一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的組織學(xué)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的組織學(xué)方法，涉及植物組織內(nèi)病原菌檢測領(lǐng)域。本方法適用于調(diào)查蘋果果實內(nèi)潛帶輪紋病菌的皮孔數(shù)量。具體方法為：對于欲檢測的蘋果果實或果實組織在不低于100℃的溫度蒸煮10分鐘以上，剝?nèi)”砥?；剝?nèi)〉谋砥そ?jīng)1%~15%的次氯酸鈉透明5~20分鐘，1%~30%氫氧化鉀或氫氧化鈉浸泡3~5分鐘，0.1%~3%的苯胺藍(lán)水溶液染色3~5分鐘，用20%~80%的甘油作浮載劑制作臨時玻片；在熒光顯微鏡下用315nm~400nm間的紫外光照謝，觀測皮孔內(nèi)面有無被木栓化組織包被的菌絲，從而判定皮孔是否被輪紋病菌侵染。本發(fā)明解決果實輪紋病研究中難以及時檢測輪紋病菌侵染量問題，為輪紋病菌侵染量的早期檢測提供一套簡便、可靠的技術(shù)方法。
【專利說明】
一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的組織學(xué)方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ]本發(fā)明涉及植物組織內(nèi)病原菌的觀測技術(shù)。【背景技術(shù)】
[0002]蘋果輪紋病是蘋果上的重要病害，由子囊菌亞門葡萄座腔菌屬spp.)的真菌侵染所致；病菌主要為害果實和枝干，在環(huán)渤海灣和黃河故道蘋果產(chǎn)區(qū)危害尤為嚴(yán)重。
[0003]輪紋病菌侵染果實，導(dǎo)致輪紋病爛果病，嚴(yán)重影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)，在未套袋果實上，因輪紋病導(dǎo)致的爛果率每年都在5%~30%之間，重病園高達(dá)80%以上，因此，輪紋病是蘋果果實上的重要病害；在套袋果實上，輪紋病菌主要在套袋前侵染，一般年份的病果率不超過5%，但某些年份個別果園的病果率高達(dá)70%。
[0004]蘋果輪紋病菌具有潛伏侵染現(xiàn)象，蘋果輪紋病菌在蘋果落花后就能侵染果實，但病原菌侵染幼果后并不能立即導(dǎo)致果實發(fā)病，而是潛伏在果實內(nèi)，直到8月中旬以后果實才陸續(xù)發(fā)病。
[0005]由于輪紋病菌侵染果實后存在潛伏侵染現(xiàn)象，在輪紋病的研究中，很難通過接種后觀察果實發(fā)病率這一常規(guī)的方法，研究幼果期輪紋病菌的侵染條件、寄主抗性、防治藥劑等等；到目前為止，對于輪紋病菌在蘋果幼果期的侵染條件、侵染規(guī)律、果實的抗病性還了解很少，病原菌侵染檢測已成為限制果實輪紋病研究的瓶頸技術(shù)。
【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對限制果實輪紋病研究的瓶頸問題，本發(fā)明的目的在于提供一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的技術(shù)方法，解決果實輪紋病研究中難以及時檢測輪紋病菌侵染量問題。
