馬鈴薯瘡痂病菌定量分子檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了馬鈴薯瘡痂病菌的定量分子檢測方法，根據(jù)NCBI GenBank中已登記的馬鈴薯瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守基因序列設(shè)計熒光定量PCR引物，篩選到符合qPCR條件的引物RTA1/RTA2，經(jīng)檢測，其在各測試菌株中的擴(kuò)增結(jié)果穩(wěn)定，片段大小符合要求，并且無引物二聚體形成，可以作為qPCR檢測引物。分別對4種瘡痂病菌測試菌株的孢懸液進(jìn)行定量并提取DNA，稀釋至不同濃度作為模板，利用qPCR技術(shù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對土壤樣品及病組織樣品進(jìn)行測試，結(jié)果表明其可對樣品進(jìn)行定量測定(附圖)。
【專利說明】
馬鈴薯瘡痂病菌定量分子檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測方法的發(fā)明，特別指馬鈴薯瘡痂病致病菌的定量分子檢測方 法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 馬鈴薯瘡痂病對生產(chǎn)的影響日益嚴(yán)重，已經(jīng)引起國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注，該 病的病原菌組成具有明顯的多樣性，國內(nèi)已發(fā)現(xiàn)存在X scabies、51 acit/iscaAies、51 等四種病原(趙偉全等，2006)，對各病原菌進(jìn)行系統(tǒng)分析 后發(fā)現(xiàn)，不同種的菌株間生物學(xué)特點有較大差別(張萌等，2010)。因此對其建立特異性的定 量檢測方法十分必要。
[0003] 對馬鈴薯瘡痂病菌基因組的深入研究發(fā)現(xiàn)合成毒素的致病基因聚集在一個大 的染色體區(qū)域，作為一個致病島存在于鏈霉菌中，包含tiA ixi從等多個基 因。瘡痂病菌的致病性是和致病島密切相關(guān)的[77]。致病島包含了比較大的染色體區(qū)域 (10~200kb)，僅僅出現(xiàn)在致病株的染色體中，而在非致病株不存在 [75'76]。引起瘡痂病的 thaxtomin A的生物合成是在瘡痂病致病種的單基因座（上，和度扁碼合成的 4_硝基吲哚和L-苯丙氨酸具有甲基化和環(huán)化二肽合成酶的功能。
[0004] SYBR Green I染料是一種非飽和菁類熒光素，能非特異性嵌合于DNA雙螺旋結(jié)構(gòu) 的小溝內(nèi)，當(dāng)DNA處于游離狀態(tài)時，熒光信號弱，但是當(dāng)與dsDNA結(jié)合后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)， 可被熒光探測系統(tǒng)檢測到，熒光信號的強(qiáng)弱與初始模板的dsDNA是成比例的，因此可進(jìn)行 核酸的定量分析。在病原菌檢測方面，熒光定量對模板能快速、準(zhǔn)確的定量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一對定量檢測馬鈴薯瘡痂病菌的引物RTA1/RTA2。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種馬鈴薯瘡痂病菌的定量檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：在此研究中對我國存在的四種模式菌株進(jìn)行了孢子基 因組DNA的提取。根據(jù)上述致病島中的不同基因序列設(shè)計了 4對引物，篩選到qPCR引物后 通過對建立各菌株標(biāo)準(zhǔn)曲線條件的摸索，建立了馬鈴薯瘡痂病菌不同菌株孢子的定量檢測 方法。應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線對提取的病組織及帶菌土壤進(jìn)行檢測，證明了所建立標(biāo)準(zhǔn)曲線的重復(fù) 性強(qiáng)，可用性高。同時可以根據(jù)DNA的濃度計算孢子數(shù)。
[0008] 以我國發(fā)現(xiàn)的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： 、CPS-2 (5： 為模式菌株，首先建 立模式菌株中DNA濃度和孢子量的關(guān)系，然后根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇序列 fcriA fcr仿設(shè)計引物。以各菌株孢子基因組DNA為模板篩選瘡痂致病鏈霉菌qPCR的通用 引物。對模式菌株定量孢子提取的DNA進(jìn)行多次的濃度梯度條件摸索，最終篩選到合適的 濃度梯度，為標(biāo)準(zhǔn)曲線建立點的篩選奠定基礎(chǔ)；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取馬鈴薯瘡痂病組織以及 帶有瘡痂病菌的土壤DNA對建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行穩(wěn)定性驗證。
[0009] 本發(fā)明的研究方法包括： A、 平板計數(shù)法定量各菌株孢懸液濃度，提取定量孢子的基因組DNA，建立孢子數(shù)量和 DNA濃度的關(guān)系； B、 qPCR引物的設(shè)計及引物的篩選； C、 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立點的篩選； D、 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及應(yīng)用。
