一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及茶籽中茶皂甙純化制備方法，屬于中壓制備色譜方法。其包括：（1）茶籽皂甙提取物制備；（2）中壓制備柱填裝與活化；（3）分離樣品的制備；（4）分離溶劑系統(tǒng)；(5)監(jiān)視及分餾收集。本發(fā)明突破了茶籽皂甙單體純化制備難度大，實(shí)現(xiàn)了整個分離過程計算機(jī)自動控制及在線監(jiān)測，具有快速分離、產(chǎn)物純度高、效率高成本低等特點(diǎn)。在110分鐘內(nèi)分離得到了4種茶籽皂甙成分，能進(jìn)行茶籽皂甙成分大規(guī)模制備，一次上樣量可達(dá)3克，茶籽皂甙純度達(dá)到95.7%以上，為茶籽資源的深度開發(fā)提供重要方法手段。
【專利說明】
一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于茶籽皂甙純化制備方法技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種中壓制備色譜快速分 離純化茶籽皂甙的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 茶籽皂甙是茶樹的重要生物活性成分，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜的五環(huán)三萜類糖苷化合 物，其基本化學(xué)結(jié)構(gòu)由皂甙元、有機(jī)酸和糖體三部分組成，廣泛的存在茶樹的葉、根、花及種 子中。1931年由日本學(xué)者青山新次郎首次從茶籽分離得到茶阜戒(Teasaponin)，經(jīng)過多年 的研究已從茶樹的不同部位分離鑒定出茶皂苷單體56種，在茶皂甙生物活性研究取得令人 鼓舞的成果。茶皂素是一種優(yōu)良的非離子型天然表面活性劑，具有抗菌、溶血、生物激素樣 作用、抑制酒精吸收和保護(hù)腸胃的作用等藥理功能。茶皂素的表面活性已在日化、生物農(nóng) 藥、建材等領(lǐng)域廣泛的應(yīng)用，它的生物活性和藥理方面顯示了誘人應(yīng)用前景。
[0003] 分離純化高純度的茶皂甙技術(shù)是深入研發(fā)其功能活性基礎(chǔ)，高效純化茶皂甙的制 備技術(shù)已成為茶皂素產(chǎn)業(yè)發(fā)展的技術(shù)瓶頸。目前，純化茶皂甙主要方法有重結(jié)晶、沉淀法、 絮凝劑法、柱層析法和濾膜法、大孔樹脂法等，這些方法起到富集純化作用，由于茶皂甙分 子的極性大、化學(xué)結(jié)構(gòu)相近，用常規(guī)的技術(shù)無法得到高純度的茶皂甙單體成分，茶皂素純化 技術(shù)面臨產(chǎn)品純度低、效率低、成本高，操作繁等缺點(diǎn)，難以滿足茶皂素的高端領(lǐng)域如醫(yī)藥、 日用品上應(yīng)用。開發(fā)茶籽皂甙高效制備技術(shù)是推動茶皂素行業(yè)向更高層次的發(fā)展重要支 撐。2011年，費(fèi)學(xué)謙等公開公告號為CN102093461A發(fā)明專利"一種高速逆流色譜純化油茶皂 素的方法"，該方法是利用HSCC單向流體動力學(xué)平衡而建立的液液分配技術(shù)分離油茶皂素， 得總皂苷純度為97%油茶皂素，能較好地將茶皂苷與黃酮、色素等分開得到仍是茶皂素混和 物無法得到單體成分。
[0004] 中壓制備液相色譜(Medium-pressure liquid chromatography, MPLC)為近年流 行起來的一項(xiàng)新型色譜技術(shù)，色譜柱的壓力為70-300psi，介于低壓層析色譜與高壓制備色 譜之間，流量可達(dá)每分鐘數(shù)百毫升，因此其色譜柱大都由耐壓的強(qiáng)化玻璃制成，有較好的耐 壓能力，分離度更高;MPLC有上樣量大、分離更快、產(chǎn)物更純、產(chǎn)率更高、成本低等優(yōu)點(diǎn)，已 實(shí)現(xiàn)計算機(jī)在線控制和監(jiān)測。本發(fā)明為利用中壓制備色譜技術(shù)分離茶籽中的茶皂苷成分制 備方法，能得到高純度的茶皂苷組分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于設(shè)計提供一種中壓制備色譜快速分 離純化茶籽皂甙的方法的技術(shù)方案。