[0007]本項發(fā)明采用的技術(shù)原理如下:輪紋病菌在果實上主要通過氣孔和皮孔侵染，病菌侵染時先在皮孔或氣孔內(nèi)生長，形成菌絲和菌落，然后進(jìn)入皮孔下的寄主組織。病菌侵入皮孔組織后能刺激皮孔下薄壁細(xì)胞木栓化，木栓化細(xì)胞抑制了的病菌進(jìn)一步的生長擴展， 使病原菌處于潛伏狀態(tài)。檢查皮孔內(nèi)有無菌絲，可以判斷病菌是否進(jìn)入皮孔；皮孔內(nèi)的菌絲和皮孔下的木栓化組織經(jīng)過處理后，顯微鏡下清晰可見。檢查皮孔下的有無木栓化組織，可以判斷輪紋病菌是否侵入皮孔組織內(nèi)；受侵染皮孔的數(shù)量或百分率，就是病菌的侵染量和侵染百分率。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:對檢測果實進(jìn)行高溫蒸煮處理，剝?nèi)」麑嵄砥?；剝?nèi)〉谋砥そ?jīng)次氯酸鈉透明、強堿浸泡、苯胺監(jiān)染色后，制成臨時玻片；在熒光顯微鏡下經(jīng)紫外光激發(fā)后，觀測皮孔外面有無菌絲，從而確定病菌是否進(jìn)入皮孔；觀測皮孔內(nèi)面有無木栓化的寄主組織，從而確定病菌是否侵入寄主組織。
[0009]具體實施方案如下:(1)取樣:用打直徑1〇~15毫米的打孔器，打取果實組織，放入試管或三角瓶中，在121°C下處理20分鐘，然后用鑷子直接剝?nèi)」麑嵄砥ぃ?2)次氯酸鈉透明:將剝?nèi)〉墓麑嵄砥まD(zhuǎn)入含氯量1%~15%的次氯酸鈉溶液中，透明 5~20分鐘，直到果皮完全透明后，用蒸餾水漂洗2~3分鐘；次氯酸鈉溶液的常用濃度為 10% ；(3)強堿處理:把透明的表皮轉(zhuǎn)入1%~30%的氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液中，浸泡3~5 分鐘，再用蒸餾水漂洗2~3分鐘；氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液的常用濃度為12% ;(4)特色性染色:將強堿處理后的果實表皮轉(zhuǎn)入0.1%~3%的苯胺藍(lán)配水溶液中，染色 3~5分鐘，用蒸餾水漂洗1~2分鐘；苯胺藍(lán)水溶液的常用濃度為0.2% ;(5)制作臨時玻片:將染色的果實表皮轉(zhuǎn)到栽玻片上，正面向上，擺放整齊，滴加2~3 滴20%~80%的甘油水溶液作浮載劑，蓋上蓋玻片，制作臨時玻片；常用甘油水溶液的濃度為 50% ；(6)上鏡觀察:將玻片置于熒光顯微鏡下，用紫外光激發(fā)，紫外光的波長范圍 315~400nm先觀察表皮外側(cè)的皮孔內(nèi)有無典型的輪紋病菌菌絲，記錄帶菌的皮孔數(shù)量，即為帶有輪紋病菌的皮孔數(shù)；然后，取下蓋玻片，將表皮反過來，使內(nèi)面向上，滴加浮載劑后，蓋上蓋玻片，觀察表皮內(nèi)側(cè)皮孔組織內(nèi)有無被木栓化組織包被的菌絲，皮孔內(nèi)面若有木栓化組織包被的菌絲，則該皮孔記為已被輪紋病菌侵染的皮孔。
[0010] 本發(fā)明應(yīng)用效果:應(yīng)用本項發(fā)明技術(shù)能在較短的時間內(nèi)檢測出蘋果果實上是否帶有輪紋病菌，以及帶菌數(shù)量；輪紋病菌是否侵入皮孔組織內(nèi)，以及侵入數(shù)量；病菌檢測不不需要特殊的儀器或設(shè)備，所用試劑都是實驗室常規(guī)試劑。
[0011] 應(yīng)用實例一:2013年7月上旬，用輪紋病菌分生孢子的孢子懸浮液，濃度為105個孢子/毫升，接種富士蘋果果實，果實接種后套塑料袋保濕24小時。接種30天摘取蘋果果實，用直徑10毫米的打孔器，打取蘋果組織，放于三角瓶內(nèi)，在121°C下蒸煮20分鐘，取出后剝?nèi)”砥ぁ內(nèi)”砥し旁?2%的次氯酸鈉溶液中透明10分鐘，蒸餾水中漂洗3分鐘；再轉(zhuǎn)入10%的氫氧化鉀中浸泡5分鐘，蒸餾水漂洗2分鐘；最后轉(zhuǎn)入0.2%苯胺藍(lán)水溶液染色 3分鐘，蒸餾水漂洗1分鐘，用50%甘油水溶液作浮載劑制作臨時玻片。在熒光顯微鏡(萊卡 DM2500)下用波長為365nm的紫外光激發(fā)，可以看到皮孔內(nèi)的菌絲發(fā)黃綠光的熒光，如圖1 所示；皮孔下的木栓化組織發(fā)藍(lán)色熒光，有的能看到典型的菌絲結(jié)構(gòu)，如圖2,圖3和圖4所/_J、i 〇
