用于預(yù)防或治療fxr-介導(dǎo)疾病的膽烷酸化合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及了一種用于預(yù)防或治療FXR?介導(dǎo)疾病的膽烷酸化合物。具體地，該發(fā)明公開了式（I）所示的膽烷酸化合物以及含有該化合物、或其晶型、藥學(xué)上可接受的鹽、前藥、互變異構(gòu)體和立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、水合物或溶劑合物的藥物組合物。本發(fā)明所述化合物可作為法尼醇X受體激動劑，進而可適用于制備治療FXR相關(guān)疾?。ㄈ缰靖蔚龋┑乃幬?。
【專利說明】
用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)疾病的膽烷酸化合物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明涉及一種用于預(yù)防或治療FXR-介導(dǎo)疾病的 膽烷酸化合物及其藥物組合物及用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 法尼醇X受體(FXR)是孤兒核受體家族成員，最早由Forman等于1995年發(fā)現(xiàn)，因其 轉(zhuǎn)錄活性可被超生理濃度的法尼醇增強而命名。Northern和原位分析顯示FXR在肺，腸，腎， 和腎上腺中大量表達。FXR與9-順式維生素 A酸受體(RXR)形成異源二聚體與DNA結(jié)合。FXR/ RXR異源二聚體優(yōu)先與由共有AG(G/T)TCA的雙核受體半位點組成的成分結(jié)合，其形成反向 重復(fù)并祓單一核苷分離（IR-1模體）。然而，這些化合物無法激活小鼠和人類FXR，使得內(nèi)源 性FXR配基的自然性還不確定。一些自然發(fā)生的膽酸在生理濃度下結(jié)合并激活FXR。作為FXR 配基的膽酸包括鵝脫氧膽酸(CDCA)，脫氧膽酸(DCA)，石膽酸(LCA)，和這些膽酸的牛磺酸及 氨基乙酸共輒物。
[0003] 膽酸是在肝臟中形成并分泌入十二指腸的膽固醇代謝產(chǎn)物，其在食物脂肪和維生 素的溶解和吸收中具有重要作用。膽酸下調(diào)細胞色素 P4507a(CYP7a)的轉(zhuǎn)錄，其編碼催化膽 酸生物合成限速步驟的酶。數(shù)據(jù)顯示FXR與膽酸對CYP7a表達的抑制有關(guān)，雖然精確的機制 仍未明確。FXR在相應(yīng)配體、協(xié)同活化因子及激素的調(diào)控下，對膽汁酸代謝的多種酶和膽鹽 載體進行精密的調(diào)控。近年來發(fā)現(xiàn)生理濃度的多種初級和次級膽汁酸可激活FXR，例如，鵝 去氧膽酸(chenodexycholic acid，Q)CA)是常用的一種天然激動劑。6_EO)CA(50-3a，7α-二 羥基-6α-乙基-膽烷酸)作為⑶CA的衍生物，是一種潛在的高效FXR激動劑，比⑶CA高兩個數(shù) 量級。
[0004] 原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)是一種常見的自身免疫性肝膽疾病，主要發(fā)生于40歲 以上的中年女性，發(fā)病率為0.1% WBC與膽汁淤積有關(guān)，主要由膽汁攝取、合成或分泌障礙 引起，也可因膽道梗阻形成，并逐步發(fā)展為肝內(nèi)小膽管炎癥損傷，最終導(dǎo)致硬化。目前，熊去 氧膽酸是Π )Α唯一批準用于治療PBC的藥物，它能夠有效改善肝臟異常生化指標的水平，并 降低肝纖維化和肝硬化的發(fā)病率。INT-747是一種新型藥物，研究用于那些對舊標準治療藥 物熊去氧膽酸沒有充分應(yīng)答或不能耐受的患者。該藥物已被美國FDA授予孤兒藥資格，若獲 得上市批準，它將獲得7年的市場專營權(quán)。
[0005] G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)受體是一種G蛋白偶聯(lián)受體，其已經(jīng)被識別為是一種細胞 表面受體，對膽汁酸（BA)進行應(yīng)答。在人類、牛、兔、大鼠、以及小鼠的G蛋白偶聯(lián)受體5 (TGR5)之間，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了所述的TGR5所具有的一級結(jié)構(gòu)以及它對膽汁酸所產(chǎn)生的應(yīng)答性是 高度保守的，并且因此提示了TGR5具有重要的生理學(xué)功能。
[0006] TGR5與環(huán)化腺核苷一磷酸(CAMP)的細胞內(nèi)積累有關(guān)，其中所述的CAMP在各種不同 的細胞類型中進行廣泛的表達。盡管所述的這種膜受體在巨噬細胞中所具有的活化作用能 夠降低促炎性細胞因子的生成，但是膽汁酸在脂肪細胞以及肌細胞中造成的所述的TGR5的 刺激作用能夠增加能量的消耗。后一種作用涉及到所述的2型碘化鉀腺氨酸脫碘酶(D2)的 cAMP依賴性誘導(dǎo)作用，這種誘導(dǎo)作用通過局部的將T4轉(zhuǎn)化成T3的方式引起增加的甲狀腺激 素的活性（參見Maruyama，T.等人于2006年在J. Endocrinol《內(nèi)分泌學(xué)雜志》191，197-205中 發(fā)表的文章）。據(jù)此，TGR5是一種用于進行代謝疾病的治療的有吸引力的靶向作用，其中所 述的代謝疾病可以是，肥胖癥，糖尿病以及代謝綜合癥。
[0007] 氘代修飾是改進藥物代謝性質(zhì)的一種有潛在吸引力的策略。氘是氫的安全、穩(wěn)定、 非輻射性的同位素。與C-H鍵相比，氘與碳形成的C-D鍵因為振動頻率較低，所以較強。此外， 藥物的"重氫"型式可能對降解更穩(wěn)定且在生物體內(nèi)維持更長時間。并入氘來代替氫可改善 藥物的藥效學(xué)和藥代動力學(xué)概況，改變代謝歸宿，同時保持生理學(xué)活性化合物的藥理活性 和選擇性。氘化藥物可對安全性、功效及耐受性都有正面影響，具有優(yōu)良的研究前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種用于預(yù)防或治療由FXR或者TGR5介導(dǎo)疾病的取代的膽烷 酸化合物及其藥物組合物及用途。
[0009] 對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 本發(fā)明的第一方面中，提供了一種式（I)所示的膽烷酸化合物，或其晶型、藥學(xué)上 可接受的鹽、水合物或溶劑化合物。
[0011
[0021] 作為本發(fā)明的進一步改進，1?21、1?22、1?23、1?24、1? 25、1?26、1?27、1?28各自獨立地為氘或氫。
[0022] 作為本發(fā)明的進一步改進，乂1、#4344可獨立選自一次或多次氘代的烷基。
[0023] 在另一選例中，#、1?2、1?3、1?4、1?5是氘。
[0024] 在另一選例中，
[0025] 在另一選例中，R17、R18是氘。
[0026] 在另一選例中，R19、R2°是氘。
[0027] 在另一選例中，1?21、1?22、1?23、1?24、1? 25、1?26、1?27、1?28是氘。
[0028] 在另一選例中，所述化合物選自如下組化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，但不局限 于下列化合物：
[0029]
[0030；
[0031]
[0032]
[0033]
[0034]
