通過(guò)約束共水合色譜純化生物制品的制作方法
【專(zhuān)利摘要】使用約束共水合劑純化諸如抗體、病毒、細(xì)胞或細(xì)胞器的生物材料的材料和方法，其與對(duì)流色譜、流化床或共沉淀應(yīng)用有關(guān)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】通過(guò)約束共水合色譜純化生物制品
[0001]本申請(qǐng)要求2011年6月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/494，669、2011年6月8日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/494，687、2011年11月14日提交的新加坡專(zhuān)利申請(qǐng)第201108397-9號(hào)和2012年5月21日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)61/653，950的優(yōu)先權(quán)，它們各自通過(guò)引用整體并入本文。
發(fā)明領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明涉及改善生物制品純化方法。其具體涉及改善病毒純化和抗體純化方法。
[0003]發(fā)明背景
[0004]色譜法通常依賴(lài)于開(kāi)發(fā)攜帶至少一種化學(xué)性能的固體表面，以活性地參與和生物分子的相互作用，從而根據(jù)該化學(xué)性能把復(fù)合樣品的組分分類(lèi)。這些方法被稱(chēng)為吸附色譜法。吸附方法以及釋放結(jié)合的組分的化學(xué)手段之間的表面化學(xué)不同，但操作模式相同。一個(gè)實(shí)例是生物親和色譜，其中使用生物配體取代惰性表面，所述生物配體對(duì)來(lái)自復(fù)合樣品的目標(biāo)組分具有特異性。目標(biāo)組分結(jié)合而其他組分不結(jié)合，隨后通過(guò)改變化學(xué)條件釋放目標(biāo)組分。離子交換色譜是更多樣化的方法的代表。惰性表面被帶電化學(xué)基團(tuán)共價(jià)取代。對(duì)于陰離子交換色譜，化學(xué)基團(tuán)帶正電。具有足夠負(fù)電荷的樣品組分結(jié)合，帶最多負(fù)電荷的組分結(jié)合得最堅(jiān)固。缺乏足夠負(fù)電荷的樣品組分未能結(jié)合。通過(guò)使用漸增梯度的鹽，結(jié)合的組分按其結(jié)合強(qiáng)度的順序釋放，漸增梯度的鹽對(duì)電相互作用逐漸增加破壞度，按照結(jié)合的組分與陰離子交換劑相互作用的強(qiáng)度順序釋放它們。除了化學(xué)差異，同樣的操作模式被應(yīng)用于陽(yáng)離子交換色譜、疏水作用色譜、反相色譜以及所謂的混合模式色譜的多種實(shí)例，包括羥基磷灰石。
[0005]依賴(lài)于化學(xué)性能的吸附法的例外為尺寸排阻色譜(SEC)，也被稱(chēng)為凝膠過(guò)濾和凝膠滲透色譜。在這類(lèi)應(yīng)用中，分子與介質(zhì)表面的化學(xué)相互作用實(shí)際上為零。SEC通過(guò)樣品組分向柱中填充的顆粒的孔中差異擴(kuò)散工作。特別大的組分被排阻在孔外并僅穿過(guò)顆粒之間的空間。(任選地)中等尺寸的分子擴(kuò)散進(jìn)較大的孔中。這使得它們進(jìn)入比被排阻的分子更大的液相體積，被排阻的分子僅進(jìn)入顆粒之間的空間。(任選地)小分子可以擴(kuò)散進(jìn)所有的孔中，這使得它們進(jìn)入更大的液相體積。用于平衡指定尺寸的分子類(lèi)型的液相體積越大，將它們從柱中移走所需的液相體積越大。因此，大分子首先從SEC柱洗脫，然后按遞減尺寸的分子的順序。
[0006]在生物領(lǐng)域內(nèi)沉淀法是公知的，包括用于純化蛋白和病毒。兩種最常用的方法，即所謂的鹽沉淀和PEG沉淀,利用被稱(chēng)為優(yōu)先排斥(preferential exclusion)的力。這個(gè)詞在20世紀(jì)80年代初開(kāi)始被廣泛應(yīng)用，并從此成為了公認(rèn)的術(shù)語(yǔ)，用于描述溶解的分子(溶質(zhì))與蛋白質(zhì)的相互作用[1-5]。優(yōu)先排斥的溶質(zhì)與蛋白質(zhì)以這樣一種方式相互作用，其讓蛋白質(zhì)由一層水包圍，而在優(yōu)先排斥的溶質(zhì)中缺乏水。這種溶質(zhì)缺乏區(qū)被稱(chēng)為優(yōu)先水合區(qū)域，或者優(yōu)先水合層或鞘。當(dāng)優(yōu)先水合的蛋白質(zhì)在溶液中彼此相遇時(shí)，它們的優(yōu)先水合鞘合并。排斥的溶質(zhì)濃度越高，兩個(gè)蛋白質(zhì)保持結(jié)合越強(qiáng)烈。所謂的親液鹽(kosmotropicsalt)，如硫酸銨、檸檬酸鈉和磷酸鉀被蛋白質(zhì)表面強(qiáng)烈排斥。也已知非離子型有機(jī)聚合物如聚乙二醇(PEG)被蛋白質(zhì)表面強(qiáng)烈排斥[3-5]。這些沉淀方法是通過(guò)將大量的優(yōu)先排斥劑溶解于含有待沉淀的物質(zhì)種類(lèi)(species)的樣品中進(jìn)行的。由于優(yōu)先排斥劑朝著閾值水平上升，其導(dǎo)致隨機(jī)彼此接觸的目標(biāo)物(target species)通過(guò)共享它們各自的優(yōu)先水合鞘的水保持結(jié)合。這導(dǎo)致形成大的不溶性聚集體，其最終沉淀，之后可以通過(guò)離心或過(guò)濾來(lái)回收它們。然而，沉淀法強(qiáng)加了不希望的限制，這主要是其純化性能被認(rèn)為普遍不如色譜方法，以及還在批次之間具有高度變異性，特別是結(jié)合待沉淀產(chǎn)物的濃度變化時(shí)。回收同樣是可變的，并且當(dāng)目標(biāo)產(chǎn)物以低濃度存在時(shí)，回收可能極其低。已知這些問(wèn)題來(lái)自于沉淀方法對(duì)高度異質(zhì)表面(即待沉淀蛋白質(zhì))的相互作用的依賴(lài)性。商業(yè)應(yīng)用仍然存在，但大部分已被色譜法替換，因?yàn)楹笳咄ǔＬ峁└玫幕厥蘸透叩募兌取Ｈ欢藗內(nèi)匀粚?duì)沉淀法保持著興趣，因?yàn)樗鼈兛赡芴峁┝吮壬V法更高的生產(chǎn)率，材料更便宜，并且設(shè)備更易于操作。
[0007]優(yōu)先排斥的力已經(jīng)被用來(lái)提高蛋白質(zhì)和吸附性色譜介質(zhì)表面之間存在的相互作用。眾所周知，鹽提高疏水作用色譜(HIC)中的結(jié)合。這是這類(lèi)技術(shù)中實(shí)現(xiàn)結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)方法。它們也被用于提高某些親和方法的結(jié)合，例如蛋白A親和色譜(6)。據(jù)20世紀(jì)70年代的報(bào)道，硫酸銨引起蛋白質(zhì)與非官能化多孔顆粒色譜支持物(support)結(jié)合(7)，但沒(méi)有繼續(xù)，可能是由于樣品制備方法和柱應(yīng)用的限制。向樣品中直接加入過(guò)量的硫酸銨產(chǎn)生了堵塞色譜柱的沉淀。加入非沉淀量的鹽預(yù)計(jì)支持低容量，如參考文獻(xiàn)7中顯然經(jīng)歷的。
[0008]優(yōu)先排斥的力也已用于以非離子聚合物如PEG來(lái)提高吸附性色譜方法的結(jié)合。不同于鹽，其對(duì)HIC不起作用，因?yàn)镻EG的固有疏水性直接干擾了結(jié)合機(jī)制。PEG可用于沉淀HIC柱內(nèi)的蛋白質(zhì)，并且所述蛋白質(zhì)可隨后再溶解，但這不是吸附性色譜且其缺乏實(shí)用性:容量和分辨率過(guò)于有限[6]。PEG已被用于增強(qiáng)與親和色譜法[6]，離子交換色譜[8]和羥基磷灰石色譜[9]的結(jié)合，并且已知其干擾在SEC中實(shí)現(xiàn)的分離[10]。在所有這些情況下，其延緩了特別大的分子如聚集體的洗脫，這有時(shí)有助于它們的分離[9]，但其用途受限于其高粘度。高粘度是所有多孔顆粒色譜法的特殊問(wèn)題，因?yàn)槎嗫最w粒色譜法依賴(lài)于擴(kuò)散以將蛋白質(zhì)運(yùn)輸至孔、運(yùn)輸進(jìn)孔、或從孔中運(yùn)輸出。擴(kuò)散系數(shù)與粘度成正比，所以柱性能隨PEG濃度成正比地下降。粘度也增加了發(fā)生在色譜柱中顆粒之間空間的剪切力。在某些情況下這些限制被容忍，因?yàn)橐呀?jīng)證明，與小分子相比，PEG更強(qiáng)烈地影響大分子的結(jié)合，從而提高了羥基磷灰石改善分級(jí)分離抗體聚集體與非聚集抗體的能力[7，8]。由于這兩種傾向隨PEG濃度成正比增加，PEG沒(méi)有被更廣泛地應(yīng)用并不奇怪。
[0009]流化顆粒床提供了在填充床中進(jìn)行色譜法的備選方案。在流化床中，顆粒全面分散于含有目標(biāo)分子的樣品。結(jié)合目標(biāo)分子后，濃縮顆粒，使得未結(jié)合的污染物可被洗掉，并因此以高濃度洗脫結(jié)合的產(chǎn)物?？梢酝ㄟ^(guò)多種方法實(shí)現(xiàn)顆粒的濃縮。比水密度大的顆粒可被沉淀。鐵芯的顆?？梢栽诖艌?chǎng)中濃縮。還可以在過(guò)濾膜上濃縮顆粒。顆粒尺寸可以在小于IOOnm至大于ΙΟΟμπι之間變化。用于擴(kuò)展床色譜的顆粒表面通常用與預(yù)期目標(biāo)分子強(qiáng)烈相互作用的化學(xué)基團(tuán)進(jìn)行官能化。例如，許多出版物報(bào)道將蛋白A固定在流化顆粒上以捕獲和純化IgG。其他出版物描述了用帶電荷基團(tuán)、疏水基團(tuán)、金屬親和基團(tuán)、以及利用多化學(xué)作用的基團(tuán)的官能化。這些多樣的官能化允許流化床形式提供相同的化學(xué)選擇性范圍，其通過(guò)在固化床色譜法中進(jìn)行相同的官能化來(lái)提供。
[0010]流化床的重要性在于它們提供物理操作特性，以克服填充床的一個(gè)最嚴(yán)重限制:生產(chǎn)率低。常規(guī)多孔顆粒柱需要慢流速，這強(qiáng)加了過(guò)多的總過(guò)程時(shí)間間隔。當(dāng)色譜介質(zhì)昂貴到足以迫使用戶(hù)在減小體積的柱運(yùn)行多個(gè)周期時(shí)，這些時(shí)間間隔增加，因?yàn)樽阋栽趩蝹€(gè)周期內(nèi)運(yùn)行過(guò)程的色譜材料的價(jià)格令人望而卻步。然而，對(duì)于滿足從粗制生物樣品得到初始產(chǎn)物的需求的任何方法，也要求其能夠在接近生理PH值和鹽濃度下實(shí)現(xiàn)良好的結(jié)合能力。對(duì)于此應(yīng)用，已經(jīng)評(píng)價(jià)了所有已知的色譜法，但迄今為止只有生物親和色譜滿足這一要求。所有其他方法需要大量修改條件和/或由于細(xì)胞培養(yǎng)物上清液組分而導(dǎo)致失效。
