)znbr2完全溶解后將溫度提上到180℃快速加入1ml油酸銫原液，反應(yīng)1分鐘后用水浴進行冷卻，完全冷卻至室溫后取出三頸瓶，將反應(yīng)混合溶液倒入干燥的離心管中，然后將15ml甲苯溶液倒入三頸瓶中溶解剩余的反應(yīng)混合溶液后，將甲苯溶液倒入剛剛倒入反應(yīng)混合溶液的離心管中，將其混勻后在8500轉(zhuǎn)下離心10分鐘，離心后將甲苯上清液倒入干燥的血清瓶中，以備觀察，剩余沉淀使用15ml正己烷溶解分散后8000轉(zhuǎn)離心10分鐘，離心后將正己烷上清裝入另一個干燥的50ml血清瓶中沉淀使用10ml正己烷分散后裝入第三支50ml血清瓶中，血清瓶使用硅膠墊令其瓶身與瓶蓋之間沒有間隙，防止揮發(fā)或空氣中的成分令其淬滅，同時瓶子使用錫箔紙包起來避光保存以延長熒光壽命，以備長時間的測試和觀察。

實驗檢測

x射線衍射：

當(dāng)有一束特定波長的單色x射線入射到晶體時，由于晶體本身是由原子規(guī)則排列成的晶胞組成，這些規(guī)則排列的原子間距與射入的x射線波長處于相同數(shù)量級，因此由不同原子散射的x射線相互之間產(chǎn)生干涉效果，在某些獨立方向上產(chǎn)生增強了的x射線，射線在空間上的分布方位和局部強度，與晶體自身結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，每種晶體所產(chǎn)生的衍射波線都能反映出該晶體內(nèi)部的原子分配狀態(tài)。這就是x射線衍射檢測的基本原理[29]。x射線衍射分析是利用晶體形成的x衍射射線，對物質(zhì)進行內(nèi)部原子在空間分布狀況的結(jié)構(gòu)分析的一種方法。就是將具有一定波長的x射線發(fā)射到結(jié)晶后的材料上，由于x射線在結(jié)晶體內(nèi)遇到了一系列呈現(xiàn)規(guī)則排列的原子或離子而發(fā)生散射行為，散射出來的x射線通常是在某些特殊方向上的位移得到加強，從而顯示與結(jié)晶結(jié)構(gòu)相對應(yīng)的特有的衍射現(xiàn)象。1912年勞埃等人根據(jù)理論猜想，并用實驗證實了x射線與晶體相遇時能發(fā)生衍射現(xiàn)象，證明了x射線同樣也具有電磁波的一部分性質(zhì)，這就成為了x射線衍射學(xué)的一個重要的里程碑。

熒光光譜：

熒光顯微鏡(fluorescencemicroscope)：細胞中有些物質(zhì)，如植物體內(nèi)的葉綠素等，在受紫外線照射后就可以發(fā)熒光；另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光抗體或熒光染料染色后，經(jīng)過紫外線照射后它也能夠發(fā)出熒光，熒光顯微鏡就能夠?qū)@類物質(zhì)進行定性和定量研究[30]。熒光顯微鏡是大都以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使其發(fā)出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的所在位置及其形狀，自然界中的紫外線強度較弱，實驗室需用高強度的汞燈激發(fā)產(chǎn)生紫外光束作為光源進行熒光實驗。熒光顯微鏡用于研究細胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等?，F(xiàn)在市面上大多都采用的是200w的超高壓汞燈作光源，它是用石英玻璃制作而成的，中間是球形，里面填充一定數(shù)量的水銀，啟動工作時由兩個電極放電，使得水銀蒸發(fā)產(chǎn)生汞蒸氣，由于球內(nèi)氣壓迅速升高至極限，此時壓力可達到50～70個標準大氣壓，這一過程一般約需10～20min。超高壓汞燈的發(fā)光是正負電極放電使汞分子在解離和還原的過程中不斷發(fā)射光量子造成的結(jié)果。它能夠發(fā)射很強的紫外和藍紫光，這些光束足夠激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，熒光顯微鏡的光源大多都采用它。但是超高壓汞燈在使用的時候也會散發(fā)出大量的熱能，所以汞燈室必須具備有良好的通風(fēng)散熱條件，而且工作環(huán)境溫度不能太高，否則不僅會影響汞燈的使用壽命還有可能會引發(fā)安全事故。

紫外吸收光譜：

用一束具有連續(xù)波長的紫外光照射納米材料，這時紫外光中某些波長的光輻射就可以被納米顆粒吸收，將不同波長的吸收光度記錄下來，以波長λ為橫軸、吸光度a(百分透光率t％)為縱軸作圖，就可獲的納米材料的紫外吸收光譜圖。

