一種馬鈴薯瘡痂病菌定性檢測的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了馬鈴薯瘡痂病菌致病菌的快速定性分子檢測方法，以我國發(fā)現(xiàn)的具有代表性的致病菌株CPS-1(S.scabies)、CPS-2(S.galilaeus)、CPS-3(S.acidiscabies)、SHXHZ-3(S.turgidiscabies)為模式菌株，根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇序列txtA、txtB、txtC（P450）、txtD（nos）設計引物，篩選瘡痂致病鏈霉菌的通用引物，篩選到的通用引物B1/B2對馬鈴薯瘡痂病致病菌具有特異性。本發(fā)明設計的對馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌的快速定性檢測方法不僅可用于對馬鈴薯瘡痂病菌DNA的檢測，還可以直接用于對孢懸液以及馬鈴薯瘡痂病組織和土壤中的馬鈴薯瘡痂病菌的檢測，且檢測準確，靈敏度高。
【專利說明】一種馬鈴薯瘡痂病菌定性檢測的方法 【技術領域】
[〇〇〇1] 本發(fā)明屬于分子檢測方法的發(fā)明，特別指馬鈴薯瘡痂病致病菌的分子檢測方法的 建立。 【背景技術】
[0002] 馬鈴薯瘡痂病是由多種植物病原鏈霉菌引起的經(jīng)濟性病害，隨著我國近年來馬鈴 薯生產(chǎn)規(guī)模不斷擴大，瘡痂病的危害也日益嚴重，目前已成為影響種薯生產(chǎn)的主要障礙之 一，有的地區(qū)微型薯的發(fā)病率可達309Γ60%(白曉東，2002)。由于該類病原菌的組成較為復 雜，明確不同地區(qū)病原菌的存在情況是病害防治工作的首要問題，因此建立快速準確的病 原菌檢測方法是當前生產(chǎn)的急需。
[0003] 針對生產(chǎn)中馬鈴薯瘡痂病普遍發(fā)生卻缺乏病原菌檢測方法的實際問題，我們在 前期工作中通過對我國馬鈴薯瘡痂病菌進行采集鑒定，獲得了大量病原菌菌株(趙偉全， 2006)。對病原菌致病因子分析后發(fā)現(xiàn)該類病原可產(chǎn)生特有的致病毒素，且該毒素是瘡痂病 菌侵染過程中的主要致病因子（Goyer C et al，1998;趙偉全，2005)。將毒素合成基因簇 進行克隆和分析后，發(fā)現(xiàn)該基因簇符合致病島（pathogenicity island)的特點，包含trM、 等多個基因。
[0004] 基于PCR技術的快速分子檢測技術是目前研究的熱點，在病原菌的檢測方面具有 較大的應用潛力。該技術具有快速高效，操作簡單，重復性強等優(yōu)點，并可以同時處理大量 樣品，滿足生產(chǎn)的需要。根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素合成基因簇中的不同基因序列設計引物， 通過篩選穩(wěn)定的特異性引物和優(yōu)化反應體系，建立病原菌的分子檢測方法。該工作有助 于快速定性測定從瘡痂病斑和土壤中分離到的瘡痂病原鏈霉菌菌株，縮短病原菌的鑒定周 期，準確地對馬鈴薯瘡痂病菌進行定性檢測，為病害的診斷提供有力依據(jù)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一對檢測馬鈴薯瘡痂病菌的引物Β1/Β2。
[0006] 本發(fā)明的第二個目的在于提供一種馬鈴薯瘡痂病菌的定性檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的整體技術構思是：在此研究中我們采用我國存在的四種模式菌株進行了 基因組DNA的提取。根據(jù)上述致病島中的不同基因序列設計了 4對引物，通過對引物的篩 選找到能檢測瘡痂鏈霉菌的快速分子檢測方法。篩選到引物后，我們也是從瘡痂病組織、帶 菌土壤、非致病菌以及其他非瘡痂病菌等方面對引物進行了驗證，證明了引物的穩(wěn)定性以 及可用性。