[0011]參考文獻(xiàn):
[0012](I)Arakawaj T.and Timasheffj S.N.(1982).Preferential interactions ofproteins with salts in concentrated solutions.Biochemistry21, 6545-6552
[0013](2) Arakawaj T.and Timasheffj S.N.(1984).Mechanism of protein salting inand salting out by divalent cation salts:balance between hydration and saltbinding.Biochemistry23, 5912-5923.[0014](3) Arakawaj T.and Timasheffj S.N.(1983).Preferential interactions ofproteins with solvent components in aqueous amino acid solutions.Arch.Biochem.Biophys.224，169-177.[0015](4) Arakawaj T.and Timasheffj S.N.(1985).Mechanism of poly (ethyleneglycol)interaction with proteins.Biochemistry24, 6756-6762.[0016](5)Bhatj R., Timasheffj S., Steric exclusion is the principal source ofpreferential hydration of proteins in the presence of polyethylene glycols.Prot.Sc1.，1，113-1143(1992).[0017](6) P.Gagnon, (1996)Purification Tools for MonoclonalAntibodies, Validated Biosystems, Tucson.[0018](7)von der Haar，F(xiàn).，(1976)Purification of proteins by fractionalinterfacial salting out on unsubstituted agarose gels.Biochem.Biophys.Res.Comm.,70(3) 1009-1013.[0019](8) P.Gagnon, B.Godfrey, D.Ladd, (1996) Method for obtaining uniqueselectivities in ion-exchange chromatography by addition of organic polymers tothe mobile phase, J.Chromatogr.A74351-55
[0020](9)P.Gagnon (2008)Improved antibody aggregate removal by hydroxyapatitechromatography in the presence of polyethylene glycol, J.1mmunol.Met.336222-228
[0021](10)T.Arakawa (1985)The mechanism of increased elution volume ofproteins by polyethylene glycol,Analyt.Biochem., 144267-268.[0022]發(fā)明概述
[0023]提供了適用于執(zhí)行本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化樣品中生物來(lái)源的目標(biāo)物的方法，其包括以下步驟:(i)使所述樣品與不溶材料的水合表面接觸，和(ii)使所述樣品和不溶材料與優(yōu)先排斥劑接觸，所述優(yōu)先排斥劑的量足以使得至少一部分的當(dāng)前優(yōu)先水合的目標(biāo)物保留在所述不溶材料的當(dāng)前優(yōu)先水合的表面。這種形式的結(jié)合在本文也被稱(chēng)為約束水合，優(yōu)先排斥劑有時(shí)被稱(chēng)為約束劑，為了簡(jiǎn)潔，優(yōu)先水合的分子和表面被簡(jiǎn)稱(chēng)為“水合的”。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，多于50%的水合目標(biāo)物通過(guò)約束劑被保留在不溶材料的水合表面上，在一些實(shí)施方案中，基本上所有的目標(biāo)物被保留。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，水合目標(biāo)物的至少一個(gè)個(gè)體僅通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合而被保留在水合表面上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，在這類(lèi)條件下，基本上所有的目標(biāo)物僅通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合被保留在水合表面上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合而僅將水合目標(biāo)物保留在水合表面上可以通過(guò)以下證明:通過(guò)移除約束劑或降低約束劑的濃度可以終止這類(lèi)保留。
[0024]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，提供了方法和相關(guān)組合物以及試劑盒，用于在三方系統(tǒng)分離、沉淀法、流化床法或?qū)α魃V法的環(huán)境下執(zhí)行本發(fā)明。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1顯示了實(shí)施例5中所描述的對(duì)于優(yōu)先排斥劑PEG-6000的不同百分比(8%、9%、10%、11%和12%)，通過(guò)約束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比與pH值之間的關(guān)系。
[0026]圖2顯示了實(shí)施例6中所描述的對(duì)于優(yōu)先排斥劑PEG-6000的不同百分比(8%、9%、10%)，通過(guò)約束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比與NaCl濃度之間的關(guān)系。
[0027]圖3顯示了實(shí)施例7中所描述的通過(guò)約束共水合而保留在水合整料的表面上的IgM百分比與優(yōu)先排斥劑、不同分子量的PEG(6000、4000、和2000)的百分比之間的關(guān)系。
[0028]圖4顯示了實(shí)施例8中所描述的在PEG-6000的存在下用于純化IgG的具有有機(jī)成核中心的約束共水合的效率。
[0029]圖5顯示了實(shí)施例9中所描述的對(duì)于三種目標(biāo)物(噬菌體M13、IgM和IgG)，通過(guò)約束共水合而保留在水合整料的表面上的目標(biāo)物百分比與優(yōu)先排斥劑PEG6000百分比之間的關(guān)系。
[0030]圖6顯示了實(shí)施例32中所描述的單克隆IgM的約束共水合對(duì)流色譜的表現(xiàn)，包括優(yōu)先劑PEG-6000對(duì)于污染物和目標(biāo)IgM的洗脫時(shí)間的影響。
[0031]圖7A和7B顯示實(shí)施例33中所描述的單克隆IgM的約束共水合對(duì)流色譜的表現(xiàn)。
[0032]發(fā)明詳述
[0033]提供了適用于執(zhí)行本發(fā)明的方法、組合物和試劑盒。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于純化樣品中生物來(lái)源的目標(biāo)物的方法，其包括以下步驟:(i)使所述樣品與不溶材料的水合表面接觸，和(ii)是使所述樣品和不溶材料與優(yōu)先排斥劑接觸，所述優(yōu)先排斥劑的量足以使得至少一部分當(dāng)前優(yōu)先水合的目標(biāo)物保留在所述不溶材料的當(dāng)前優(yōu)先水合的表面。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，多于50%的水合目標(biāo)物通過(guò)約束劑被保留在不溶材料的水合表面上，在一些實(shí)施方案中，基本上所有的目標(biāo)物被保留。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，水合目標(biāo)物的至少一個(gè)個(gè)體僅通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合被保留在水合表面上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，在這類(lèi)條件下，基本上所有的目標(biāo)物僅通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合而被保留在水合表面上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，通過(guò)約束劑的存在所引起的約束共水合而僅將水合目標(biāo)物保留在水合表面上可以通過(guò)以下證明:通過(guò)移除約束劑或降低約束劑的濃度可以終止這類(lèi)保留。
[0034]在某些實(shí)施方案中，目標(biāo)物是蛋白質(zhì)、抗體、凝血因子、細(xì)胞器、病毒、病毒樣顆粒、基因治療載體或細(xì)胞。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物收集物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含蛋白質(zhì)的溶液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含抗體的溶液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含病毒的溶液，或來(lái)自純化前期的包含目標(biāo)物的溶液。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，目標(biāo)物是蛋白質(zhì)。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)物是IgA、IgD、IgE、IgE或IgM類(lèi)型的多克隆或單克隆抗體，或其片段。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)物是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、干細(xì)胞。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)物是病毒、脂質(zhì)包膜病毒、蛋白質(zhì)衣殼病毒或病毒樣顆粒。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)物是外來(lái)體、脂質(zhì)體、線粒體、葉綠體、溶酶體或其他細(xì)胞器。在其他實(shí)施方案中，目標(biāo)物是凝血因子。通過(guò)上文指定的目標(biāo)物所暗示，本發(fā)明提供用于純化在自然界中大規(guī)模的目標(biāo)物的具體應(yīng)用。