[0006] 所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于包括以下步 驟： 1)茶籽皂甙提取物制備:將采摘的茶果去皮去殼后進(jìn)行烘干、粉碎和脫脂;脫脂茶籽粉 用極性溶劑回流提取，提取液抽濾后，真空濃縮回收溶劑，冷凍干燥得到茶籽皂甙粗提物； 2) 中壓制備柱填裝:將反相C18材料采用干法裝柱，裝于耐壓玻璃柱，將填料放入自動 裝柱器中，氮?dú)饧訅?5~30分鐘直至柱子中的填料不再下降，柱兩端用脫脂棉栓和篩板壓 緊螺栓固定； 3) 中壓色譜制備柱活化:流動相超聲脫氣20~30分鐘后，以較高流速沖洗柱30分鐘后， 以較低流速用不同極性流動相活化分離柱2小時以上； 4) 分離樣品的制備:將茶籽皂甙粗提物用1~10倍體積流動相溶解，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心 后上清液作分離樣品； 5) 分離溶劑系統(tǒng):分別以水：甲醇為溶劑系統(tǒng)，梯度洗脫110分鐘，即以流速為10_50ml/ min, A相為純水、B相為甲醇，洗脫梯度為線性梯度:0~20minB% 15-30%，20~50minB% 30-45%，50~65minB% 45-78%，65~95minB% 78-85%，95~lOOminB% 85-100%，100-110minB% 100%； 6) 監(jiān)視及分餾收集:在220nm波長下監(jiān)視，自動分餾收集器按出峰時間收集相應(yīng)吸收峰 的洗脫液； 7) 純化洗脫液的濃縮干燥:將每個組分液脫液在真空度90-150mbar，溫度為50°C下減 壓濃縮，除去甲醇，待濃縮樣冷卻至室溫，上冷凍干燥機(jī)將濃縮組分凍干。
[0007] 所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步驟 1) 中采摘的茶果去皮去殼后在60°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干，茶籽粉碎至40目，用石油醚或正已 烷脫脂;脫脂茶籽粉用極性溶劑以料液比1:10比例70°C恒溫水浴回流提取3次每次提取3小 時，所述的極性溶劑為85%乙醇。
[0008] 所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步驟 2) 中C18填料為：（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada):50ym。
[0009] 所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于所述的步驟 3) 中較高流速為80~150ml/min，所述的較低流速為3~5 ml/min。
[0010] 本發(fā)明突破了茶籽皂甙單體純化制備難度大，實(shí)現(xiàn)了整個分離過程計算機(jī)自動控 制及在線監(jiān)測，具有快速分離、產(chǎn)物純度高、效率高成本低等特點(diǎn)。在110分鐘內(nèi)分離得到了 4種茶籽皂甙成分，能進(jìn)行茶籽皂甙成分大規(guī)模制備，一次上樣量可達(dá)3克，茶籽皂甙純度達(dá) 到95.7%以上，為茶籽資源的深度開發(fā)提供重要方法手段。
【附圖說明】
[0011]圖1為茶籽皂甙中壓制備分離譜圖； 圖2為中壓放大制備色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0012]以下結(jié)合實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。 實(shí)施例
[0013] -、材料、儀器和試劑 1.實(shí)驗(yàn)材料:茶籽皂甙提取物:皂甙總量為45%; C18填料（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada) :50μηι Biichi中壓制備玻璃柱：〇15mmX230mm (Ν0:28139)，Φ49Χ460 mm 裝柱器Biichi NO:22745 2.主要儀器設(shè)備： BiiCHI MPLC中壓制備系統(tǒng) pump C-615 and UV photometerC-635and control unit C-620 and fraction collector C-660 紫外分光光度計Shimadzu UV-2550 液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent LC/MSD Trap SL 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士 BUchi) 冷凍干燥機(jī)LGJ-50C(北京四環(huán)科學(xué)儀器廠有限公司） 3 .藥品及試劑：甲醇、無水乙醇、95%乙醇均為國產(chǎn)分析純；色譜級甲醇、乙腈（德國 Merk)及三氟乙酸（美國Tedia公司）。
[0014]二、茶籽皂甙分離制備 對茶籽皂甙反相-中壓色譜分離制備參數(shù):分離填料、溶劑系統(tǒng)、上樣量、流速及監(jiān)視波 長等條件進(jìn)行優(yōu)化，在110鐘從茶皂甙提取物中離得到茶籽皂素組分，在監(jiān)視波長220nm實(shí) 現(xiàn)茶籽皂甙快速分離。
[0015] 1.中壓柱的填裝 干法裝柱，將一定量的填料放入自動裝柱器中，5-8kg壓力的氮?dú)饧訅?5-30min直至填 料不再下降，柱兩端用脫脂棉栓和篩板壓緊螺栓固定。裝入填料凈重22.62g。