[0035] 反應(yīng)在另一優(yōu)選例中，氘在氘代位置的氘同位素含量至少是大于天然氘同位素含 量(0.015% )，較佳地大于30%，更佳地大于50%，更佳地大于75%，更佳地大于95%，更佳 地大于99 %。
[0036] 具體地說，在本發(fā)明中 R1、!?2、!?3、!?4、!?5、!? 6、!?7、!?8、!?9、!^、!?11、!? 12、!?13、!?14、!?15、!?16、 尺 17、1?18、1?19、1?2()、1?21、1? 22、1?23、1?24、1?25、1?26、1? 27、1?28和1?29各氘代位置中氘同位素含量至少是5%， 較佳地大于10%，更佳地大于15%，更佳地大于20%，更佳地大于25%，更佳地大于30%，更 佳地大于35 %，更佳地大于40%，更佳地大于45 %，更佳地大于50 %，更佳地大于55%，更佳 地大于60%，更佳地大于65 %，更佳地大于70%，更佳地大于75 %，更佳地大于80 %，更佳地 大于85 %，更佳地大于90 %，更佳地大于95 %，更佳地大于99 %。
[0037]在另一優(yōu)選例中，式（I)中化合物的R Κ1、!?2、!?3、!?4、!?5、!? 6、!?7、!?8、!?9、!^、!?11、!? 12、!?13、 1?14、1?15、1?16、1?17、 1?18、1?19、1?2()、1?21、1?22、 1?23、1?24、1?25、1?26、1?27、 1?28和1?29，至少其中一個1?含氘，更佳 地兩個R含氘，更佳地三個R含氘，更佳地四個R含氘，更佳地五個R含氘，更佳地六個R含氘， 更佳地七個R含氘，更佳地八個R含氘，更佳地九個R含氘，更佳地十個R含氘，更佳地十一個R 含氘，更佳地十二個R含氘，更佳地十三個R含氘，更佳地十四個R含氘，更佳地十五個R含氘， 更佳地十六個R含氘，更佳地十七個R含氘，更佳地十八個R含氘，更佳地十九個R含氘，更佳 地二十個R含氘，更佳地二十一個R含氘，更佳地二十二個R含氘，更佳地二十三個R含氘，更 佳地二十四個R含氘，更佳地二十五個R含氘，更佳地二十六個R含氘，更佳地二十七個R含 氘，更佳地二十八個R含氘，更佳地二十九個R含氘。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述化合物不包括非氘代化合物。
[0039] 在本發(fā)明的第二方面中，提供了一種制備藥物組合物的方法，包括步驟:將藥學(xué)上 可接受的載體與本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或 溶劑合物進行混合，從而形成藥物組合物。
[0040] 在本發(fā)明的第三方面中，提供了一種藥物組合物，它含有藥學(xué)上可接受的載體和 本發(fā)明第一方面中所述的化合物，或其晶型、藥學(xué)上可接受的鹽、水合物或溶劑合物。
[0041] 可用于本發(fā)明藥物組合物中的藥學(xué)上可接受的載體包括但不限于任何助流劑、增 甜劑、稀釋劑、防腐劑、染料/著色劑、矯味增強劑、表面活性劑、潤濕劑、分散劑、崩解劑、助 懸劑、穩(wěn)定劑、等滲劑、溶劑或乳化劑。
[0042] 本發(fā)明藥物組合物可配制成固態(tài)、半固態(tài)、液態(tài)或氣態(tài)制劑，如片劑、丸劑、膠囊 劑、粉劑、顆粒劑、膏劑、乳劑、懸浮劑、溶液劑、栓劑、注射劑、吸人劑、凝膠劑、微球及氣溶膠 等。
[0043] 給予本發(fā)明藥物組合物的典型途徑包括但不限于口服、直腸、透黏膜、經(jīng)腸給藥， 或者局部、經(jīng)皮、吸入、腸胃外、舌下、陰道內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、靜脈內(nèi)給藥。 優(yōu)選口服給藥或注射給藥。
[0044] 本發(fā)明的藥物組合物可以采用本領(lǐng)域周知的方法制造，如常規(guī)的混合法、溶解法、 制粒法、制糖衣藥丸法、磨細法、乳化法、冷凍干燥法等。
[0045] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
[0046]本文中，如無特別說明，"鹵素"指F、Cl、Br、和I。更佳地々原子選自F、C1和Br。
[0047] 本文中，如無特別說明，"氘代"指化合物或基團中的一個或多個氫被氘所取代;氘 代可以是一取代、二取代、多取代或全取代。術(shù)語"一個或多個氘代的"與"一次或多次氘代" 可互換使用。
[0048] 本文中，如無特別說明，"非氘代的化合物"是指含氘原子比例不高于天然氘同位 素含量(0.015 %)的化合物。
[0049] 本發(fā)明還包括同位素標記的化合物，等同于原始化合物在此公開?？梢粤袨楸景l(fā) 明的化合物同位素的例子包括氫，碳，氮，氧，磷，硫，氟和氯同位素，分別如 2h，3h，13c，14c， 15N， 170，180，31P，32P，35S， 18F以及36C1。本發(fā)明中的化合物，或?qū)τ丑w，非對映體，異構(gòu)體，或藥 學(xué)上可接受的鹽或溶劑化物，其中含有上述化合物的同位素或其他其他同位素原子都在本 發(fā)明的范圍之內(nèi)。本發(fā)明中某些同位素標記化合物，例如3H和14c的放射性同位素也在其中， 在藥物和底物的組織分布實驗中是有用的。氚，即 3H和碳-14,即14C，它們的制備和檢測比較 容易，是同位素中的首選。同位素標記的化合物可以用一般的方法，通過用易得的同位素標 記試劑替換為非同位素的試劑，用示例中的方案可以制備。
[0050] 藥學(xué)上可接受的鹽包括無機鹽和有機鹽。一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與酸形成 的鹽。適合形成鹽的酸包括但并不限于:鹽酸、氫溴酸、氫氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等無機酸； 甲酸、乙酸、三氟乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富馬酸、馬來酸、乳酸、蘋果酸、酒石酸、 檸檬酸、苦味酸、苯甲酸、甲磺酸、乙磺酸、對甲苯磺酸、苯磺酸、萘磺酸等有機酸；以及脯氨 酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等氨基酸。另一類優(yōu)選的鹽是本發(fā)明化合物與堿形成的鹽， 例如堿金屬鹽(例如鈉鹽或鉀鹽）、堿土金屬鹽(例如鎂鹽或鈣鹽）、銨鹽(如低級的烷醇銨鹽 以及其它藥學(xué)上可接受的胺鹽），例如甲胺鹽、乙胺鹽、丙胺鹽、二甲基胺鹽、三甲基胺鹽、二 乙基胺鹽、三乙基胺鹽、叔丁基胺鹽、乙二胺鹽、羥乙胺鹽、二羥乙胺鹽、三羥乙胺鹽，以及分 別由嗎啉、哌嗪、賴氨酸形成的胺鹽。
[0051] 本發(fā)明化合物可具有手性中心，例如，手性碳原子。本發(fā)明化合物因此包括所有立 體異構(gòu)體的外消旋混合物，包括對映體、非對映體和阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體。另外，本發(fā)明化合物包括 在任意或全部不對稱手性原子上的富集的或拆分的旋光異構(gòu)體。換句話說，從描述中顯而 易見的手性中心被作為手性異構(gòu)體或外消旋混合物提供。外消旋混合物和非對映的混合 物，以及實質(zhì)上不含它們的對映或非對映的配偶體、分離或合成的單獨旋光異構(gòu)體，全部落 在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。通過已知技術(shù)，例如，分離用旋光活性的助劑例如，酸或堿形成的 非對映的鹽，接著轉(zhuǎn)回為旋光活性物質(zhì)，外消旋混合物被分離成他們的單個的、實質(zhì)上光學(xué) 純的同分異構(gòu)體。在大多數(shù)情況下，想得到的旋光異構(gòu)體是通過立體特異反應(yīng)，從希望的原 料的適宜立體異構(gòu)體開始進行合成的。