[0035]在某些實(shí)施方案中，不溶材料的表面具有一個(gè)或多個(gè)極性的化學(xué)部分。在某些實(shí)施方案中，極性的化學(xué)部分可以是羥基、多羥基、胺、亞胺、酰脲、碳水化合物、氨基酸、肽、陽(yáng)離子帶電基團(tuán)或陰離子帶電基團(tuán)。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，極性的化學(xué)部分是選自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、單糖、二糖和多糖中的碳水化合物。在其他實(shí)施方案中，極性的化學(xué)部分為選自尿素、尿酸、尿囊素、乙內(nèi)酰脲中的酰脲。在其他實(shí)施方案中，極性的化學(xué)部分是組氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、精氨酸或硒代半胱氨酸。在某些實(shí)施方案中，所述表面可以包含這些基團(tuán)的組合。
[0036]在某些實(shí)施方案中，約束劑是鹽、多糖、非離子有機(jī)聚合物、無(wú)機(jī)聚合物、親液鹽(kosmotropic salt)、具有多個(gè)正電荷和負(fù)電荷的兩性聚合物或氨基酸中的一種或多種。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，約束劑是硫酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸鉀和氯化鈉。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，約束劑是水溶性不帶電的直鏈或支鏈的非離子有機(jī)聚合物。約束劑可以是聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、淀粉、纖維素。在某些情況下，約束劑是聚乙二醇，并且PEG可以具有100至10，000D的平均聚合物重量。在某些實(shí)施方案中，PEG的平均聚合物重量為 600 至 8，000D,或?yàn)榧s 200、300、400、600、1，000、1，500、1，540,4, 000,6, 000、或20，000中的任意一個(gè)。在某些實(shí)施方案中，以約5%至約25% (w/v)的濃度提供聚乙二醇。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，PEG的濃度為5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15%，或兩個(gè)這些值之間的范圍。
[0037]在某些實(shí)施方案中，不溶材料是有機(jī)成核中心的集合。在某些實(shí)施方案中，有機(jī)成核中心由過(guò)飽和濃度的天然存在的無(wú)毒有機(jī)化合物構(gòu)成，其不溶殘余物處于具有水合表面的納米顆粒和/或微顆粒的形式。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，有機(jī)成核中心可以包括碳水化合物、酰脲或肽，或更復(fù)雜的組合物。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，在約束劑的存在下具有水合表面的有機(jī)成核中心可保留一層或更多層目標(biāo)物。在某些實(shí)施方案中，有機(jī)成核中心的表面可以含有結(jié)合單層目標(biāo)物的反應(yīng)性元件，所述單層目標(biāo)物在約束劑的存在下變成水合表面，在水合表面上部通過(guò)約束共水合保留另外多層的目標(biāo)物。用天然存在的有機(jī)成核中心執(zhí)行本發(fā)明的特別優(yōu)勢(shì)在于，它們比合成顆粒相對(duì)廉價(jià)，并且它們通常是可生物降解的，從而降低了加工成本和環(huán)境影響。
[0038]在某些實(shí)施方案中，在將所述樣品與所述約束劑接觸的步驟之前，將所述樣品與所述有機(jī)成核中心接觸。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，該方法還包括以下步驟:將含有污染物的上清液從有機(jī)成核中心分離，所述有機(jī)成核中心具有保留在其表面上的目標(biāo)物。
[0039]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了以下步驟:通過(guò)將所述有機(jī)成核中心暴露于促進(jìn)目標(biāo)物從有機(jī)成核中心解離的條件下，以從有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物，并從所述有機(jī)成核中心回收再溶解的目標(biāo)物。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，通過(guò)充分地降低約束劑的濃度從所述有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，鹽的濃度增大到足以減少約束劑的有效性，從而將所述目標(biāo)物保留在所述有機(jī)成核中心的水合表面。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，糖的濃度增大到足以減少約束劑的有效性，從而將所述目標(biāo)物保留在所述有機(jī)成核中心的水合表面。在某些實(shí)施方案中，在從有機(jī)成核中心解離目標(biāo)物之前，所述方法還包括一個(gè)或多個(gè)洗滌有機(jī)成核中心的步驟。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，所述洗滌溶液包含足夠濃度的一種或多種約束劑，從而保持目標(biāo)物保留在有機(jī)成核中心的水合表面上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，在從所述有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物的步驟中使用的溶液與用于回收目標(biāo)物的溶液是基本相同的。
[0040]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包含有機(jī)成核中心和約束劑的試劑盒，其配置用于方便執(zhí)行本發(fā)明的方法。
[0041]在某些實(shí)施方案中，不溶材料包含合成顆粒。在某些實(shí)施方案中，這類(lèi)顆粒是納米顆?；蛭㈩w粒。在某些實(shí)施方案中，顆粒是磁性的、順磁性的或高密度的。在某些實(shí)施方案中，顆粒是具有聚合物涂層的金屬芯顆粒、具有纖維素涂層的金屬芯顆粒、玻璃顆粒、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯、親硫的磁性顆粒、纖維素涂覆的碳化鎢顆粒、二氧化硅顆粒、瓊脂糖顆粒、纖維素顆?；驈?fù)合顆粒。在某些實(shí)施方案中，顆粒尺寸為約IOOnm至約500 μ m ;或約IOnm至500nm ;或約IOOnm至約50 μ m ;或約IOOnm至約4 μ m ;或約IOOnm至約3 μ m ;或約IOOnm至約I μ m ;或約200nm至約2 μ m ;或約200nm至約500nm ；或約500nm至約I μ m ;或約5 μ m至約50 μ m。[0042]在某些實(shí)施方案中，將靶樣品與顆粒接觸的步驟發(fā)生在將樣品與約束劑接觸的步驟之前。在某些實(shí)施方案中，所述方法還包括以下步驟:(i)從液相中分離具有與其水合表面結(jié)合的目標(biāo)物的顆粒，和(ii)從所述顆粒解離目標(biāo)物。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，解離所述目標(biāo)物的步驟包括用溶液洗滌所述顆粒，其中所述溶液:(i)不包含所述約束劑，(?)包含所述約束劑，所述約束劑的量足以將所述目標(biāo)物保留在所述顆粒的水合表面，(iii)包含引起所述目標(biāo)物從所述顆粒的水合表面解離的試劑，(iv)⑴和(iii)的組合,或(iv) (ii)和(iii)的組合。
[0043]在某些實(shí)施方案中，如果所述顆粒的表面包括許多或較強(qiáng)的反應(yīng)性化學(xué)部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、鹽濃度和其他要素(component)以在所述方法的至少第一步驟期間阻止目標(biāo)物與所述化學(xué)反應(yīng)性部分之間的直接相互作用，從而僅通過(guò)由約束劑的作用介導(dǎo)的約束共水合使目標(biāo)物保持被保留。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，阻止目標(biāo)物與顆粒表面上的化學(xué)反應(yīng)性部分之間相互作用的試劑選自:螯合劑、表面活性劑、鹽、離液劑(chaotrope)、pH值調(diào)節(jié)劑、或試劑與條件的組合。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，從顆粒解離目標(biāo)物的步驟還可以包括螯合劑、表面活性劑、鹽、離液劑、PH調(diào)節(jié)劑、或試劑與條件的組合，從而改善目標(biāo)物從所述顆粒的回收。