[0010] 設(shè)計的全部引物序列見下表： 表1本研究設(shè)計的引物序列
各菌株不同濃度DNA下的Ct值和換算的孢子數(shù)見下表：
步驟A是用平板計數(shù)法將燕麥固體培養(yǎng)基（OMA)上培養(yǎng)的菌株CPS-1 (5： 、 galilaeiL^)、acidiscabie;^)、turgidiscabie;^)鬼賽 Vd 夭 的孢子用無菌水洗下，把孢懸液進(jìn)行l(wèi)OSloL^O113倍梯度稀釋，取稀釋好的孢懸液50 mL涂 布于燕麥固體培養(yǎng)基上，生長7 d后進(jìn)行平皿計數(shù)，計算出樣品的孢子總數(shù)。用CTAB法提 取一定量菌株孢子的基因組DNA，所提基因組DNA的濃度及各項參數(shù)由紫外分光光度儀測 得，知道濃度后建立孢子數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0011] 步驟B是以步驟A中的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成 基因簇序列（xiA fcr仿設(shè)計四對特異性引物RT1/RT2、RTA1/RTA2、RTB1/RTB2、RTB3/RTB4。 用設(shè)計的引物對模式菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。先將引物稀釋成10 ymol/L。擴(kuò)增反應(yīng) 體系為 50 mL，模板（基因組 DNA) :1 mL;引物：各 1 mL;2XGC buffer II :25 mL;dNTP(2 mM) :1 mL 酶：0? 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL。擴(kuò)增條件為 95°C預(yù)變性 5 min，95°C變性 30 s， 62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30個循環(huán)，最后72°C延伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取4mL的 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠90 V /40 min電泳檢測。PCR產(chǎn)物在2.0 %的瓊脂糖凝膠 電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pGM-T載體上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a上， 在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽性克隆進(jìn)行測序，在國際基因 庫（GenBank)上進(jìn)行序列分析，驗證所得片段并選取效果最好的擴(kuò)增片段作為檢測探針， RTA1/RTA2擴(kuò)增的目的片段測序結(jié)果穩(wěn)定正確，擴(kuò)增的條帶大小符合qPCR所要求的條件， 并且沒有引物二聚體情況。
[0012] 步驟C是根據(jù)步驟B確定好的反應(yīng)條件將所提取的孢懸液DNA稀釋成一樣的濃度 后進(jìn)行 101, 1〇2,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103，6 X 103,8 X 103,104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104,105 倍不同梯度稀釋。確定反應(yīng)體系的最低檢測濃度。并根據(jù)孢懸液和孢懸液DNA的稀釋度計 算引物對病原菌孢子的最低檢測閾值。
[0013] 步驟D是根據(jù)步驟B和C應(yīng)用qPCR的反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立，SYBR Green I qPCR 反應(yīng)體系（10 mL)為：PCR Mix :51mL ;引物：各 0? 2 mL ;模板(孢子 DNA):0. 2 mL;ddH20:4.4 mL。SYBR Green I qPCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性：94°C，5 min;40 個循環(huán)：變性： 94°C，5 s，復(fù)性：62°C，30 s。對樣品進(jìn)行了 12個點的稀釋，但由于后面模板的稀釋度越來 越大，擴(kuò)增曲線的線性關(guān)系不是很明顯，因此，選擇了其中線性關(guān)系比較好的五個點做標(biāo)準(zhǔn) 曲線。采集接種有CPS-1、CPS-4菌株的土壤中提取的DNA進(jìn)行檢測：每土壤樣品稱取5 g 加至裝有5 ml無菌水的離心管中進(jìn)行漩渦振蕩10 min，靜置待土壤顆粒沉淀后，取上清液 離心富集菌體后，用CTAB法提取土壤樣品的總基因組DNA，以其為模板進(jìn)行qPCR以驗證標(biāo) 準(zhǔn)曲線的實用性。
[0014] 采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于：本發(fā)明利用qPCR方法篩選到了擴(kuò)增 結(jié)果穩(wěn)定，片段大小符合要求，并且無引物二聚體形成，可以作為qPCR檢測引物的RTA1/ RTA2。應(yīng)用此引物建立了中國馬鈴薯瘡痂病菌比較常見的幾種病原菌標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了馬 鈴薯瘡痂病菌的定量檢測方法。該工作提高了病原菌檢測的靈敏度，為以后預(yù)防馬鈴薯瘡 痂病的工作奠定了基礎(chǔ)，對馬鈴薯瘡痂病的預(yù)防有較高的實際應(yīng)用價值。