[0052] 術(shù)語"溶劑合物"指本發(fā)明化合物與溶劑分子配位形成特定比例的配合物。"水合 物"是指本發(fā)明化合物與水進行配位形成的配合物。
[0053]優(yōu)選地，所述FXR或者TGR5介導(dǎo)的疾病或狀況選自慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血 管疾病，淤膽失調(diào)，代謝疾病;優(yōu)選地，所述腎病為糖尿病腎病;所述心血管疾病選自動脈硬 化，血脂障礙，高膽固醇血癥，高甘油三酯血癥，其中動脈硬化為動脈粥樣硬化。
[0054]在特定實施方案中，F(xiàn)XR或者TGR5介導(dǎo)的疾病或狀況是心血管疾病，動脈粥樣硬 化，動脈硬化，高膽留醇血，高血脂慢性肝炎疾病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，代謝疾病， 癌癥(例如，結(jié)直腸癌），或神經(jīng)跡象如中風。
[0055] 在特定實施方案中，慢性肝病是原發(fā)性硬化，腦腱性黃瘤癥，原發(fā)性硬化性膽囊 炎，藥物導(dǎo)致的膽汁郁積，妊娠肝內(nèi)膽汁淤積癥，腸外吸收相關(guān)膽汁郁積，細菌過度生長或 膿血癥膽汁郁積，自身免疫肝炎，慢性病毒性肝炎，酒精性肝病，非酒精性脂肪肝疾病，非酒 精性脂肪性肝炎，肝移植相關(guān)移植物抗宿主病，活供體肝移植再生，先天性肝纖維化，膽總 管結(jié)石，肉芽性肝病，肝內(nèi)-或外惡性腫瘤，Sjogren綜合征，結(jié)節(jié)病，Wilson's疾病， Gaucher ' s疾病，血色病，或血壓腎病，慢性腎小球炎，慢性移植性腎小球病，慢性間質(zhì)性腎 炎，或多囊腎病。
[0056] 在特定實施方案中，心血管疾病是動脈硬化癥，動脈硬化，血脂障礙，高膽固醇血 癥，或高甘油三酯血癥。
[0057]在特定實施方案中，代謝疾病是胰島素抗性，I型和II型糖尿病，或肥胖。
[0058]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明化合物可用于活化法尼醇X受體， 間接抑制細胞色素7A1(CYP7A1)的基因表達，促進膽酸的合成。此外本發(fā)明化合物同時能夠 更好地調(diào)節(jié)G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)。通過氘化這一技術(shù)改變化合物在生物體中的代謝，使 化合物具有更好的藥代動力學(xué)參數(shù)特性。在這種情況下，可以改變劑量并形成長效制劑，改 善適用性。用氘取代化合物中的氫原子，由于其氘同位素效應(yīng)，能夠提高化合物在動物體內(nèi) 的藥物濃度，以提高藥物療效。用氘取代化合物中的氫原子，由于某些代謝產(chǎn)物被抑制，可 能提高化合物的安全性。
【具體實施方式】
[0059] 下面更具體地描述本發(fā)明式I結(jié)構(gòu)化合物的制備方法，但這些具體方法不對本發(fā) 明構(gòu)成任何限制。本發(fā)明化合物還可以任選將在本說明書中描述的或本領(lǐng)域已知的各種合 成方法組合起來而方便地制得，這樣的組合可由本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地進行。
[0060] 通常，在制備流程中，各反應(yīng)通常在惰性溶劑中，在室溫至回流溫度(如0°C~100 °C，優(yōu)選0°C~80°C)下進行。反應(yīng)時間通常為0.1小時-60小時，較佳地為0.5-24小時。
[0061 ] 實施例1制備3α，7α-二-羥基-7-d-6f3-乙基-513-膽烷酸(化合物7)
[0062]
[0063]具體合成步驟如下：
[0064]
[0065]
[0066] 步驟1 :α-羥基-7-酮基-5β_膽烷酸甲酯(化合物2)的合成。
[0067] 將兩滴濃硫酸滴加到3α-羥基-7-酮基-5β_膽烷酸（5.00g，12.80mmol)的甲醇中、 回流反應(yīng)(65〇C)3hrs。減壓濃縮除去甲醇，濃縮液柱層析得到4.60g無色固體(化合物2)，收 率:88.3%〇
[0068] LC-MS(APCI):m/z = 405.3[M+l] + 〇
[0069] 步驟2 :α-7α-二-三甲基甲硅烷氧基-5β_膽烷酸甲酯(化合物3)的合成。
[0070] -78°C下，將三甲基氯硅烷（7.15mL，57.0mmol)滴加到二異丙氨基鋰（LDA 2Μ， 34.2mL，68.4mmol)的無水四氫呋喃（70mL)溶液中，攪拌30分鐘。然后將3α-羥基-7-酮基-5 β-膽燒酸甲酯(2.30g，5.7mmo 1)的無水四氫咲喃(30mL)混合物在15min內(nèi)滴加到反應(yīng)液中， 反應(yīng)液在-78 °C下繼續(xù)攪拌反應(yīng)1.5小時。加入三乙胺（15mL，103mmo 1)，反應(yīng)液在-78 °C下繼 續(xù)攪拌反應(yīng)1.5小時。將反應(yīng)升溫至-20°C，加入飽和的碳酸氫鈉溶液(20mL)，緩慢升溫至室 溫，攪拌2小時。有機層分離，水相用乙酸乙酯（100mL X 3)萃取。合并有機層用飽和碳酸氫 鈉溶液(l〇〇mL X 3)，水(100mL)，飽和食鹽水(100mL)洗滌。無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機 層，濃縮液柱層析得到3.8g米白色固體，產(chǎn)率:100 %。
[0071] 步驟3:3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷酸甲酯(化合物4)的合成。
[0072] -60°C下，將三氟化硼乙醚（BF3 · 0Et2，14mL，110mmol)緩慢滴加到3α-7α-二-三甲 基甲娃烷氧基-5β-膽燒酸甲酯(6.15g，llmmol)和乙醛（1.5mL，37. llmmol)的無水二氯甲燒 (70mL)混合物中。反應(yīng)液在-60°C下，攪拌反應(yīng)2.5小時，升溫至室溫。用飽和碳酸氫鈉溶液 (50mL)淬滅反應(yīng)。有機層分離，水相用二氯甲烷(50mL X 3)萃取。合并有機層用飽和食鹽水 (50mL)洗滌。無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到1.8g油狀物，產(chǎn)率： 33.3%〇
[0073] LC-MS(APCI):m/z = 431·3[M+1] +。
[0074] 步驟4: 3α-羥基-6β-乙基-7-酮基-5β_膽烷酸甲酯(化合物5)的合成。
[0075] 將Pd/C(10 %，90mg)加入到3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β_膽烷酸甲酯（900mg， 2.09mmol)的無水四氫咲喃和無水甲醇(30mL, 1: lv/v)的混合溶劑中。氫氣置換空氣，氫氣 下攪拌反應(yīng)過夜。硅藻土過濾，減壓濃縮，濃縮液柱層析純化得到630mg淡黃色油狀物，產(chǎn) 率:70.0%〇
[0076] LC-MS(APCI):m/z = 433.3[M+l] + 〇
[0077] 步驟5:3α-羥基-6β-乙基-7-酮基-5β_膽烷酸(化合物6)的合成。