[0044]在某些實(shí)施方案中，如果所述顆粒的表面包括較少或較弱的反應(yīng)性化學(xué)部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、鹽濃度和其他要素以減弱或阻止目標(biāo)物與所述化學(xué)反應(yīng)性部分之間的直接相互作用，特別是在解離步驟期間，從而增加目標(biāo)物的回收。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，減弱或阻止目標(biāo)物與顆粒表面上的化學(xué)反應(yīng)性部分之間相互作用的試劑選自:螯合劑、表面活性劑、鹽、離液劑、PH值調(diào)節(jié)劑、或試劑與條件的組合。[0045]在某些實(shí)施方案中，在約I分鐘至約5小時(shí)、2分鐘至15分鐘、2分鐘至30分鐘、10分鐘至30分鐘、2分鐘至2小時(shí)或約2分鐘至2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，將所述約束劑加入到所述樣品和顆粒中。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)離心、沉淀、傾濾、使混合物接受磁場(chǎng)或通過(guò)過(guò)濾，從混合物的液體組分中分離所述顆粒。在某些實(shí)施方案中，用包含約束劑的溶液洗滌分離的顆粒。
[0046]在某些實(shí)施方案中，解離步驟以將解離緩沖液加入到所述顆粒中的單獨(dú)步驟進(jìn)行。在其他實(shí)施方案中，解離目標(biāo)物的步驟是通過(guò)降低所述約束劑的濃度來(lái)遞增進(jìn)行的。
[0047]在某些實(shí)施方案中，所述方法在執(zhí)行用于從其他材料分級(jí)分離所述目標(biāo)物的方法之前或之后執(zhí)行，并且所述用于分級(jí)分離的方法選自:高效液相色譜、親和色譜、蛋白A色譜、蛋白G色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定化金屬親和色譜、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、離心和超速離心。
[0048]在某些實(shí)施方案中，不溶材料是固化床對(duì)流色譜材料。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，對(duì)流色譜材料選自:整料、膜和用無(wú)孔的顆粒填充的柱。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，對(duì)流色譜材料是無(wú)孔二氧化硅顆粒。在某些實(shí)施方案中，對(duì)流色譜材料是整料。在某些實(shí)施方案中，整料是由聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯和二氧化硅制成。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，整料具有約I μ m至200 μ m的平均通道尺寸。在某些實(shí)施方案中，通道尺寸為約Ιμπι至2μηι;約10 μ m M 20 μ m ;或約20 μ m至200 μ m。在某些實(shí)施方案中，所述整料涂有聚合物。在某些實(shí)施方案中，所述整料被化學(xué)修飾以增加表面水合度。在某些實(shí)施方案中，對(duì)流色譜材料表面是羥基化的。
[0049]在某些實(shí)施方案中，如果對(duì)流色譜材料表面包括帶電荷部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值和鹽的濃度，以在所述方法的至少一個(gè)步驟期間阻止所述目標(biāo)物與所述帶電荷部分之間的靜電結(jié)合，在所述至少一個(gè)步驟期間所述目標(biāo)物僅通過(guò)約束共水合被保
&3甶O
[0050]在某些實(shí)施方案中，在約束劑的存在下進(jìn)行將所述樣品與所述對(duì)流色譜材料的水合表面接觸的步驟。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，首先用含有足以保留目標(biāo)物的約束劑濃度的溶液平衡所述對(duì)流色譜材料。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，通過(guò)這樣的方式施加樣品:將樣品與濃縮的約束劑溶液混合，緊接著將混合物與對(duì)流色譜材料接觸，從而最小化或阻止樣品組分在與對(duì)流色譜材料接觸之前沉淀。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，這是通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)的:通過(guò)一個(gè)泵裝載樣品，通過(guò)另一個(gè)泵裝載濃縮約束劑，使系統(tǒng)垂直使得它們?cè)诩磳⒔佑|對(duì)流色譜材料之前在混合器中相遇，并配比兩個(gè)泵的流速以輸送實(shí)現(xiàn)將目標(biāo)物保留在對(duì)流色譜材料的水合表面上所需濃度的約束劑。該樣品應(yīng)用方法在下文被稱(chēng)為管道內(nèi)稀釋。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，所述方法還提供以下步驟:用包含足夠濃度的優(yōu)先排斥劑的溶液洗滌水合的對(duì)流色譜材料，從而維持目標(biāo)物的保留而沖洗掉未保留的污染物。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，對(duì)流色譜材料可以與溶液接觸，以從所述對(duì)流色譜材料解離目標(biāo)物。在某些實(shí)施方案中，解離所述目標(biāo)物的步驟包括用溶液洗滌所述對(duì)流色譜材料，其中所述溶液:(i)不包含所述約束劑，(ii)包含所述約束劑，所述約束劑的量足以將所述目標(biāo)物保留在所述對(duì)流色譜材料的優(yōu)先水合的表面，(iii)包含引起所述目標(biāo)物從所述對(duì)流色譜材料的優(yōu)先水合的表面解離的試劑，(iv) (i)和(iii)的組合，或(iv) (ii)和(iii)的組合。
[0051]在某些實(shí)施方案中，引起所述目標(biāo)物從所述對(duì)流色譜材料的水合表面解離的試劑選自:表面活性劑、離液劑、鹽、糖或氨基酸。
[0052]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法在執(zhí)行用于從其他材料分級(jí)分離所述目標(biāo)物的方法之前或之后進(jìn)行，并且所述用于分級(jí)分離的方法選自:高效液相色譜、親和色譜、蛋白A色譜、蛋白G色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定化金屬親和色譜、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、離心和超速離心。
[0053]在某些實(shí)施方案中，所述不溶材料具有在第一組條件下可與目標(biāo)物結(jié)合，而在第二組條件下不與目標(biāo)物結(jié)合的化學(xué)反應(yīng)性能部分，并且其中所述方法包括在除了與上述第二組條件相同的條件之外還存在優(yōu)先排斥劑的情況下，將目標(biāo)物保留在不溶材料的水合表面上的步驟。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，在所述第二組條件下將所述目標(biāo)物保留在所述不溶材料的水合表面上的步驟之前，所述方法還包括在第一組條件下洗滌所述樣品的步驟且同時(shí)所述目標(biāo)物結(jié)合到不溶材料上。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，所述第一組條件和第二組條件的PH值、導(dǎo)電率以及鹽濃度中至少一項(xiàng)有差異。
[0054]在某些實(shí)施方案中，可以用非對(duì)流色譜材料如填充在色譜柱中的多孔顆粒執(zhí)行本發(fā)明。在某些這類(lèi)實(shí)施方案中，多孔顆粒應(yīng)用的功效可以被擴(kuò)展或改善超過(guò)缺乏多孔顆粒的本發(fā)明所可能達(dá)到的功效，但一般而言，性能將會(huì)遜色于通過(guò)對(duì)流色譜介質(zhì)執(zhí)行的本發(fā)明或本發(fā)明的其他形式。
[0055]在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明可以用于所謂的負(fù)色譜應(yīng)用，其中沒(méi)有通過(guò)約束共水合來(lái)保留目標(biāo)物而是保留了污染物，并因此與目標(biāo)物分離。在使用有機(jī)成核中心和合成顆粒的某些這類(lèi)實(shí)施方案中，可以理解，目標(biāo)物將留在上清液中，而待除去的污染物將被顆粒保留。在使用固化床色譜介質(zhì)(包括對(duì)流材料或多孔顆粒柱)的某些這類(lèi)實(shí)施方案中，可以理解，目標(biāo)物將流過(guò)色譜床，而待除去的污染物將被保留。除了術(shù)語(yǔ)“負(fù)色譜”，這類(lèi)應(yīng)用有時(shí)被稱(chēng)為“流過(guò)法”。
[0056]已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，相比傳統(tǒng)的兩相沉淀系統(tǒng)，使用3-相系統(tǒng)產(chǎn)生了更短的孵育時(shí)間、更好的純度、更好的回收以及更好的再現(xiàn)性，所述3-相系統(tǒng)是通過(guò)在加入約束劑之前將過(guò)量的固體有機(jī)成核中心分散至生物制劑中來(lái)制備。逐漸加入所述約束劑是本方法的一個(gè)要求，無(wú)論所述約束劑是鹽還是非離子型有機(jī)聚合物。這表明，約束劑導(dǎo)致目標(biāo)物與有機(jī)成核中心形成穩(wěn)定的結(jié)合，而不是目標(biāo)物彼此之間的結(jié)合。由于有機(jī)成核中心的水合化學(xué)表面比蛋白質(zhì)和其它沉淀目標(biāo)物的高度異質(zhì)性表面的性質(zhì)更均勻，這使得分配系數(shù)應(yīng)該可以更明確地限定，從而導(dǎo)致更精細(xì)的分離，例如，更高的純度。由于過(guò)量提供成核中心，其也使得大規(guī)模的作用應(yīng)該更有效并且在更短的孵育時(shí)間支持更高的回收。盡管樣品的組成發(fā)生變化，均勻性和過(guò)量的組合與較好的重現(xiàn)性一致。因此，在某些實(shí)施方案中，該方法克服了傳統(tǒng)的兩相沉淀系統(tǒng)中最不希望的限制。在目標(biāo)物與有機(jī)成核中心共沉淀之后，可以通過(guò)離心或過(guò)濾除去上清液。然后可以通過(guò)將其暴露于缺乏約束劑的溶液中，以從有機(jī)成核中心回收目標(biāo)物。隨后可以通過(guò)離心或過(guò)濾除去仍然不溶的有機(jī)成核中心。