紫外光顯微鏡ultravioletmicroscope最初的時候是用來提高光學(xué)顯微鏡的辨別度，由a.kh-ler研發(fā)出來的儀器，而現(xiàn)在又把它拿來當(dāng)作顯微分光光度計在細胞化學(xué)上對核酸局部部位的檢測和定量檢驗時使用。由于辨別度與光的波長成反比，因此可以使用從超高壓汞燈或鹵族燈射出的短波紫外光，光學(xué)系統(tǒng)包括載玻片在內(nèi)，全部是石英制品。而且很多都是反射對物透鏡型的[31]。紫外光顯微鏡是使用波長在350-360nm以下的紫外光形成圖像的顯微鏡，這種顯微鏡最初設(shè)計好以后是用來增大分辨能力，而現(xiàn)在它主要用來對紫外光有選擇吸收物質(zhì)的顯微分光光度測量。

電子透射電鏡：

透射電子顯微鏡(transmissionelectronmicroscope,簡稱tem),可以看到在光學(xué)顯微鏡下無法看清的小于0.2um的細微結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)稱為亞顯微結(jié)構(gòu)或超微結(jié)構(gòu)。要想看清這些結(jié)構(gòu)，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年ruska發(fā)明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡，電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，并且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說電壓越高波長越短。目前tem的分辨力可達0.2nm。

透射電子顯微鏡的成像原理[33]可分為三種情況：吸收像：當(dāng)電子射到質(zhì)量、密度大的樣品時，主要的成相作用是散射作用。樣品上質(zhì)量厚度大的地方對電子的散射角大，通過的電子較少，像的亮度較暗。早期的透射電子顯微鏡都是基于這種原理。衍射像：電子束被樣品衍射后，樣品不同位置的衍射波振幅分布對應(yīng)于樣品中晶體各部分不同的衍射能力，當(dāng)出現(xiàn)晶體缺陷時，缺陷部分的衍射能力與完整區(qū)域不同，從而使衍射波的振幅分布不均勻，反映出晶體缺陷的分布。相位像：當(dāng)樣品薄至以下時，電子可以穿過樣品，波的振幅變化可以忽略，成像來自于相位的變化[32]。

tem系統(tǒng)由以下幾部分組成:[33]電子槍：發(fā)射電子，由陰極、柵極、陽極組成。陰極管發(fā)射的電子通過柵極上的小孔形成射線束，經(jīng)陽極電壓加速后射向聚光鏡，起到對電子束加速、加壓的作用.聚光鏡：將電子束聚集，可用已控制照明強度和孔徑角。樣品室：放置待觀察的樣品，并裝有傾轉(zhuǎn)臺，用以改變試樣的角度，還有裝配加熱、冷卻等設(shè)備。物鏡：為放大率很高的短距透鏡，作用是放大電子像。物鏡是決定透射電子顯微鏡分辨能力和成像質(zhì)量的關(guān)鍵。中間鏡：為可變倍的弱透鏡，作用是對電子像進行二次放大。通過調(diào)節(jié)中間鏡的電流，可選擇物體的像或電子衍射圖來進行放大。透射鏡：為高倍的強透鏡，用來放大中間像后在熒光屏上成像。此外還有二級真空泵來對樣品室抽真空、照相裝置用以記錄影像[32]。

隧道掃描電鏡：

掃描隧道顯微鏡scanningtunnelingmicroscope縮寫為stm。它作為一種掃描探針顯微術(shù)工具，掃描隧道顯微鏡可以讓科學(xué)家觀察和定位單個原子，它具有比它的同類原子力顯微鏡更加高的分辨率。此外，掃描隧道顯微鏡在低溫下(4k)可以利用探針尖端精確操?？v原子，因此它在納米科技既是重要的測量工具又是加工工具。stm使人類第一次能夠?qū)崟r地觀察單個原子在物質(zhì)表面的排列狀態(tài)和與表面電子行為有關(guān)的物化性質(zhì)，在表面科學(xué)、材料科學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域的研究中有著重大的意義和廣泛的應(yīng)用前景，被國際科學(xué)界公認為20世紀80年代世界十大科技成就之一。[34-36]