[0078] 將氫氧化鈉（205mg，3 · 50mmol)加入到3α-羥基-6β-乙基-7-酮基-5β-膽烷酸甲酯 (630mg, 1.46mmol)的甲醇和水（20mL, 1: lv/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪拌過夜，減壓除去甲 醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽和食鹽水洗 滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到430mg白色固體，產(chǎn)率： 70.0%〇
[0079] LC-MS(APCI):m/z = 417.3[M-l] -。
[0080] 步驟6: 3α，7α-二-羥基-7-d-6f3-乙基-5β-膽烷酸(化合物7)的合成。
[0081 ] 將硼氘化鈉（195mg，5. OOmmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-乙基-7-酮基-5 β-膽烷酸(21 Omg，0.50mmo 1)的氘代甲醇-d (5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng) 液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽和食鹽水洗 滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到130mg白色固體，產(chǎn)率： 62.0%〇
[0082] LC-MS(APCI):m/z = 420.3[M-l] -。
[0083] 實施例2制備3α,7α-二-羥基-6β-(乙基-1-d)-5f3-膽烷酸(化合物10)
[0084]
10
[0085] 具體合成步驟如下：
[0086]
[0087] 步驟1:3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-6-d_7-酮基-5β_膽烷酸甲酯(化合物8)的合成。
[0088] 將Pd/C(10%，55%in D20,60mg)加入到3α-羥基-6-亞乙基-7-酮基-5β-膽烷酸甲 酯(600mg, 1.39mmol)的無水四氫咲喃和氖代甲醇（20mL, 1: lv/v)的混合溶劑中。氖氣置換 空氣，氘氣下攪拌反應(yīng)過夜。硅藻土過濾，減壓濃縮，濃縮液柱層析純化得到420mg淡黃色油 狀物，產(chǎn)率:70.0%。
[0089] LC-MS(APCI):m/z = 435.3[M+l] + 〇
[0090] 步驟2:3€1-羥基-60-(乙基-1-(1)-7-酮基-50-膽烷酸(化合物9)的合成。
[0091] 將氫氧化鈉（120mg，2 · 90mmol)加入到 3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-6-d-7-酮基-5β- 膽烷酸甲酯(420mg，0.97mmo 1)的甲醇和水(20mL，1:1 v/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪拌過夜，減 壓除去甲醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽和 食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到270mg白色固體，產(chǎn) 率:66.4%。
[0092] LC-MS(APCI):m/z = 418.1[M-l] -。
[0093] 步驟3: 3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1 -d) -5β_膽烷酸(化合物10)的合成。
[0094] 將硼氫化鈉（17〇1^，5.50臟〇1)在冰浴下，分批加入到3€1-羥基-6|3-(乙基-1-(1)-7- 酮基-5β-膽烷酸(230mg，0.55mmo 1)的無水甲醇(5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。將 反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL x3)，有機層用飽和食鹽 水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到70mg白色固體，產(chǎn)率： 30.3%〇
[0095] LC-MS(APCI):m/z = 420.3[M-l] -。
[0096] 實施例3制備3α,7α-二-羥基-613-乙基-6-d_5f3-膽烷酸(化合物12)
[0097]
[0098]具體合成步驟如下：
[0099]
[muu」 步驟1:加-控.--邱-乙
膽炕酸（化甘物11)的甘成。
[0101] 將氘氧化鈉（120mg，2.90mmol)加入到3α-羥基-6β-乙基-7-酮基-5β-膽烷酸甲酯 (420mg，0.97mmol)的氘代甲醇和重水(20mL，1: lv/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪拌過夜，減壓除 去甲醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽和食鹽 水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到280mg白色固體，產(chǎn)率： 68.8%〇
[0102] LC-MS(APCI):m/z = 418.1[M-l] -。
[0103] 步驟3: 3α，7α-_羥基(乙基-1-(1)-5β-膽燒酸(化合物12)的合成。
[0104] 將硼氫化鈉(260mg，6.60mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-7-酮基-5β-膽烷酸(280mg，0.66mmo 1)的無水甲醇(5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)過夜。將 反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL x3)，有機層用飽和食鹽 水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到70mg白色固體，產(chǎn)率： 25.2%。
[0105] LC-MS(APCI):m/z = 420.3[M-l] -。
[0106] 實施例4制備3α，7α-二-羥基-6f3-(乙基-1 -d)-6-d-5f3-膽烷酸(化合物14)
[0107]
[0108] 具體合成步驟如下：
[0109]
v. 13
[0110] 步驟1: 3α-羥基-6β-(乙基-1 -d) -6-d-7-酮基-5β-膽烷酸(化合物13)的合成。
[0111] 將氘氧化鈉（150mg，3 · 52mmol)加入到 3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-6-d-7-酮基-5β-膽燒酸甲酯（510mg, 1.17mmol)的氖代甲醇和重水（10mL，1: lv/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪拌 過夜，減壓除去甲醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層 用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到490mg白色 固體，產(chǎn)率:95.0%。
[0112] LC-MS(APCI):m/z = 419.1[M-l] -。