[0057]已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，在某些實(shí)施方案中，將約束劑與分散在生物液體中的水合合成顆粒接觸促進(jìn)了大的蛋白質(zhì)和其他大型生物制品選擇性結(jié)合在顆粒的表面上，并且，隨后通過(guò)降低約束劑的濃度可以意外地高純度回收該生物制品。在某些實(shí)施方案中，不要求在顆粒表面上強(qiáng)烈的產(chǎn)品相互作用性化學(xué)官能度:既不是親和配體、正電荷、負(fù)電荷、疏水性配體，也不是它們的任意組合。結(jié)合和洗脫可以發(fā)生在寬范圍的PH值和電導(dǎo)率條件下，使該方法特別適用于從粗制細(xì)胞培養(yǎng)物上清液捕獲產(chǎn)物。在某些實(shí)施方案中，本方法需要將顆粒分散在包含所關(guān)注的目標(biāo)物的生物樣品中，逐漸加入約束劑直到足以使顆粒與目標(biāo)物之間產(chǎn)生穩(wěn)定結(jié)合的濃度，然后從攜帶污染物的液體中分離顆粒。可以通過(guò)將顆粒重懸浮在含有足夠濃度約束劑的干凈緩沖液中，以保持目標(biāo)物結(jié)合到顆粒上，來(lái)應(yīng)用一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟。這具有稀釋可能已被截留在顆粒中或顆粒之間的攜帶雜質(zhì)的液體的作用。通過(guò)將顆粒暴露于具有濃度降低的約束劑溶液中來(lái)從顆粒最終解離產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，某些這類(lèi)實(shí)施方案中的方法支持與生物親和方法如IgG抗體的蛋白A親和純化非常類(lèi)似的產(chǎn)品純度，并且還克服了沉淀方法典型的可變純度和回收率。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)一步表明，更好性能的原因來(lái)自于，特別過(guò)量的均勻水合表面作為系統(tǒng)中的優(yōu)先共水合伴侶起作用。也許該方法最令人驚訝的和顯著的特點(diǎn)例證如下:淀粉改性磁性納米顆粒支持90%以上的純度和90%的回收率，容量比相同架構(gòu)的蛋白A親和納米顆粒高30倍。這些結(jié)果表明，相比僅依賴(lài)于反應(yīng)性表面化學(xué)基團(tuán)的顆粒(僅可積累單層的目標(biāo)物)，本發(fā)明的顆粒能夠積累多層所選擇的目標(biāo)物。
[0058]還已經(jīng)令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，約束劑，尤其包括非離子型有機(jī)聚合物，可以用在某些實(shí)施方案中，以在生物產(chǎn)品與對(duì)流色譜介質(zhì)的水合表面之間不存在顯著化學(xué)吸引的情況下，實(shí)現(xiàn)將生物制品保留在對(duì)流色譜介質(zhì)的水合表面上。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)以下步驟實(shí)現(xiàn)高容量的樣品裝載:通過(guò)色譜儀上的一個(gè)泵線路裝載樣品，同時(shí)通過(guò)第二泵線路裝載高濃度的優(yōu)先排斥劑，以及在緊鄰對(duì)流色譜支持物之前混合兩股液流。這將混合物的柱前停留時(shí)間限制在短的時(shí)間間隔，以至于不會(huì)發(fā)生其程度足以干擾過(guò)程的沉淀。因而盡管優(yōu)先排斥溶質(zhì)的粘度高，可以實(shí)現(xiàn)高容量和高分辨率，并且可以在比多孔顆粒柱所實(shí)現(xiàn)的流速高10倍以上的流速維持它們。這具有使色譜支持物之前樣品沉淀最小化的綜合有利效果，因?yàn)闃悠返闹巴Ａ魰r(shí)間與流速成反比。這使得能夠使用較高濃度的優(yōu)先排斥劑，這有利于較高的結(jié)合容量。目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)合到色譜支持物上之后，可以用清潔的緩沖液沖洗床以洗掉未結(jié)合的污染物。應(yīng)當(dāng)理解，在某些實(shí)施方案中，洗滌緩沖液將包含足夠濃度的約束劑以保持目標(biāo)產(chǎn)物與該表面的結(jié)合。此步驟之后是解離和回收目標(biāo)產(chǎn)物。這可以通過(guò)降低用來(lái)實(shí)現(xiàn)保留的約束劑濃度來(lái)實(shí)現(xiàn)。在整料和膜上實(shí)行所述方法的另一個(gè)有價(jià)值的區(qū)別在于，無(wú)論被純化產(chǎn)品的尺寸如何，維持了高容量和高分辨率的分級(jí)分離，所以本發(fā)明對(duì)于病毒顆粒和對(duì)于蛋白一樣有效。多孔顆粒介質(zhì)對(duì)于大的生物制品產(chǎn)生特別差的表現(xiàn)。另一種有價(jià)值的區(qū)別在于，本發(fā)明比其他方法在化學(xué)上更溫和，這是因?yàn)榧s束劑的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)能力以及整料內(nèi)顆粒間缺乏剪切力。另一種有價(jià)值的區(qū)別是，用非離子有機(jī)聚合物實(shí)施本發(fā)明阻止非特異性疏水相互作用，非特異性疏水相互作用可以導(dǎo)致小的疏水污染物污染色譜表面，如大量存在于細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的污染物。優(yōu)異的總結(jié)果是，機(jī)制、方法和材料的該獨(dú)特組合建立了運(yùn)作良好的系統(tǒng)，以提供替代現(xiàn)有吸附色譜法的極具競(jìng)爭(zhēng)力的方法，提供了所有其他方法難以實(shí)現(xiàn)的優(yōu)異結(jié)果。另外，本發(fā)明的某些實(shí)施方案的分級(jí)分離機(jī)制與現(xiàn)有方法互補(bǔ)，以形成對(duì)于工藝開(kāi)發(fā)者和制造商可用的工具組有價(jià)值的新補(bǔ)充。
[0059]定義和術(shù)語(yǔ)
[0060]定義和解釋了術(shù)語(yǔ)使得可以更容易地理解本發(fā)明。其他定義在詳述中陳述。
[0061]“氨基酸”是指天然或合成來(lái)源的一類(lèi)有機(jī)分子，其含有排列方式包括氨基、羧基和側(cè)鏈的碳、氫、氧和氮。適合作為有機(jī)成核中心的實(shí)例青睞溶解度低的物質(zhì)種類(lèi)。這類(lèi)試齊IJ的有效濃度隨氨基酸的特性和由本發(fā)明所處理的生物產(chǎn)品的特性而變化。小肽也可以通過(guò)延長(zhǎng)而被用作有機(jī)成核中心。氨基酸的實(shí)例包括但不限于，甘氨酸，其在高達(dá)約2.5M的濃度可溶。
[0062]“聚集體”是指兩個(gè)或更多個(gè)分子相結(jié)合(association)，其在生理?xiàng)l件下穩(wěn)定，并可能在寬范圍的PH值和電導(dǎo)率條件下保持穩(wěn)定。聚集體通常包含至少一種生物分子如蛋白、核酸或脂類(lèi)，以及其他分子或金屬離子。結(jié)合可以通過(guò)任意類(lèi)型或任意化學(xué)相互作用的組合發(fā)生。例如，抗體的聚集體可以分為兩類(lèi):“同型聚集體”是指兩個(gè)或更多個(gè)抗體分子的穩(wěn)定結(jié)合；“異型聚集體”是指一個(gè)或多個(gè)抗體分子與一個(gè)或多個(gè)非抗體分子的穩(wěn)定結(jié)合。非抗體組分可以由選自以下的一種或多種物質(zhì)組成:核酸、內(nèi)毒素、金屬離子、蛋白、脂類(lèi)或細(xì)胞培養(yǎng)基組分。
[0063]“抗體”是指免疫球蛋白、復(fù)合物或其片段。該術(shù)語(yǔ)可以包括但不限于，IgA，IgD,IgE, IgG和IgMl類(lèi)型的多克隆或單克隆抗體，其來(lái)自于人或其他哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，包括天然或基因修飾形式如人源化的、人的、單鏈的、嵌合的、合成的、重組的、雜化的、突變的、移植的和體外產(chǎn)生的抗體?！翱贵w”還可以包括復(fù)合物形式，包括但不限于，包含免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗體”還可以包括抗體片段如Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、Fd、Dab、Fe和其他成分，無(wú)論他們是否保持抗原結(jié)合功能?！翱贵w”還可以包括化合物重組構(gòu)建體，包括所謂的融合蛋白，其中抗體的Fe部分重組地融合至非抗體蛋白?！翱贵w”還可以包括合成的構(gòu)建體，包括所謂的酶偶聯(lián)物，其中酶或其他蛋白被化學(xué)地偶聯(lián)至抗體。
[0064]“碳水化合物”是指以通式Cm (H2O) n包含碳、氫和氧的天然或合成來(lái)源的一類(lèi)有機(jī)分子。構(gòu)成適用于執(zhí)行本發(fā)明的某些實(shí)施方案的有機(jī)成核中心的物質(zhì)種類(lèi)包括但不限于，纖維素、淀粉和低溶解度糖。
[0065]“色譜支持物”是指固化色譜床，其可用于實(shí)施色譜。色譜支持物可以包括整料、膜或用多孔或無(wú)孔顆粒填充的柱。
[0066]關(guān)于本申請(qǐng)的某些實(shí)施方案所使用的“約束劑”(有時(shí)“優(yōu)先排斥劑”、“沉淀劑”、“優(yōu)先排斥溶質(zhì)”或“約束共水合劑”)是指通過(guò)本文稱(chēng)為約束共水合的機(jī)制，導(dǎo)致生物目標(biāo)物保留在水合表面上的試劑。在廣義的文獻(xiàn)中，一些這類(lèi)試劑通常被稱(chēng)為優(yōu)先排斥溶劑和沉淀劑。優(yōu)先排斥物質(zhì)可以包括但不限于，所謂的親液鹽、非離子型或兩性有機(jī)聚合物、一些多糖和氨基酸。一組實(shí)例包括但不限于，所謂的沉淀鹽如硫酸銨、檸檬酸鈉和磷酸鉀等。另一組包括非離子型有機(jī)聚合物如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇(PPG)和聚乙烯吡咯烷酮等。PEG具有結(jié)構(gòu)式HO-(CH2-CH2-O)n-H。實(shí)例包括但不限于，具有小于100至大于10，000道爾頓的平均聚合物分子量的組合物，但更常用為3，000至8，000道爾頓。另一組包括氨基酸如甘氨酸。不希望被任何特定理論限制，據(jù)信優(yōu)先排斥是指這樣的條件:其中溶劑以高至約4nm的距離緊貼圍繞蛋白，在這個(gè)距離缺乏特定的約束劑。所以這一區(qū)域被稱(chēng)為優(yōu)先水合的。當(dāng)優(yōu)先水合的表面相互作用時(shí)，它們共享一些水并將一些水還回整個(gè)溶劑。由于當(dāng)約束劑保持存在時(shí)，它們不能再獲得那些水，它們被約束以繼續(xù)共享它們各自?xún)?yōu)先水合的水。這一條件被稱(chēng)為約束共水合。