[0012]【附圖說明】:圖1為10倍的物鏡下果實表皮外側(cè)皮孔內(nèi)輪紋病菌的菌絲；圖2為10 倍鏡下為果實表皮內(nèi)側(cè)皮孔內(nèi)輪紋病菌的菌絲及外圍的木栓化組織；圖3為20倍物鏡下果實表面內(nèi)側(cè)皮孔內(nèi)輪紋病菌的菌絲及菌絲外圍的皮孔組織；圖4為60倍物鏡下菌絲外圍木栓化的細(xì)胞。
【主權(quán)項】
1.一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的組織學(xué)方法，其特征在于:對于欲檢測的 蘋果果實或果實組織先進(jìn)行高溫蒸煮處理，剝?nèi)”砥?；剝?nèi)〉谋砥そ?jīng)次氯酸鈉透明、強堿浸 泡、苯胺監(jiān)染色后，制作臨時玻片；在熒光顯微鏡下經(jīng)紫外光激發(fā)后，觀測果實表皮內(nèi)側(cè)皮 孔內(nèi)有無被木栓化組織包被的菌絲，從而判定皮孔是否被輪紋病菌侵染，帶菌皮孔的數(shù)量 或百分率，就是病原菌的侵染量；所述高溫蒸煮是用不低于100°c的溫度對蘋果果實或果實組織蒸煮10分鐘以上，實驗 室常用12 rc的高溫蒸煮20分鐘；所述次氯酸鈉透明為是將剝?nèi)〉墓麑嵄砥まD(zhuǎn)入含氯量1°/^15%的次氯酸鈉(NaC103)溶 液中，透明5~20分鐘，直到果皮完全透明后，再用蒸餾水漂洗2~3分鐘；次氯酸鈉溶液的常 用濃度為12% ;所述強堿浸泡是把透明的表皮轉(zhuǎn)入1%~30%的氫氧化鉀(KOH)或氫氧化鈉(NaOH)水溶 液中，浸泡3~5分鐘，再用蒸餾水漂洗2~3分鐘；氫氧化鉀或氫氧化鈉水溶液的常用濃度為 10% ；所述苯胺藍(lán)染色是將強堿處理后的果實表皮轉(zhuǎn)入〇.1%~3%的苯胺藍(lán)(Aniline blue) 水溶液中，染色3~5分鐘，用蒸餾水漂洗1~2分鐘；苯胺藍(lán)水溶液的常用濃度為0.5% ;所述制作臨時玻片是將染色的果實表皮轉(zhuǎn)到栽玻片上，擺放整齊，滴加2~3滴20%~80% 的甘油水溶液作浮載劑，蓋上蓋玻片，制作臨時玻片；常用甘油水溶液的濃度為50% ;所述紫外光激發(fā)是用波長315nm~400nm間的紫外光照謝；所述被木栓化組織包被的菌絲是指輪紋病菌侵入果實的皮孔后，刺激皮孔內(nèi)的薄壁細(xì) 胞木栓化，并包被在菌絲周圍，抑制菌絲生長；經(jīng)紫外光激發(fā)后，在熒光顯微鏡下菌絲發(fā)黃 綠熒光，木栓化的組織發(fā)出藍(lán)色熒光，結(jié)構(gòu)明顯，清晰可見。2.權(quán)利要求1所述的一套早期檢測蘋果果實內(nèi)潛伏輪紋病菌的組織學(xué)方法，其特征 是:果實經(jīng)高溫蒸煮后剝?nèi)”砥?，?jīng)透明、強堿處理、染色、制片后，在熒光顯微鏡下用紫外 光激發(fā)后，觀查皮孔內(nèi)面被木栓化組織包被的菌絲。
【文檔編號】C12Q1/04GK106032548SQ201510110688
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月13日
【發(fā)明人】李保華, 董向麗, 王彩霞
【申請人】李保華, 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)