[0016] 2.中壓柱沖洗活化 C18分離柱，用10%甲醇超聲脫氣30分鐘后，分別以80-150ml/min的流速沖洗30分鐘后， 以3_5ml/min不同極性甲醇沖2小時以上。
[0017] 3.純化過程 稱取樣品200mg，用2mL水充分溶解，注射器進(jìn)樣，流動相A為水，流動相B甲醇;流速： 20mL /min;波長：220nm。洗脫梯度為線性梯度：0 ~20min，B% 15%~30%; 20~50min，B% 30% ~45%; 50~65min，B%45%~78%; 65~95min，B%78%~85%;95~100minB%85_100%， 100-110minB%100%。荼籽皂甙的中壓制備分離譜圖（圖1)。
[0018] 4. C18柱在不同進(jìn)樣量茶皂甙的分離效率 茶阜戒提取物的進(jìn)樣量分別為200 11^、40〇11^、60〇11^、90〇11^測定各分離峰的總阜戒及 得率，比較分離效率。由此可見，隨著進(jìn)樣量增加，8種組分仍能實(shí)現(xiàn)較高的分離度，重復(fù)性 好。
[0019](上表:不同的進(jìn)樣量分離各峰在220nm下的吸光度值） 5.中壓制備放大實(shí)驗(yàn)： 中壓柱子尺寸：Φ27mmX460mm，填料凈重134.7g，3g的茶阜戒提取物上樣，經(jīng)過中壓制 備分離，儀器系統(tǒng)的監(jiān)測、自動收集在220 nm下有吸收的物質(zhì)，每管收集體積為50ml，根據(jù) 色譜峰出峰時間合并洗脫液，減壓濃縮回收提取試劑后，冷凍干燥得到四種主要的茶籽皂 甙組分，放大制備中壓色譜圖如下（圖2)。分別為組分P4: 320 mg，P5: 20 mg，P6: 240mg， ?7:14 1^，四種主要高純度茶籽皂甙品總量為59411^，得率達(dá)19.8%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 茶籽皂甙提取物制備:將采摘的茶果去皮去殼后進(jìn)行烘干、粉碎和脫脂;脫脂茶籽粉 用極性溶劑回流提取，提取液抽濾后，真空濃縮回收溶劑，冷凍干燥得到茶籽皂甙粗提物； 2) 中壓制備柱填裝:將反相C18材料采用干法裝柱，裝于耐壓玻璃柱，將填料放入自動 裝柱器中，氮?dú)饧訅?5~30分鐘直至柱子中的填料不再下降，柱兩端用脫脂棉栓和篩板壓 緊螺栓固定； 3) 中壓色譜制備柱活化:流動相超聲脫氣20~30分鐘后，以較高流速沖洗柱30分鐘后， 以較低流速用不同極性流動相活化分離柱2小時以上； 4) 分離樣品的制備:將茶籽皂甙粗提物用1~10倍體積流動相溶解，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心 后上清液作分離樣品； 5) 分離溶劑系統(tǒng):分別以水：甲醇為溶劑系統(tǒng)，梯度洗脫110分鐘，即以流速為10_50ml/ min, A相為純水、B相為甲醇，洗脫梯度為線性梯度:0~20minB% 15-30%，20~50minB% 30-45%，50~65minB% 45-78%，60~95minB% 78-85%，95~lOOminB% 85-100%，100-110minB% 100%； 6) 監(jiān)視及分餾收集:在220nm波長下監(jiān)視，自動分餾收集器按出峰時間收集相應(yīng)吸收峰 的洗脫液； 7) 純化洗脫液的濃縮干燥:將每個組分液脫液在真空度90-150mbar，溫度為50°C下減 壓濃縮，除去甲醇，待濃縮樣冷卻至室溫，上冷凍干燥機(jī)將濃縮組分凍干。2. 如權(quán)利要求1所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步驟1)中采摘的茶果去皮去殼后在60°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干，茶籽粉碎至40目，用石 油醚或正已烷脫脂;脫脂茶籽粉用極性溶劑以料液比1:10比例70°C恒溫水浴回流提取3次 每次提取3小時，所述的極性溶劑為85%乙醇。3. 如權(quán)利要求1所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步驟2)中C18填料為：（silicycle prac-Technologiue BLCD公司，Canada): 50μηι〇4. 如權(quán)利要求1所述的一種中壓制備色譜快速分離純化茶籽皂甙的方法，其特征在于 所述的步驟3)中較高流速為80~150ml/min，所述的較低流速為3~5 ml/min。
【文檔編號】C07H15/256GK106008649SQ201610305434
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月10日
【發(fā)明人】俸春紅, 夏曉萍, 金壽珍, 王國慶, 陳妮妮, 袁海波, 張建勇, 董春旺, 李佳, 鄧余良, 滑金杰
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所