[0067]“內(nèi)毒素”是指存在于革蘭氏陰性菌外膜中的毒性熱穩(wěn)定脂多糖物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞溶解時(shí)它們從細(xì)胞釋放。
[0068]“外泌體”是指與干細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞器類(lèi)型。[0069]“因子VIII”(因子8)是凝固蛋白。
[0070]“纖維蛋白原”是凝固蛋白。
[0071]“水合(的)表面”或“高度水合的表面”或“親水(的)表面”是指與水強(qiáng)烈相互作用的表面，可能通過(guò)氫鍵、電致伸縮或這兩種機(jī)制的一些組合。這類(lèi)相互作用可以通過(guò)化學(xué)基團(tuán)介導(dǎo)，例如羥基、負(fù)電荷或正電荷、或不帶電的極性基團(tuán)?？伤系幕瘜W(xué)基團(tuán)的存在可以是給定材料如顆粒或?qū)α魃V材料的天然組合物的基本特征，或可通過(guò)添加或增強(qiáng)的化學(xué)修飾將可水合的化學(xué)基團(tuán)固定在表面上，包括但不限于，碳水化合物和酰脲。所謂的疏水表面通常被認(rèn)為是不高度水合的，但是盡管如此，包含強(qiáng)烈可水合的基團(tuán)和疏水殘基的表面可以被充分地水合以實(shí)施本發(fā)明。
[0072]“親液鹽”可以包括多種鹽中的任意一種，包括但不限于，硫酸銨、硫酸鈉、磷酸鉀、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀和氯化鈉。這類(lèi)鹽的有效濃度隨鹽的特性和由本發(fā)明所處理的生物產(chǎn)品的特性而變化。
[0073]“非離子型有機(jī)聚合物”是指由重復(fù)連接的缺乏帶電基團(tuán)的有機(jī)亞基組成的天然存在的或合成的碳?xì)浠衔?。其可以是直鏈的，以直鏈為主并具有一些支鏈的，或以支鏈為主的。適用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)例包括但不限于，葡聚糖、淀粉、纖維素、聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有結(jié)構(gòu)式HO-(CH2-CH2-O)n-H。實(shí)例包括但不限于，具有小于100至大于10，000道爾頓的平均聚合物分子量的組合物。商業(yè)PEG制劑的平均分子量通常以連字符后綴指示。例如，PEG-6000是指具有約6，000道爾頓平均分子量的制齊U。這類(lèi)試劑的有效濃度隨試劑的特性和由本發(fā)明所處理的生物產(chǎn)品的特性而變化。
[0074]“有機(jī)成核中心”是指簡(jiǎn)單或復(fù)雜的非合成有機(jī)分子種類(lèi)，其以，或至少部分地以，納米顆粒和/或微顆粒形式的不溶固體存在。亞術(shù)語(yǔ)“成核中心”來(lái)源于晶體學(xué)領(lǐng)域，描述被材料圍繞以在其表面生長(zhǎng)的“種子”。由于大多數(shù)有機(jī)分子顯示一定程度的水溶性，通過(guò)使用大于飽和溶液所需量的量滿足不溶固體的需要。以過(guò)飽和量起作用的有機(jī)成核中心的非限制性實(shí)例包括高度極性的物質(zhì)種類(lèi)如碳水化合物、酰脲、氨基酸及其可能的組合。淀粉和纖維素是碳水化合物有機(jī)成核中心的實(shí)例。尿酸和尿囊素是酰脲有機(jī)成核中心的實(shí)例。
[0075]“有機(jī)溶劑”是指以液體狀態(tài)存在的天然存在或合成的有機(jī)化合物。適用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)例包括但不限于，乙二醇、丙二醇、二甲亞砜、乙醇和苯氧乙醇。
[0076]“優(yōu)先排斥”描述了這樣的相互作用:通過(guò)這樣的相互作用，與整個(gè)溶液中某些溶解物質(zhì)的濃度相比，在緊貼圍繞親水(水合的)表面的區(qū)域缺乏相同的物質(zhì)。優(yōu)先排斥的溶質(zhì)具體地包括所謂的沉淀鹽、非離子型聚合物和氨基酸。
[0077]“合成顆粒”尺寸可以為小于IOOnm至大于ΙΟΟμπι。它們可以是多孔的或無(wú)孔的。它們可以是聚合的，由例如聚甲基丙烯酸酯、聚丙烯酸酯、瓊脂糖、纖維素、葡聚糖或其他聚合物組成，或者它們可以是無(wú)機(jī)的如二氧化硅。它們可以是整體均一結(jié)構(gòu)，或它們可以是由以下組成的復(fù)合物:一種諸如金屬合金或疏水聚合物的材料的內(nèi)核，涂有高度水合的或允許附加化學(xué)基團(tuán)的涂覆表面以產(chǎn)生高度水合的表面。“合成的顆?！笨梢园ㄔO(shè)計(jì)用于色譜應(yīng)用的科技，或預(yù)期用于與色譜領(lǐng)域完全不同應(yīng)用的顆粒。
[0078]“多核苷酸”是指由多個(gè)核苷酸單體共價(jià)連接成鏈組成的生物聚合物。DNA(脫氧核糖核酸)和RNA (核糖核酸)是多核苷酸的實(shí)例。
[0079]“蛋白質(zhì)”是指含有碳、氫、氧、氮且經(jīng)常含硫的一類(lèi)復(fù)雜有機(jī)大分子中的任意一種，其主要由通過(guò)肽鍵連接的一個(gè)或多個(gè)氨基酸鏈組成。蛋白質(zhì)可以是天然來(lái)源或重組來(lái)源的?？梢杂梅前被岵糠中揎椀鞍踪|(zhì)，例如糖基化、PEG化或與其他化學(xué)部分偶聯(lián)。蛋白質(zhì)的實(shí)例包括但不限于抗體、凝固因子、酶和肽激素。
[0080]“干細(xì)胞”是指以其分化成任意類(lèi)型組織的能力而聞名的一類(lèi)細(xì)胞。
[0081]“過(guò)飽和淀粉”是指其處于具體蛋白制劑的主要條件下包含超過(guò)淀粉最大溶解度的量的淀粉溶液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在樣品的條件下，在所述樣品中具有超過(guò)淀粉溶解度的量的淀粉樣品，使得一部分所述淀粉以不溶解的形式存在于樣品中，例如，10%淀粉，或20%淀粉，或更多或更少的量，取決于具體應(yīng)用的要求。
[0082]“過(guò)飽和酰脲”是指其處于具體蛋白制劑的主要條件下包含超過(guò)酰脲最大溶解度的量的酰脲溶液。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在樣品的條件下，在所述樣品中具有超過(guò)酰脲溶解度的量的酰脲樣品，使得一部分所述酰脲以不溶解的形式存在于樣品中。
[0083]“表面活性劑(surfactant) ” 包括“表面活性劑(surface active agents)”,例如通常包含疏水部分和親水部分，使得它們被稱(chēng)為兩性的一類(lèi)有機(jī)分子。在水溶液中足夠濃度時(shí)，表面活性劑可以自我結(jié)合形成簇，疏水部分在中心聚集以最小化與水的接觸，而親水部分放射性向外以最大化與水的接觸。在生物制劑的存在下，特別是在包含具有疏水性質(zhì)或具有疏水性質(zhì)區(qū)域的材料的那些生物制劑存在下，表面活性劑的疏水部分傾向于自發(fā)地與疏水材料的一些部分結(jié)合，并通過(guò)表面活性劑親水部分的影響增加疏水材料的溶解度。它們也可以用于調(diào)節(jié)在同樣溶解于水性溶劑中的不同疏水性材料之間發(fā)生的疏水性相互作用。適合于實(shí)施本發(fā)明某些實(shí)施方案的表面活性劑實(shí)例包括但不限于，非離子型表面活性劑如聚山梨酯表面活性劑(例如吐溫20、聚氧乙烯(20)單月桂酸脫水山梨糖醇酯和吐溫80，聚氧乙烯(20)單油酸 脫水山梨糖醇酯)和Triton(例如，聚乙二醇對(duì)-(1，1,3, 3-四甲基丁基)-苯基醚)，以及兩性離子表面活性劑如CHAPS(3-[ (3-膽酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸鹽)、CHAPS0(3_[ (3-膽酰胺丙基)二甲基氨基]-2-羥基-1-丙磺酸鹽)以及辛基葡糖苷(例如，(2民35，45，51?，610-2-(羥甲基)-6-辛氧基噁烷-3，4，5-三醇)。
[0084]“三方系統(tǒng)”或“3-相體系”是指用來(lái)沉淀目標(biāo)物的系統(tǒng)，其主要由含有目標(biāo)物的水性制劑、有機(jī)成核中心和優(yōu)先排斥沉淀劑組成。一個(gè)實(shí)例是包含單克隆抗體、淀粉和PEG的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
[0085]“兩相系統(tǒng)”是指與本發(fā)明某些實(shí)施方案的3-相系統(tǒng)不同并用于沉淀目標(biāo)物的系統(tǒng)，其主要由包含目標(biāo)物的水性制劑和優(yōu)先排斥沉淀劑組成。一個(gè)實(shí)例是包含單克隆抗體和硫酸銨的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。
[0086]“酰脲”是指天然或合成來(lái)源的環(huán)狀或無(wú)環(huán)有機(jī)分子，其包含一個(gè)或多個(gè)脲部分或其衍生物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了酰脲如尿素、尿酸、乙內(nèi)酰脲、尿囊素(allantoin) (CAS號(hào)97_59_6;尿囊素氯輕招、尿囊素招、尿囊素(hemocane)、脲基乙內(nèi)酰脲、5-脲基乙內(nèi)酰脲、乙醛基酰脲、乙醛酸二酰脲、2，5- 二氧代基-4-咪唑烷基脲)、嘌呤和它們的衍生物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通式R-CO-NH-CO-NH2或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R’ R’ ’ NH-CO-NR' ’ ’ R’ ’ ’ ’的有機(jī)分子，其中相關(guān)的“R基團(tuán)”可以是H或任意有機(jī)部分。
[0087]“病毒”或“病毒子”是指超顯微的(直徑約20至300nm)新陳代謝遲鈍的感染性試劑，其僅在活宿主(主要是細(xì)菌、植物和動(dòng)物)的細(xì)胞內(nèi)復(fù)制，由以下組成:RNA或DNA核心、蛋白衣殼以及(在更復(fù)雜的類(lèi)型中)外包膜。實(shí)例包括但不限于dsDNA病毒、ssDNA病毒、dsRNA病毒、(+) ssRNA病毒、(_) ssRNA病毒、ssRNA-RT病毒和dsDNA-RT病毒；腺病毒、皰疫病毒、痘病毒、細(xì)小病毒、呼腸孤病毒、微小核糖核酸病毒、披膜病毒、正粘病毒、棒狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、肝DNA病毒、乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、登革熱病毒、日本腦炎病毒、西尼羅河病毒和細(xì)菌噬菌體。術(shù)語(yǔ)病毒應(yīng)理解為包括用作基因治療載體、用作疫苗和作為抗生素替代品的病毒顆粒。其還應(yīng)被理解為包括所謂擬病毒子，其可以被描述為已被重組修飾以保留其產(chǎn)生保護(hù)性免疫的能力而消除其引起感染的能力的病毒顆粒。