[0113] 步驟2: 3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1 -d) -6-d-5f3-膽烷酸(化合物14)的合成。
[0114] 將硼氫化鈉（225mg，6.00mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-6-d-7-酮基-5β-膽燒酸（250mg，0.60mmo 1)的無水甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)過 夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽 和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到53mg白色固體， 產(chǎn)率:21.0%。
[0115] LC-MS(APCI):m/z = 421.4[M-l] -〇
[0116] 實施例5制備3〇,7(1-二-羥基-7-(1-60-(乙基-1-(1)-6-(1-50-膽烷酸(化合物15)
[0117]
[0118]具體合成步驟如下：
[0119] u
IS
[0120] 將硼氘化鈉（225mg，6.00mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1-d)-6-d-7-酮基-5β-膽烷酸（250mg，0.60mmo 1)的氘代甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng)過 夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽 和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到31mg白色固體， 產(chǎn)率:12.3%。
[0121] LC-MS(APCI) :m/z = 422 · 4[M-1 ]-。
[0122] 實施例6制備3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)_5f3-膽烷酸(化合物19)
[0123] 19
[0124] 具體實施步驟如下：
[0125]
[0126] 步驟1: 3α-羥基-6-(亞乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5β_膽烷酸甲酯（化合物16)的 合成。
[0127] -60°C下，將三氟化硼乙醚(BF3 · 0Et2,7.20mL，11.4mmol)緩慢滴加到3α-7α-二-三 甲基甲娃烷氧基-5β-膽燒酸甲酯(3.10g，5.70mmol)和氖代乙醛-d4( 1. OOmL)的無水二氯甲 烷(58mL)混合物中。反應(yīng)液在-60°C下，攪拌反應(yīng)2.5小時，升溫至室溫。用飽和碳酸氫鈉溶 液(50mL)淬滅反應(yīng)。有機層分離，水相用二氯甲烷(50mL x3)萃取。合并有機層用飽和食鹽 水(50mL)洗滌。無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到1.3g油狀物，產(chǎn) 率:52.5%〇
[0128] LC-MS(APCI) :m/z = 435 · 5[M+1 ] +。
[0129] 步驟2: 3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5β-膽烷酸甲酯(化合物17)的合 成。
[0130] 將Pd/C(10%，118mg)加入到3α-羥基-6-(亞乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5β_膽烷 酸甲酯（1.188,2.721111]1〇1)的無水四氫咲喃和無水甲醇（3〇1]11^，1:1￥八）的混合溶劑中。氫氣 置換空氣，氫氣下攪拌反應(yīng)過夜。硅藻土過濾，減壓濃縮，濃縮液柱層析純化得到900mg淡黃 色油狀物，產(chǎn)率:75.8%。
[0131] LC-MS(APCI):m/z = 437.4[M+l] + 〇
[0132] 步驟3: 3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5β_膽烷酸(化合物18)的合成。
[0133] 將氫氧化鈉（192mg，4 · 80mmol)加入到 3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5 β-膽燒酸甲酯(600mg，1.37mmol)的甲醇和水(20mL，1: lv/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪拌過夜， 減壓除去甲醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用飽 和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到360mg白色固體， 產(chǎn)率:62.2%。
[0134] LC-MS(APCI):m/z = 421.3[M-l] -〇
[0135] 步驟4: 3α，7α-二羥基-6β_(乙基-1，2，2，2-d4)-乙基-5β_膽烷酸(化合物19)的合 成。
[0136] 將硼氫化鈉（160mg，4. lOmmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2， 2-d4)-7-酮基-5β-膽燒酸（175mg，0.41mmol)的無水甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反 應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層 用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到1 l〇mg白色 固體，產(chǎn)率:60.5%。
[0137] LC-MS(APCI):m/z = 423.3[M-l] -。
[0138] 實施例7制備3α，7α-二-羥基-7-d-6f3-(乙基-1，2，2，2-d4)_5f3-膽烷酸(化合物 20)
[0139]
[0140] 具體合成步驟如下：
[0141]
[0142] 將硼氘化鈉（174mg，4. lOmmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2， 2-d4)-7-酮基-5β-膽燒酸（175mg，0.4lmmol)的氖代甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反 應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層 用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到85mg白色固 體，產(chǎn)率:48.5%。
[0143] LC-MS(APCI):m/z = 424.3[M-l] -。
[0146] 具體合成步驟如下：[0147]
[0144] 實施例8制備3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)_6-d-5f3-膽烷酸（化合物 22)
[0145] ? 21
22
[0148] 步驟1: 3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)_6-d-7-酮基-5β_膽烷酸(化合物21)的合 成。