【附圖說明】
[0015] 下面結(jié)合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0016] 圖 1 是對四種模式菌株 CPS-1 (5： scabies), CPS-2 (^. galilaeus), CPS-3 (^. (51 的 PCR 擴(kuò)增結(jié)果； 圖2是菌株CPS-4標(biāo)準(zhǔn)曲線對樣品的檢測。
【具體實施方式】
[0017] 以我國發(fā)現(xiàn)的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： waAid、CPS-2 (5： acit/iscaAies)、CPS-4 (51 為模式菌株，首先建 立模式菌株中DNA濃度和孢子量的關(guān)系，然后根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇序列 fcriA fcr仿設(shè)計引物。以各菌株孢子基因組DNA為模板篩選瘡痂致病鏈霉菌qPCR的通用 引物。對模式菌株定量孢子提取的DNA進(jìn)行多次的濃度梯度條件摸索，最終篩選到合適的 濃度梯度，為標(biāo)準(zhǔn)曲線建立點的篩選奠定基礎(chǔ)；建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，提取馬鈴薯瘡痂病組織以及 帶有瘡痂病菌的土壤DNA對建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行穩(wěn)定性驗證。
[0018] 依據(jù)上述的整體研究思路具體的研究方法包括： 1、平板計數(shù)法定量各菌株孢懸液濃度，提取定量孢子的基因組DNA，建立孢子數(shù)量 和DNA濃度的關(guān)系。用平板計數(shù)法將燕麥固體培養(yǎng)基（OMA)上培養(yǎng)的菌株CPS-1( 5： scabies) > CPS-2 (S. galilaeus) > CPS-3 (S. acidiscabies) > CPS-4 (^. turgidiscabies) 培養(yǎng)10天的孢子用無菌水洗下，把孢懸液進(jìn)行101，102-1〇1(]倍梯度稀釋，取稀釋好的孢懸 液50 mL涂布于燕麥固體培養(yǎng)基上，生長7 d后進(jìn)行平皿計數(shù)，計算出樣品的孢子總數(shù)。用 CTAB法提取一定量菌株孢子的基因組DNA，所提基因組DNA的濃度及各項參數(shù)由紫外分光 光度儀測得，知道濃度后建立孢子數(shù)和濃度之間的關(guān)系。
[0019] 2、qPCR引物的設(shè)計及引物的篩選。是以步驟1中的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根 據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇序列triA fcr仿設(shè)計四對特異性引物RT1/RT2、RTA1/ RTA2、RTB1/RTB2、RTB3/RTB4。用設(shè)計的引物對模式菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。先將引 物稀釋成10 Pmol/L。擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 mL，模板（基因組DNA) :1 mL;引物：各1 mL; 2XGC buffer II :25 mL ;dNTP(2 mM) :1 mL 德：0? 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL。擴(kuò)增條件為 95°C預(yù)變性5 min，95°C變性30 s，62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30個循環(huán)，最后72°C延 伸5 min。擴(kuò)增結(jié)束后，取4mL的擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠90 V /40 min電泳檢測。 PCR產(chǎn)物在2. 0%的瓊脂糖凝膠電泳中進(jìn)行檢測，將PCR產(chǎn)物連接到克隆載體pGM-T載體 上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5 a上，在含有氨芐青霉素的LB平板上37°C培養(yǎng)過夜，挑取3個陽 性克隆進(jìn)行測序，在國際基因庫（GenBank)上進(jìn)行序列分析，驗證所得片段并選取效果最好 的擴(kuò)增片段作為檢測探針，RTA1/RTA2擴(kuò)增的目的片段測序結(jié)果穩(wěn)定正確，擴(kuò)增的條帶大小 符合qPCR所要求的條件，并且沒有引物二聚體情況。
[0020] 3、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立點的篩選。根據(jù)步驟2確定好的反應(yīng)條件將所提取的孢懸液DNA 稀釋成一樣的濃度后進(jìn)行 101，102,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103，6 X 103,8 X 103, 104, 2 X l〇S 4X 104,8X 104，105倍不同梯度稀釋。確定反應(yīng)體系的最低檢測濃度。并根據(jù)孢懸液和孢懸 液DNA的稀釋度計算引物對病原菌孢子的最低檢測閾值。