在掃描隧道顯微鏡(stm)觀測樣品表面的過程中，掃描探針的結(jié)構(gòu)所起的作用是很重要的。如針尖的曲率半徑是影響橫向分辨率的關(guān)鍵因素；針尖的尺寸、形狀及化學(xué)同一性不僅影響到stm圖象的分辨率，而且還關(guān)系到電子結(jié)構(gòu)的測量。因此，精確地觀測描述針尖的幾何形狀與電子特性對于實驗質(zhì)量的評估有重要的參考價值。掃描隧道顯微鏡(stm)的研究者們曾采用了一些其它技術(shù)手段來觀察掃描隧道顯微鏡(stm)針尖的微觀形貌，如sem、tem、fim等。sem一般只能提供微米或亞微米級的形貌信息，顯然對于原子級的微觀結(jié)構(gòu)觀察是遠遠不夠的。雖然用高分辨tem可以得到原子級的樣品圖象，但用于觀察掃描隧道顯微鏡(stm)針尖則較為困難，而且它的原子級分辨率也只是勉強可以達到。只有fim能在原子級分辨率下觀察掃描隧道顯微鏡(stm)金屬針尖的頂端形貌，因而成為掃描隧道顯微鏡(stm)針尖的有效觀測工具。日本tohoku大學(xué)的櫻井利夫等人利用了fim的這一優(yōu)勢制成了fim-stm聯(lián)用裝置(研究者稱之為fi-stm)，可以通過fim在原子級水平上觀測掃描隧道顯微鏡(stm)掃描針尖的幾何形狀，這使得人們能夠在確知掃描隧道顯微鏡(stm)針尖狀態(tài)的情況下進行實驗，從而提高了使用掃描隧道顯微鏡(stm)儀器的有效率[34]。

mtt細胞毒性檢測：

mtt法具體的工作原理：哺乳類動物細胞線粒體中琥珀酸脫氫酶的底物就是mtt，在活細胞內(nèi)，細胞中的線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶能夠?qū)tt還原為難溶于水的紫藍色結(jié)晶狀甲瓚(formazan)，再加上有機物二甲基亞砜(dmso)可以將活細胞內(nèi)的結(jié)晶狀甲瓚釋放到細胞外，且釋放后的溶液顏色的深淺和細胞內(nèi)甲瓚的釋放量成正比，通過測定此時溶液的吸光度就可以定量的測定出甲瓚的含量，由此反應(yīng)出細胞的增殖情況。通過mtt發(fā)(四甲基偶氮唑鹽的簡稱mtt)檢測細胞在生物材料表面上的增殖情況。mtt法是主要是通過定量測量細胞代謝水平，代謝水平高說明細胞增殖快。是一種間接測定活體細胞的方法，現(xiàn)在主要用于評估材料的細胞毒性和細胞增殖。

人成骨肉瘤細胞培養(yǎng)：humanosteosarcomasaos-2cells(atcchtb-85)，在dmem細胞培養(yǎng)基(dulbeccomodifiedeaglesmedium,atcc)中進行傳代，包含5％(ml/ml)胎牛血清(fbs,sigma)、50uml-1青霉素(penicillin,sigma)以及50μgml-1鏈霉素(streptomycin,sigma)，培養(yǎng)條件為36.5℃、2.5％co2與97.5％空氣中恒溫培養(yǎng)。saos-2細胞為毒性實驗以及礦化實驗提供實驗?zāi)Ｐ?。mtt檢測：saos-2細胞密度為10,000個/孔，平均鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中(corninginc)，加入aa、β-gp以及dmso，其終濃度分別為50μgml-1、7.5mm和0.1％，對照組不加入cki，而實驗組加入不同濃度梯度的cki。持續(xù)培養(yǎng)72小時后，先后加入mtt染色液及終止液，利用酶標儀檢測cki對細胞存活率的影響，并以此作為依據(jù)，反映cki的細胞毒性情況；礦化及tnap酶活力分析：saos-2細胞密度為100,000個/孔，平均鋪與12孔細胞培養(yǎng)板中(corninginc)，培養(yǎng)條件與mtt檢測相同。加入不同濃度的cki作為實驗組、持續(xù)給藥7天后，利用茜素紅染色法觀察細胞內(nèi)鈣結(jié)節(jié)形成情況，并反映cki對礦化效應(yīng)的影響。

選擇三種細胞模型(人成骨肉瘤細胞：humanosteosarcomasaos-2cells、小鼠單核巨噬細胞白血病細胞：raw264.7及小鼠骨髓破骨細胞：primaryosteoclasts)，結(jié)合mtt比色法(rochediagnostics,meylan,france)，開展cki對細胞存活率(細胞毒性檢測)影響的測試[21]?？瞻讓φ战M未加入cki，而實驗組中，不同濃度梯度的cki與待測細胞共同培養(yǎng)3天。終止培養(yǎng)后，每孔加入終濃度為0.5mgml-1的mtt標記試劑，36.5℃、2.5％co2與97.5％空氣的恒溫條件下孵育5個小時，隨后，每孔加入100μl溶解液(含有10％sdsg:ml的0.01mhcl溶液)進行過夜反應(yīng)。次日，利用酶標儀(tecaninfinitem200,salzburg,austria)，在波長450nm(檢測波長)與600nm(referencewavelength)下，對待測樣品進行掃描。在雙波長檢測下獲得測試樣品的光吸收度，其數(shù)據(jù)結(jié)果，為450nm與600nm波長差減后所得的歸一化結(jié)果。未加入cki的細胞樣品孔作為空白對照組，其細胞存活率定為100％，細胞存活率與光吸收強度成正比。cki在同一濃度下，平行測試三組，并重復(fù)三次實驗，n＝9。