[0149] 將氫氧化鈉(97mg，2 · 36mmol)加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮基-5 β-膽燒酸甲酯（300mg，0.68mmol)的氖代甲醇和重水（10mL，1: lv/v)的混合溶劑中，反應(yīng)攪 拌過夜，減壓除去甲醇，用水(20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機 層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到150mg白 色固體，產(chǎn)率:51.8%。
[0150] LC-MS(APCI):m/z = 422.3[M-l] -。
[0151 ]步驟2: 3α，7α- -羥基(乙基-1，2，2，2-d4)_6-d -50-膽燒酸(化合物22)的合 成。
[0152] 將硼氫化鈉（134mg，3.50mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，2，2， 2-d4) -6-d_7-酮基-5β-膽燒酸（150mg，0.35mmol)的無水甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪 拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有 機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到25mg灰 色固體，產(chǎn)率:16.8%。
[0153] LC-MS(APCI):m/z = 424.3[M-l] -。
[0154] 實施例9 制備3α，7α-二-羥基-7-d-6f3_(乙基-1，1，2，2，2-d5)-6-d_5f3-膽烷酸(化 合物25)
[0155]
25
[0156] 具體合成步驟如下：
[0157]
[0158] 步驟1: 3α-羥基-6β_(乙基-1，1，2，2，2_d5) -6-d-7-酮基-5β_膽烷酸甲酯（化合物 23)的合成。
[0159] 將Pd/C(10 %，50 % in D20，110mg)加入到3α-羥基-6-(亞乙基-1，2，2，2-d4)-7-酮 基-5β-膽燒酸甲酯（1.1 Og，2.53mmo 1)的無水四氫咲喃和氖代甲醇(30mL，1:1 v/v)的混合溶 劑中。氘氣置換空氣，氘氣下攪拌反應(yīng)過夜。硅藻土過濾，減壓濃縮，濃縮液柱層析純化得到 840mg無色油狀物，產(chǎn)率:76.0 %。
[0160] LC-MS(APCI):m/z = 439.4[M+l] + 〇
[0161] 步驟2: 3α-羥基-6β-(乙基-1，1，2，2，2-d5)-6-d_7-酮基-5β_膽烷酸(化合物24)的 合成。
[0162] 將氖氧化鈉（96mg，2.40mmol)加入到 3α-羥基-6β-(乙基-1，1，2,2,2-d5)-6-d_7-酮基-5β-膽燒酸甲酯（300mg，0.68mmo 1)的氖代甲醇和重水（1 OmL，1:1 v/v)的混合溶劑中， 反應(yīng)攪拌過夜，減壓除去甲醇，用水（20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3 )，有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到 260mg白色固體，產(chǎn)率:90.1%。
[0163] LC-MS(APCI):m/z = 423.3[M-l] -。
[0164]步驟3 : 3α，7α-二-羥基-7_(1-6β-(乙基-1，1，2，2，2_d5)-6_(1-5β-膽烷酸（化合物 25)的合成。
[0165] 將硼氘化鈉（134mg，3 · 50mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，1，2， 2，2-d5)-6-d-7-酮基-5β-膽烷酸（150mg，0 · 35mmo 1)的氘代甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下 攪拌反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)， 有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到70mg 白色固體，產(chǎn)率:46.8%。
[0166] LC-MS(APCI):m/z = 426·3[M-1]-。
[0167] 實施例10制備3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1，1，2，2，2_d5)-5β-膽烷酸(化合物27)
[0168]
[0169] 具體合成步驟如下：
[0170]
[0171] 步驟1: 3α-羥基-6β_(乙基-1，1，2，2，2-d5)_7-酮基-5β_膽烷酸（化合物26)的合 成。
[0172] 將氫氧化鈉(85mg，2 · 04mmol)加入到 3α-羥基-6β-(乙基-1，1，2，2，2-d5)-6-d-7-酮基-5β-膽燒酸甲酯（255mg，0.58mmo 1)的氖代甲醇和重水（10mL，1:1 v/v)的混合溶劑中， 反應(yīng)攪拌過夜，減壓除去甲醇，用水（20mL)稀釋，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3 )，有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到 220mg白色固體，產(chǎn)率:86.2%。
[0173] LC-MS(APCI):m/z = 422.3[M-l] -。
[0174] 步驟2: 3α，7α-二-羥基-6β-(乙基-1，1，2，2，2_d5 )-5β_膽烷酸(化合物27)的合成。
[0175] 將硼氫化鈉（200mg，5 · 20mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β_(乙基-1，1，2， 2，2-d5)-7-酮基-5β-膽烷酸（220mg，0.52mmo 1)的無水甲醇（5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌 反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機 層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到120mg白 色固體，產(chǎn)率:53.5%。
[0176] LC-MS(APCI):m/z = 424.3[M-l] -。
[0177] 實施例 11 制備3α，7α-二-羥基-7-d-6f3_(乙基-1，1，2，2，2-d5)_5f3-膽烷酸(化合 物28)
[0178]
[0179] 具體合成步驟如下：
[0180]
[0181] 將硼氘化鈉(80mg，1.90mmol)在冰浴下，分批加入到3α-羥基-6β-(乙基-1，1，2，2， 2-d 5) -7-酮基-5β-膽烷酸(80mg，0.19mmo 1)的氘代甲醇(5mL)中，反應(yīng)液在室溫下攪拌反應(yīng) 過夜。將反應(yīng)液倒入20mL的冰水中，用2N HC1酸化后，乙酸乙酯萃取(50mL X 3)，有機層用 飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。減壓濃縮有機層，濃縮液柱層析純化得到40mg淡黃色固 體，產(chǎn)率:49.5%。