[0021] 4、標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及應(yīng)用。是根據(jù)步驟2和3應(yīng)用qPCR的反應(yīng)條件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲 線的建立，SYBR Green I qPCR反應(yīng)體系（10 mL)為：PCR Mix :51mL ;引物：各0. 2 mL ;模板 (孢子 DNA):0.2 mL;ddH20:4.4 mL。SYBR Green I qPCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性：94°C，5 min; 40個循環(huán)：變性：94°C，5 s，復(fù)性：62°C，30 s。對樣品進(jìn)行了 12個點的稀釋，但由于后面 模板的稀釋度越來越大，擴(kuò)增曲線的線性關(guān)系不是很明顯，因此，選擇了其中線性關(guān)系比較 好的五個點做標(biāo)準(zhǔn)曲線。采集接種有CPS-1、CPS-4菌株的土壤中提取的DNA進(jìn)行檢測：每 土壤樣品稱取5 g加至裝有5 ml無菌水的離心管中進(jìn)行漩渦振蕩10 min，靜置待土壤顆粒 沉淀后，取上清液離心富集菌體后，用CTAB法提取土壤樣品的總基因組DNA，以其為模板進(jìn) 行qPCR以驗證標(biāo)準(zhǔn)曲線的實用性。
【主權(quán)項】
1. 馬鈴薯瘡痂致病菌株qPCR技術(shù)通用引物的篩選方法，其特征在于：根據(jù)NCBI GenBank中已登記的瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇中的txtA、txtB保守的基因序列設(shè) 計，以不同馬鈴薯瘡痂病致病菌株 CPS_1(S. scabies)、CPS_2(S. galilaeus)、CPS_3(S. acidiscabies)、SHXHZ-3 (S. turgidiscabies) -定量抱子 DNA 為模板，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，篩 選并獲得通用qPCR檢測引物RTA1/RTA2。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，對孢子數(shù)進(jìn)行定量及DNA提取，其特征在于：用平板計 數(shù)法將燕麥固體培養(yǎng)基（OMA)上培養(yǎng)的菌株CPS-1 (5： scabies)、CPS-2 (5： 、 CPS-SI^. acii//6icaZ7ie'6i)、CPS-4(5'. 進(jìn)行計數(shù)：將燕麥固體培養(yǎng)基上培 養(yǎng)10 d的瘡痂病菌孢子用無菌水洗下，把孢懸液進(jìn)行101，102··· 101°倍梯度稀釋，取稀釋好 的孢懸液50 mL涂布于燕麥固體培養(yǎng)基上，生長7 d后進(jìn)行平皿計數(shù)，計算出樣品的孢子總 數(shù)，用CTAB法提取一定量菌株孢子的基因組DNA。3. 根據(jù)權(quán)利要求1和2所述的方法，采用的擴(kuò)增反應(yīng)條件，其特征在于：先將引物稀 釋成10 ymol/L，擴(kuò)增反應(yīng)體系為50 mL，模板（基因組DNA) :1 mL;引物：各1 mL;2XGC buffer II :25 mL ;dNTP(2 mM) :1 mL 成每：0· 7 mL ;ddH20 :20. 3 mL ;擴(kuò)增條件為95°C預(yù)變 性5 min，95°C變性30 s，62°C退火50 s，72°C延伸1 min，30個循環(huán)，最后72°C延伸5 min， 擴(kuò)增結(jié)束后，取4mL的擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%的瓊脂糖凝膠90 V /40 min電泳檢測。4. 根據(jù)權(quán)利要求2和3所述的方法，對模板進(jìn)行進(jìn)行濃度梯度的確定，其特征在于： 將所提取的孢懸液DNA稀釋成一樣的濃度后進(jìn)行10 1，102,4 X 102,8 X 102, 103,4 X 103， 6 X 103,8 X 103, 104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104, 105倍不同梯度稀釋，確定反應(yīng)體系的最低檢測 濃度，并根據(jù)孢懸液和孢懸液DNA的稀釋度計算引物對病原菌孢子的最低檢測閾值。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，建立應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)曲線并進(jìn)行樣品測試，其特征在于：SYBR Green I qPCR 反應(yīng)體系（10 mL)為：PCR Mix :51mL ;引物：各 0· 2 mL ;模板(孢子 DNA):0. 2 mL;ddH20:4.4 mL;SYBR Green I qPCR 反應(yīng)程序：預(yù)變性：94°C，5 min;40 個循環(huán)：變性： 94°C，5 s，復(fù)性：62°C，30 s，分別建立不同致病種的標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線對病 田土壤樣品進(jìn)行檢測，證明建立的定量檢測方法靈敏度好，可用性高。
【文檔編號】C12Q1/68GK106032549SQ201410747149
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月16日
【發(fā)明人】于秀梅, 趙偉全, 郭鳳柳
【申請人】河北農(nóng)業(yè)大學(xué)