[0008] 以我國發(fā)現(xiàn)的具有代表性的致病菌株CPS-1 (5： 、CPS-2 (5： <3--Υ￡//5·--?(95·)、3ΗΧΗΖ-3(5·· 為模式菌株，根據(jù)瘡 痂病菌特有的毒素合成基因簇序列切（/705〇設計引物。然后 以模式菌株基因組DNA為模板篩選瘡痂致病鏈霉菌的通用引物。對模式菌株一定量的孢子 提取的DNA進行梯度稀釋用來測定引物的靈敏度；提取馬鈴薯瘡痂病組織以及帶有瘡痂病 菌的土壤DNA對篩選到的引物進行穩(wěn)定性驗證；提取實驗室保存的其他革蘭氏陽性菌株的 DNA對引物的特異性進行檢測。
[0009] 本發(fā)明的研究方法包括： A、 各菌株基因組DNA的提取和引物的設計； B、 引物的篩選； C、 引物的靈敏度、穩(wěn)定性及特異性檢測。
[0010] 設計的全部引物序列見下表： 表1本研究設計的引物序列
【權利要求】
1. 馬鈴薯瘡痂致病菌株通用引物的篩選方法，其特征在于：根據(jù)瘡痂病菌特有的毒素 合成基因簇序列trM、trii?、trif (/￥5^0、（/705·)設計引物，以不同馬鈴薯瘡痂病致 病菌株 CPS-1 (5： Μ?Μ)、CPS-2 (5： gahVaeiAs)、CPS-3 (5： acii/isciies)、SHXHZ-3 (5： 基因組DNA為模板，進行PCR擴增，篩選并獲得通用檢測引物B1/B2。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，采用的擴增反應條件特征在于：所述的PCR反應體系 為模板 DNA 1000 ng，TaqlO 酶 1 U，100 μπιο? · Γ1 的上、下游引物各 0.5 yL，10 mmol ? Γ1的dNTP 0.5 μ L，2 XGC buffer II緩沖液12. 5 μ L，用無菌蒸餾水補充反應體系至25 yL;PCR反應程序為：95°C預變性5 min;95°C變性30s，62°C退火50s，72°C延伸1 min， 共30個循環(huán)；最后72°C延伸10 min，4°C保存。
3. 根據(jù)權利要求2所述的方法對引物的靈敏度進行檢測，其特征在于用平板計數(shù)法 對病原菌的孢子數(shù)進行定量；將燕麥固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的瘡痂病菌孢子用無菌水洗 下，把孢懸液進行101，1〇2··· 101°倍梯度稀釋，取稀釋好的孢懸液50 μ L涂布于燕麥固體培 養(yǎng)基上，生長7 d后進行平皿計數(shù)，計算出樣品的孢子總數(shù)；提取一定量菌株孢子的基因組 DNA，將所提取的孢懸液DNA稀釋成一樣的濃度后進行101，102,4X 102,8 X 102, 103,4X 103， 6 X 103,8 X 103, 104, 2 X 104,4 X 104,8 X 104, 105倍不同梯度稀釋，用篩選到的引物對不同濃 度的瘡痂病原菌孢懸液DNA進行PCR擴增，確定最低檢測濃度，并根據(jù)孢懸液和孢懸液DNA 的稀釋度計算引物對病原菌孢子的最低檢測閾值。
4. 根據(jù)權利要求2、3所述的方法對樣品進行檢測，其特征在于：經(jīng)CTAB法提取樣品的 基因組后，該方法可對致病菌株、非致病菌株進行有效鑒別，也可對病薯組織、帶菌土壤進 行有效定性檢測。
【文檔編號】C12Q1/68GK104099408SQ201310128374
【公開日】2014年10月15日 申請日期:2013年4月15日 優(yōu)先權日:2013年4月15日
【發(fā)明者】趙偉全, 于秀梅, 郭鳳柳, 劉大群, 張汀 申請人:河北農(nóng)業(yè)大學