[0182] LC-MS(APCI):m/z = 425.4[M-l] -。
[0183] 生物活性測試。
[0184] 法尼酯X受體(FXR)以及G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)的體外活性測試。
[0185] 法尼酯X受體(FXR)的體外活性測試。
[0186] 通過熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)檢測對在FXR上的活性進行評價，其中所述的FRET 用以檢測所述的SRC-1肽在人類FXR中的募集，其中使用到一種不含有細胞的酶聯(lián)免疫吸附 檢測(ELISA)。
[0187] G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)的體外活性測試。
[0188] 在中國倉鼠卵巢(CH0)細胞中對熒光素酶的活性進行測定，其中所述的CH0細胞穩(wěn) 定的表達人類G蛋白偶聯(lián)受體5(hTGR5)，或者所述的細胞被利用一個hTGR5表達載體以及一 個由cAMP應(yīng)答性元件(CRE)驅(qū)動的熒光素酶受體基因進行了瞬間的共轉(zhuǎn)染。具體方法如下。 [0189] 質(zhì)粒:從1鮮;[1：1'08611(031'18匕3(1，0六)處獲得了所述的美國國立衛(wèi)生研究院(1'11!0哺 乳動物基因保藏克隆MGC: 40597(也被稱之為pCMVSP0RT6/hTGR5或者pTGR5)以及pcDNA 3.1 (環(huán)化腺核苷一磷酸應(yīng)答性元件驅(qū)動的熒光素酶受體質(zhì)粒）以及pCMVi3是從 Clontech(Palo Alto，CA)處獲得的。
[0190]瞬間轉(zhuǎn)染:將中國倉鼠卵巢(CH0)細胞以3.5xl04個細胞/孔的密度放置于96孔培 養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24小時，并且在此之后在每一個孔內(nèi)利用150納克的人類(h)G蛋白偶聯(lián)受體5 表達質(zhì)粒(pCMVSP0RT6/hTGR5)以及100納克的環(huán)化腺核苷一磷酸（cAMP)應(yīng)答性元件(CRE) 驅(qū)動的熒光素酶報告質(zhì)粒(pCRE-Luc)進行轉(zhuǎn)染，其中在所述的轉(zhuǎn)染中依照制造商的說明書 使用Lipofectamine 2000試劑（Invitrogen)。經(jīng)過6小時的培養(yǎng)之后，利用磷酸鹽緩沖的生 理鹽水(PBS)對細胞進行一次洗滌并且將培養(yǎng)基調(diào)換為含有0.1% (重量/體積)的牛血清白 蛋白（BSA)的DMEM。又經(jīng)過了 18小時的培養(yǎng)之后，利用每一種化合物的不同濃度對細胞進行 5小時的處理，其中所述的化合物存在于含有0.1% (重量/體積)的牛血清白蛋白（BSA)的新 鮮的DMEM之中。經(jīng)過處理之后，通過一個冷凍-解凍循環(huán)利用50微升的裂解緩沖液(25毫摩 的Tris鹽酸(pH7.6)，2毫摩的乙二胺四乙酸(EDTA)，1毫摩的二硫蘇糖醇(DTT)，10% (體積/ 體積）的丙三醇以及1% (體積/體積）的Triton X-100)對所述的細胞進行裂解并且按照下 文中所描述的方法使所述的細胞進行熒光素酶的檢測。
[0191] 熒光素酶檢測以及β_半乳糖苷酶檢測：為了進行熒光素酶檢測，將20微升的細胞 裂解液與100微升的熒光素酶反應(yīng)緩沖液235微摩的蟲熒光素，265微摩的三磷酸腺苷(ΑΤΡ) 以及135微摩的輔酶A(CoA)進彳丁混合并且利用CentroXS3LB960(Berthold Technologies， Bad Wildbad，德國）對發(fā)光性進行測定。為了進行β-半乳糖苷酶檢測，將10微升的細胞裂解 液與100微升的緩沖液Ζ [ 60毫摩的磷酸氫二鈉，10毫摩的氯化鉀，1毫摩的硫酸鎂，50毫摩的 β-巰基乙醇以及0.75毫克/毫升的鄰硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(0NPG)]進行混合并且在 37°C下進行0.5至3小時的培養(yǎng)。通過添加50微升的終止緩沖液(1Μ的碳酸鈉)對反應(yīng)進行終 止并且在420納米下對所述的光學(xué)密度進行測定。
[0192] 建立能夠穩(wěn)定的表達人類G蛋白偶聯(lián)受體5的中國倉鼠卵巢（CH0)細胞（CH0-TGR5cells):使用Lipofectamin 2000,利用3.8微克的1^61?5表達質(zhì)粒（口01^5?01^6/ 1^61?5)，3.8微克的〇41^應(yīng)答性元件(〇^)驅(qū)動的熒光素酶報告質(zhì)粒(？〇^-1^(3)以及0.4微 克的新霉素抵抗的基因表達質(zhì)粒[pcDNA3.1( + )]對中國倉鼠卵巢(CH0)細胞進行轉(zhuǎn)染。利用 400微克/毫升的G418硫酸鹽對所述的轉(zhuǎn)染體進行篩選并且使單一的克隆物獨立的生長在 96孔培養(yǎng)板內(nèi)。通過生命周期評價(LCA)的處理方式對表達G蛋白偶聯(lián)受體5(TGR5)的中國 倉鼠卵巢(CH0)細胞系進行篩選，在此之后進行熒光素酶的檢測。
[0193] 50%有效濃度(EC5Q)以及效率的測定:在每一種條件下以一式三份或者一式四份 的方式進行檢測。通過概率單位分析來確定EC 5Q值。通過下述方式對效率進行測定：對于 TGR5激動劑的研究而言，通過計算10微摩的石膽酸(LCA)的數(shù)值的百分含量的方式。在進行 了運算法則的轉(zhuǎn)換之后，完成了對平均的EC 5Q的計算以及對各種不同的化合物所具有的 EC5〇所進行的比較。
[0194] 實驗結(jié)果如下表1所示，說明本發(fā)明化合物同INT-747相比，能夠更好地活化法尼 酯X受體(FXR)和G蛋白偶聯(lián)受體5 (TGR5)。
[0195] 表1實施例化合物對FXR受體和TGR5受體的作用
[0196]
[0197] 代謝穩(wěn)定性評價。
[0198] 微粒體實驗：人肝微粒體：0 · 5mg/mL，Xenotech ;大鼠肝微粒體：0 · 5mg/mL， Xenotech;輔酶(NADPH/NADH): lmM，Sigma Life Science;氯化鎂：5mM，100mM磷酸鹽緩沖劑 (pH為7.4)。
[0199] 儲備液的配制:精密稱取一定量的實施例化合物，并用DMSO分別溶解至5mM。
[0200] 磷酸鹽緩沖液（10OmM，pH7.4)的配制：取預(yù)先配好的0.5M磷酸二氫鉀15OmL和 700mL的0.5M磷酸氫二鉀溶液混合，再用0.5M磷酸氫二鉀溶液調(diào)節(jié)混合液pH值至7.4，使用 前用超純水稀釋5倍，加入氯化鎂，得到磷酸鹽緩沖液（100mM)，其中含100mM磷酸鉀，3.3mM 氯化鎂，pH為7.4。
[0201] 配制NADPH再生系統(tǒng)溶液(含有6.5mM NADP，16.5mM G-6-P，3U/mL G-6-P D，3.3mM 氯化鎂），使用前置于濕冰上。
[0202]配制終止液:含有50ng/mL鹽酸普萘洛爾和200ng/mL甲苯磺丁脲（內(nèi)標）的乙腈溶 液。取25057.5yL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至50mL離心管中，分別加入812.5yL人肝微粒體，混 勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝微粒體稀釋液。取25057.5yL磷酸鹽緩沖液(pH7.4)至 50mL離心管中，分別加入812.5yL SD大鼠肝微粒體，混勻，得到蛋白濃度為0.625mg/mL的肝 微粒體稀釋液。