[0088]“血管性假血友病因子”是凝固蛋白。其與因子VIII結(jié)合，形成分子量為約200萬(wàn)道爾頓的所謂抗血友病因子。
[0089]實(shí)施某些實(shí)施方案的材料和方法的詳述
[0090]用作有機(jī)成核中心的有效材料可以由以至少部分地不溶的量存在于制劑中的天然有機(jī)化合物組成。實(shí)例包括但不限于高極性的物質(zhì)，如碳水化合物，包括但不限于:纖維素、淀粉和糖；酰脲，包括但不限于尿囊素和尿酸；和氨基酸，包括但不限于組氨酸。通常優(yōu)選材料在水中不膨脹，或雖然材料膨脹，如纖維素，但產(chǎn)生有效的結(jié)果。通過(guò)使用單個(gè)約束劑將簡(jiǎn)化執(zhí)行該方法，但兩個(gè)或多個(gè)的組合可以有效地使用。一般而言，待沉淀的物質(zhì)種類(lèi)對(duì)于有機(jī)成核中心的固有親和力應(yīng)該是零，因?yàn)閺?qiáng)的親和力可能導(dǎo)致在消除沉淀劑后目標(biāo)物的回收率較差。雖然弱親和力可以提高由該方法實(shí)現(xiàn)的純度，在減弱或延遲親和因子的物質(zhì)存在下執(zhí)行回收步驟，可以最小化回收率損失。使用酰脲在抗體制劑中產(chǎn)生了減少聚集體的驚人效果，明顯是由于它們對(duì)于較大物質(zhì)種類(lèi)和較小物質(zhì)種類(lèi)的不同親和性。這代表本方法與傳統(tǒng)方法的顯著區(qū)別，傳統(tǒng)方法傾向于優(yōu)先富集聚集體。
[0091]有機(jī)成核中心的物理形式可以是顆粒、纖維或支鏈纖維?？梢允褂萌我饬６鹊念w粒。越細(xì)的粒度轉(zhuǎn)化為越高的每干克表面面積，這預(yù)期對(duì)應(yīng)更高的每克共沉淀容量，并促成使用較少量的成核中心。較粗粒度可預(yù)期得到相反的趨勢(shì)，但在通過(guò)過(guò)濾而不是離心分離促進(jìn)除去上清液在某些情況下可能是有利的。對(duì)于使用顆粒材料的應(yīng)用，優(yōu)選無(wú)孔材料或具有太小孔隙而不允許目標(biāo)物進(jìn)入的材料，因?yàn)檫@將避免由于一部分目標(biāo)物不能退出孔的潛在損失。
[0092]有機(jī)成核中心的數(shù)量應(yīng)該是足以共沉淀所有的目標(biāo)物的量。這可以很容易地通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。有機(jī)成核中心的典型量范圍可以為5%至20%，但該方法可以使用更低和更高的量來(lái)實(shí)施而不降低其有效性。一般而言，當(dāng)預(yù)計(jì)樣品材料批次之間變化時(shí)，使用適度大于實(shí)驗(yàn)確定的最小量的量是明智的。所謂的適度較大的量可以包括大10%，或大50%，或兩倍于最小量，取決于樣品組合物變化的水平。更大的量可能導(dǎo)致目標(biāo)物不可接受的損失。
[0093]約束劑可以是通常用于沉淀蛋白或病毒的任意優(yōu)先排斥溶劑，包括但不限于，尤其是硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉或磷酸鉀；或PEG、PPG、PVP或葡聚糖等。如果僅使用一種約束劑時(shí)本方法通常更簡(jiǎn)單，但可以使用兩種或更多種的組合有效地實(shí)施本方法。一般而言，所選擇約束劑的有效水平與用于本發(fā)明以外沉淀所利用的水平相似，但細(xì)致實(shí)驗(yàn)通常揭示必要量更低。盡管如此，可以有效地使用較高水平，并且可以具有降低有機(jī)成核中心的必要量的效果，只要較高量的約束劑不導(dǎo)致純化指數(shù)不可接受的降低。
[0094]所述約束劑可以作為液態(tài)濃縮物添加，以增加它在整個(gè)液體的分散效率?？梢允謩?dòng)進(jìn)行添加，或者通過(guò)使用泵自動(dòng)方便地添加?；蛘呒s束劑可以作為粉末添加。這提供了降低最終處理體積的優(yōu)勢(shì)，但增加了添加必須發(fā)生的時(shí)間段，因?yàn)楸仨毴菰S時(shí)間以允許約束劑溶解。作為總的出發(fā)點(diǎn)，作為液體濃縮液添加約束劑可以在30分鐘內(nèi)完成，而添加干粉可以在60分鐘內(nèi)完成。后續(xù)試驗(yàn)將揭示對(duì)于任何給定應(yīng)用的具體限制。
[0095]本發(fā)明驚人的重要特征是，非離子聚合物約束劑經(jīng)常比沉淀鹽產(chǎn)生更好的結(jié)果。使用沉淀鹽導(dǎo)致小分子污染物的共沉淀，包括PH指示劑染料和其他疏水性物質(zhì)。使用非離子型聚合物約束劑避免了這一點(diǎn)，這可能是因?yàn)橹T如PEG的非離子型聚合物的疏水性和強(qiáng)氫鍵潛力提高了這些污染物的溶解度，并阻止它們與有機(jī)成核中心的非特異性相互作用。
[0096]本方法可以用于粗產(chǎn)物的捕獲、中間純化或精制；例如，本方法可以在其他純化方法之前或之后使用，只要順序?qū)兓目傂枨笞钣杏?。其他純化方法可包括其他沉淀方法，但更可能是色譜方法，可能包含但不限于親和色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、所謂的混合模式色譜法。
[0097]抗體和病毒顆粒代表了本方法可應(yīng)用于的兩種公知類(lèi)型的目標(biāo)物，但對(duì)于可以通過(guò)傳統(tǒng)的2-相體系有效地沉淀的任何目標(biāo)物，它可以用來(lái)實(shí)現(xiàn)相同的好處。
[0098]盡管本方法將被最頻繁地用于從不純的混合物共沉淀目標(biāo)制品，它也可以被應(yīng)用于從制劑中共沉淀特定污染物而目標(biāo)制品保持可溶。
[0099]考慮到一般而言，有機(jī)成核中心的均勻性將允許比用傳統(tǒng)的2-相系統(tǒng)可以獲得的分辨程度顯著更高的分辨程度。換而言之，本發(fā)明將可能允許目標(biāo)制品與通過(guò)2-相系統(tǒng)不能有效分離的污染物有效地分離。
[0100]盡管在通過(guò)優(yōu)先排斥劑來(lái)驅(qū)動(dòng)沉淀的系統(tǒng)中包含有機(jī)成核中心是最有益的，預(yù)期其將用其他沉淀劑如有機(jī)溶劑來(lái)提供顯著的改善。
[0101]本發(fā)明的其它目的和優(yōu)點(diǎn)將被部分地在下面的描述中陳述，并且將部分地從描述中顯而易見(jiàn)，或者可以通過(guò)本發(fā)明的實(shí)踐來(lái)獲知。通過(guò)權(quán)利要求書(shū)中所指明的元件和組合的方式，可以實(shí)現(xiàn)并獲得本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)。
[0102]應(yīng)理解，無(wú)論是以上概述還是以下的詳述都只是示例性和解釋性的，而并非是對(duì)所要求保護(hù)的本發(fā)明的限制。
[0103]本技術(shù)利用尺寸范圍為小于IOOnm至大于100 μ m的不溶性但水合的有機(jī)成核中心。這些成核中心特別地包括天然有機(jī)材料，以區(qū)別于設(shè)計(jì)或預(yù)定用于實(shí)施色譜的合成顆粒。水合是由極性表面殘基與水相互作用所賦予的。這樣的顆粒結(jié)合蛋白或其他目標(biāo)制品。有機(jī)成核中心大的總累積表面積有利于蛋白質(zhì)-表面相互作用的頻率高于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。隨后添加的非離子型有機(jī)聚合物如聚乙二醇(PEG)或其它所謂排斥溶質(zhì)(約束劑)導(dǎo)致過(guò)量的水從相互作用的蛋白和表面轉(zhuǎn)移到整體溶劑，其結(jié)果是蛋白被截留在表面上。未捕獲的污染物被沖走。該結(jié)合保持穩(wěn)定，直到通過(guò)除去排斥溶質(zhì)而以目前純化的狀態(tài)除去PEG。
[0104]水合表面的高可用性有利于快速動(dòng)力學(xué)(秒-分鐘)，這在用排斥溶質(zhì)沉淀(30分鐘到數(shù)小時(shí))中是非常有利的。
[0105]與由蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)表面相互作用引起的常規(guī)廣義的沉淀和再增溶作用等溫線相比，水合表面的均勻性有利于狹義的吸附及解離等溫線。這轉(zhuǎn)化為更高的分辨率，例如較高的純化指數(shù)。
[0106]相比傳統(tǒng)沉淀方法，使用有機(jī)成核中心提高了分級(jí)分離速度和分辨率，其使用排斥溶質(zhì)，如非離子型有機(jī)聚合物如聚乙二醇，以及沉淀的鹽如硫酸銨等。
[0107]適合于實(shí)施本發(fā)明的約束劑尤其包括非離子有機(jī)聚合物，例如分子量一般為600到6，000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，但也可以為較低和較高的分子量?？梢杂行У厥褂闷渌请x子有機(jī)聚合物，例如但不限于聚丙烯乙二醇、葡聚糖等。適用于實(shí)施本發(fā)明的其它優(yōu)先排斥劑可以包括選自硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、磷酸鉀等的親液鹽；以及氨基酸如甘氨酸。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，不同優(yōu)先排斥劑賦予不同的選擇性。因此，可能值得比較用排除鹽相對(duì)于非離子型有機(jī)聚合物或氨基酸實(shí)現(xiàn)的結(jié)果，但一般而言用非離子性有機(jī)聚合物獲得最好的結(jié)果，特別是當(dāng)生物樣品是粗制組合物如細(xì)胞培養(yǎng)物上清液時(shí)。使用優(yōu)先排斥鹽和這樣的樣品通常遭遇高度著色的疏水性物質(zhì)在色譜載體上的堆積，其可導(dǎo)致操作壓力的失控增加。使用非離子性有機(jī)聚合物作為優(yōu)先排斥劑通常可以防止這樣的問(wèn)題，明顯是因?yàn)樵摼酆衔锕逃械氖杷?。雖然可以用不同類(lèi)別的優(yōu)先排斥劑如鹽與非離子有機(jī)聚合物的組合實(shí)施本發(fā)明，由于一些組合產(chǎn)生自發(fā)相分離還需小心。非離子型有機(jī)聚合物的另一個(gè)有價(jià)值的好處是它們的化學(xué)溫和。高濃度的PEG具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期聲譽(yù)，它們可以被活細(xì)胞良好耐受，許多FDA批準(zhǔn)的人-可注射治療制劑使用PEG作為非活性成分。