[0203]樣品的孵育：用含70 %乙腈的水溶液將相應(yīng)化合物的儲備液分別稀釋至0.25mM， 作為工作液，備用。分別取398yL的人肝微粒體或者大鼠肝微粒體稀釋液加入96孔孵育板中 (N=2)，分別加入2yL 0.25mM的的工作液中，混勻。
[0204] 代謝穩(wěn)定性的測定：在96孔深孔板的每孔中加入300yL預(yù)冷的終止液，并置于冰 上，作為終止板。將96孔孵育板和NADPH再生系統(tǒng)置于37 °C水浴箱中，100轉(zhuǎn)/分鐘震蕩，預(yù)孵 5min。從孵育板每孔取出80yL孵育液加入終止板，混勻，補充20yL NADPH再生系統(tǒng)溶液，作 為Omin樣品。再向孵育板每孔加入80yL的NADPH再生系統(tǒng)溶液，啟動反應(yīng)，開始計時。相應(yīng)化 合物的反應(yīng)濃度為ΙμΜ，蛋白濃度為0.5mg/mL。分別于反應(yīng)10、30、90min時，各取100yL反應(yīng) 液，加入終止板中，渦旋3min終止反應(yīng)。將終止板于5000Xg，4°C條件下離心10min。取100yL 上清液至預(yù)先加入l〇〇yL蒸餾水的96孔板中，混勻，采用LC-MS/MS進行樣品分析。
[0205]數(shù)據(jù)分析:通過LC-MS/MS系統(tǒng)檢測相應(yīng)化合物及內(nèi)標的峰面積，計算化合物與內(nèi) 標峰面積比值。通過化合物剩余量的百分率的自然對數(shù)與時間作圖測得斜率，并根據(jù)以下 公式計算tl/2和CLint，其中V/M即等于1/蛋白濃度。
[0206]
[0207]買驗結(jié)采如卜表2所不，本友明化合物在人肝微粒體與大鼠肝微粒體實驗中都表 現(xiàn)出優(yōu)異的代謝穩(wěn)定性。
[0208]表2實施例化合物肝微粒代謝作用
[0209]
[0210] 大鼠中的藥代動力學(xué)評價。
[0211 ] 6只雄性Sprague-Dawley大鼠，7-8周齡，體重約210g，分成2組，每組3只，經(jīng)靜脈或 口服單個劑量的化合物(經(jīng)靜脈3mg/kg，口服10mg/kg)，比較其藥代動力學(xué)差異。
[0212] 大鼠采用標準飼料飼養(yǎng)，給予水。試驗前16小時開始禁食。藥物用PEG400和二甲亞 砜溶解。眼眶采血，采血的時間點為給藥后〇 . 083小時，0.25小時、0.5小時、1小時、2小時、4 小時、6小時、8小時、12小時和24小時。
[0213] 大鼠吸入乙醚后短暫麻醉，眼眶采集300yL血樣于試管。試管內(nèi)有30yLl%肝素鹽 溶液。使用前，試管于60°C烘干過夜。在隨后一個時間點血樣采集完成之后，大鼠乙醚麻醉 后處死。
[0214] 血樣采集后，立即溫和地顛倒試管至少5次，保證混合充分后放置于冰上。血樣在4 °C5000rpm離心5分鐘，將血漿與紅細胞分離。用移液器吸出100yL血漿到干凈的塑料離心管 中，表明化合物的名稱和時間點。血漿在進行分析前保存在-80°C。用LC-MS/MS測定血漿中 本發(fā)明化合物的濃度。藥代動力學(xué)參數(shù)基于每只動物在不同時間點的血藥濃度進計算。 [0215]實驗結(jié)果如下表3所示，相對于對照化合物INT-747,本發(fā)明化合物19的口服利用 率大幅度提高，說明其在動物體內(nèi)具有更好的藥物動力學(xué)。
[0216] 表3大鼠藥代動力學(xué)實驗
[0217]

[0218] 應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍，實施例中未 注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說 明，否則份數(shù)和百分比為重量份和重量百分比。
[0219] 以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實施方式對本發(fā)明所作的進一步詳細說明，不能認定 本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明。對于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應(yīng)當視為屬于本發(fā)明的 保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種法尼醇X受體激動劑，其特征在于:如通式(I)所示取代的膽烷酸化合物、或其晶 型、藥學(xué)上可接受的鹽： 式中：R1、!?2、!?3、!?4、!?5、!? 6、!?7、!?8、!?9、!?10、!? 11、!?12、!?13、!?14、!?15、!? 16、!?17、!?18、!?19、!?20、!? 21、!?22、!?23、 ^、^、^、，、^和儼相互獨立地選自由"氛⑴卜氘⑶"組成的組； X1、X2、X3、X4相互獨立地選自由"氫（H )、氘（D )、甲基、CH2D、CHD2、CD3、CH2CH 3、CHDCH3、 CHDCH2D、CHDCHD2、CHDCD3、CD2CH3、CD2CH2D、CD 2CHD2、CD2CD3" 組成的組； 及其生理學(xué)上可接受的鹽、前藥、互變異構(gòu)體和立體異構(gòu)體、對映異構(gòu)體、水合物或溶 劑合物，包括這些化合物以所有比例形成的混合物； 附加條件是，所述化合物不包括非氘代化合物。2. 如權(quán)利要求1所述化合物，其特征在于，乂1、#4344可獨立選自一次或多次氘代的烷 基。3. 如權(quán)利要求1所述化合物，其特征在于，1?17、1?18、1?19、1? 2()各自獨立地選自氫或氘。4. 如權(quán)利要求1所述化合物，其特征在于，選自以下組內(nèi)的氘代膽烷酸化合物或其藥學(xué) 上可接#的鹽，但不局眼于如下化合物：5. -種包含根據(jù)權(quán)利要求1所述的膽烷酸化合物或其藥學(xué)上可接受鹽以及藥學(xué)上可接 受載體的藥物組合物，其特征在于，含有權(quán)利要求1所述的氘代化合物或其藥學(xué)上可接受的 鹽作為有效成分，并含有常規(guī)藥用載體。6. 如權(quán)利要求5所述的藥物組合物，其特征在于，所述的藥物組合物可以用于治療、預(yù) 防或消除各種FXR或者TGR5介導(dǎo)的相關(guān)病癥;包含這些化合物的藥物組合物用于在不同治 療領(lǐng)域諸如癌癥中治療、預(yù)防疾病或障礙或減慢所述疾病或障礙進程。7. 權(quán)利要求1-4所述化合物用于制備治療或者預(yù)防疾病的藥物中的用途，所述疾病由 FXR或者TGR5介導(dǎo)，可選自自慢性肝病，胃腸疾病，腎病，心血管疾病，淤膽失調(diào)，代謝疾病。8. 如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的慢性肝病為原發(fā)性膽汁性肝硬化和非酒精性 脂肪性肝炎。9. 如權(quán)利要求7所述的用途，其中所述的代謝疾病為肥胖癥和糖尿病。
【文檔編號】A61P3/00GK106008639SQ201610409536
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月12日
【發(fā)明人】王義漢, 任興業(yè)
【申請人】深圳市塔吉瑞生物醫(yī)藥有限公司