[0108]適用于實(shí)施本發(fā)明的色譜載體尤其包括具有高度水合表面的介質(zhì)。許多對(duì)于吸附色譜未官能化的基于聚合物的介質(zhì)具有密布羥基基團(tuán)的表面，所述羥基與水強(qiáng)烈相互作用使得表面高度水合。已用高度水合的材料官能化的表面也是理想的，可能包括固定的糖、淀粉、其他碳水化合物和酰脲。帶正電荷和負(fù)電荷的基團(tuán)也往往是高度水合的，并可以用來(lái)在高鹽條件下實(shí)施本發(fā)明，其中生物樣品組分與載體之間的電荷相互作用被有效地阻止。具有一些疏水特性的表面可以是合適的，如果它們具有足以支配表面的整體極性特征，這將排除用于進(jìn)行疏水相互作用色譜的大多數(shù)表面。雖然基于顆粒的色譜載體可以有足夠的效率用來(lái)展示對(duì)原理的證明，該方法所起的作用如此邊緣化，阻止了它的實(shí)際應(yīng)用。在高流速時(shí)有用的容量和分級(jí)分離能力只有在用對(duì)流色譜載體如整料和膜時(shí)實(shí)現(xiàn)。整料一般比膜支持更高的容量和分辨率，而膜一般比整料支持更高的流速?？赏ㄟ^(guò)簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)來(lái)確定最適合特定應(yīng)用的需要的方法。
[0109]可用本發(fā)明有效地純化的生物制品包括:蛋白質(zhì)包括抗體和凝血因子；病毒顆粒；細(xì)胞器如核糖體、線粒體和外泌體等。
[0110]可以通過(guò)添加干擾優(yōu)先排斥劑維持目標(biāo)制品結(jié)合的能力的試劑來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)合到載體上的生物制品的洗脫。這樣的試劑包括優(yōu)先表面活性劑、尿素、中性鹽、多糖和離液鹽如硫氰酸鈉或硫氰酸鉀、高氯酸鈉或高氯酸鉀和胍；或這些藥劑可以與降低優(yōu)先排斥劑的濃度一起使用，但在大多數(shù)情況下，減少優(yōu)先排斥劑的簡(jiǎn)單方法將是優(yōu)選的。
[0111]雖然色譜表面與目標(biāo)制品之間除了共享水合的水之外其他化學(xué)相互作用被理解為是零，該方法的選擇性和效率受pH值和電導(dǎo)率的顯著影響。這與預(yù)期一致，因?yàn)閜H值會(huì)影響制品的表面電荷，這會(huì)反過(guò)來(lái)影響其水合程度。電導(dǎo)率的影響目前尚不完全清楚，但是從實(shí)際的角度來(lái)看，包含顯著濃度的氯化鈉經(jīng)常具有降低工作壓力的常規(guī)效果，并允許向柱加載更高的容量。這點(diǎn)值得注意，因?yàn)樗c離子交換色譜和疏水相互作用色譜的行為相反，從而突出了該方法的獨(dú)特選擇性。一般而言，選擇性主要是目標(biāo)制品尺寸的函數(shù)，保留的強(qiáng)度與制品的尺寸成正比例增加。這與蛋白質(zhì)水合和尺寸成正比這一事實(shí)一致。實(shí)際的結(jié)果是，為實(shí)現(xiàn)結(jié)合所需的優(yōu)先排斥劑濃度與制品尺寸成反比。在低至5%的PEG-6000濃度實(shí)現(xiàn)良好的病毒結(jié)合，而IgM抗體需要其兩倍的濃度，且IgG抗體需要再高5%。
[0112]使用非離子有機(jī)聚合物的額外好處是，它提供與可能用于在使用本發(fā)明之后增加純度的其他色譜法的直接兼容性。PEG是非離子的，從而避免干擾基于非疏水性配體的色譜法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證實(shí)，通過(guò)本方法純化的抗體和病毒顆?？梢灾苯邮┘拥疥庪x子交換和羥基磷灰石柱，在這兩種情況下無(wú)需對(duì)樣品進(jìn)行中間平衡。這突出了這一點(diǎn)，即可以與一種或多種其他的方法一起實(shí)施本發(fā)明，通常包括其它的色譜法、沉淀法和液-液分配法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠開(kāi)發(fā)對(duì)于這些方法的合適條件，并將它們與本發(fā)明整合以實(shí)現(xiàn)特定生物制品所需的純化。
[0113]為準(zhǔn)備將包含目標(biāo)物的樣品與高度水合的色譜表面接觸，在某些實(shí)施方案中需要平衡色譜載體內(nèi)的化學(xué)環(huán)境。這可以通過(guò)使平衡緩沖液流過(guò)柱以建立相應(yīng)的條件來(lái)實(shí)現(xiàn)，特別是包括優(yōu)先排斥溶質(zhì)的濃度。在某些實(shí)施方案中，平衡緩沖液可以包括緩沖化合物以賦予適當(dāng)?shù)腜H值控制。這樣的化合物包括但不限于乙酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、MES、HEPES、BICINE、咪唑和Tris。平衡緩沖液的pH值可以為約pH4.0至約pH9.0。在適用于純化單克隆IgM抗體的一個(gè)實(shí)施方案中，平衡緩沖液包含的Hepes濃度為約50mM，pH值為7.0，氯化鈉濃度為200mM，以及PEG-6000濃度為12.5%。在適用于純化IgG的另一個(gè)實(shí)施方案中，平衡緩沖液包含的ifepes濃度為約50mM，pH值為約7.0，氯化鈉濃度為1.0M,以及PEG-6000濃度為15%。在適用于純化病毒顆粒的另一個(gè)實(shí)施方案中，平衡緩沖液包含的MES濃度為約50mM，pH值為5.8，氯化鈉濃度為600mM，以及PEG-6000濃度為6%。在適用于純化抗體的另一個(gè)實(shí)施方案中，平衡緩沖液包含的Hepes濃度為約50mM，pH值為約7.0，硫酸銨濃度為 1.5M。
[0114]在某些實(shí)施方案中，在實(shí)施本發(fā)明之前將制品制劑平衡到與柱平衡緩沖液相容的條件。在一個(gè)實(shí)施方案中，樣品可以通過(guò)一條線路泵至柱上，同時(shí)優(yōu)先排除溶質(zhì)的濃縮溶液通過(guò)另一條線路泵至柱上，并且兩條線路在緊鄰柱之前混合，以減少制品暴露于優(yōu)先排斥劑的柱前時(shí)間間隔，作為限制樣品流到柱之前可能發(fā)生沉淀的程度的手段。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)一條線路施加的優(yōu)先排斥劑的濃度為混合物目標(biāo)濃度的125%，優(yōu)選排斥劑與樣品的混合比例是80%試劑，20%樣品。在某些實(shí)施方案中，這提供了相當(dāng)有效的起點(diǎn)，僅需要確定最終混合物中所需優(yōu)先排斥劑的量，以實(shí)現(xiàn)期望的制品結(jié)合特點(diǎn)。在手工操作的方法中，所述優(yōu)先排斥劑的相對(duì)濃度和比例系數(shù)可以變化，以確定支持該最高容量和最低混合樣品體積的條件。
[0115]在某些實(shí)施方案中，優(yōu)先排斥劑是PEG-8000，或PEG-6000，或PEG-3500，或PEG-2000,或PEG-1000，或PEG-600。一般而言，聚合物越大，實(shí)現(xiàn)良好的結(jié)合所需的濃度越低。因?yàn)檩^低分子量的PEG傾向于具有不成比例的低粘度。由于較低的粘度一般有益于產(chǎn)生較低的工作壓力且對(duì)機(jī)械系統(tǒng)的攪拌能力施加的應(yīng)力較小，值得探討這個(gè)選項(xiàng)。
[0116]在某些實(shí)施方案中，平衡緩沖液的配方可以與平衡的樣品的配方基本上不同。例如可將1.2M氯化鈉加入到樣品中，而平衡緩沖液只含有200mM氯化鈉以維持400mM氯化鈉的凈樣品鹽濃度的目標(biāo)(在線稀釋比例80:20)，然后立即用200mM氯化鈉洗滌。由于更高的容量結(jié)合而有較高鹽濃度時(shí)可以使用這種策略，但較低的鹽濃度對(duì)于洗去污染物的特定子集更有效。除了鹽濃度不同，這兩個(gè)緩沖液也可能存在以下方面的差異:PH值或其他試劑的存在、不存在、或量?？赏ㄟ^(guò)任選性地使用第二洗滌緩沖液可實(shí)現(xiàn)類(lèi)似的效果。[0117]在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，加載樣品后，用洗滌緩沖液(通常具有和平衡緩沖液相同的組成)洗滌柱，以從色譜載體除去未結(jié)合的污染物。
[0118]在該方法的某些實(shí)施方案中，然后僅通過(guò)降低優(yōu)先排斥劑的濃度來(lái)從色譜載體洗脫產(chǎn)物，例如通過(guò)產(chǎn)生從ifepes/PEG至僅有Ifepes的緩沖液的梯度。
[0119]在另一實(shí)施方案中，優(yōu)先排斥劑的減少伴隨著一種或多種洗脫增強(qiáng)物質(zhì)的增加，其通過(guò)在梯度終點(diǎn)緩沖液中包含這類(lèi)物質(zhì)。這類(lèi)試劑的例子可包括尿素、精氨酸或表面活性劑等。
[0120]適合于實(shí)施本發(fā)明的某些實(shí)施方案的約束劑尤其包括非離子有機(jī)聚合物，例如分子量一般為600到6，000道爾頓的聚乙二醇(PEG)，但也可以為較低和較高的分子量。高濃度的PEG具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期聲譽(yù)，它們可以被活細(xì)胞良好耐受，許多FDA批準(zhǔn)的人-可注射治療配方使用PEG作為非活性成分?？梢杂行У厥褂闷渌请x子有機(jī)聚合物，例如但不限于聚丙烯乙二醇、葡聚糖等。適用于實(shí)施本發(fā)明的其它優(yōu)先排斥劑可以包括選自硫酸銨、硫酸鈉、檸檬酸鈉或檸檬酸鉀、磷酸鉀等的親液鹽；以及氨基酸如甘氨酸。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，不同優(yōu)先排斥劑賦予不同的選擇性。因此，可能值得比較用排除鹽相對(duì)于非離子型有機(jī)聚合物或氨基酸實(shí)現(xiàn)的結(jié)果。雖然可以用不同類(lèi)別的優(yōu)先排斥劑的組合，如鹽與非離子有機(jī)聚合物的組合來(lái)實(shí)施本發(fā)明，由于一些組合會(huì)產(chǎn)生自發(fā)相分離而必須小心。
[0121]適用于實(shí)施本發(fā)明的某些實(shí)施方案的色譜顆粒尤其包括具有高度水合表面的介質(zhì)。許多對(duì)于吸附色譜未官能化的基于聚合物的介質(zhì)具有密布羥基基團(tuán)的表面，所述羥基與水強(qiáng)烈相互作用，使得表面高度水合。已用高度水合的材料官能化的表面也是理想的，可能包括固定的糖、淀粉、其他碳水化合物和酰脲。帶正電荷和負(fù)電荷的基團(tuán)也往往是高度水合的，并可以用來(lái)在高鹽條件下實(shí)施本發(fā)明，其中生物樣品組分與載體之間的電荷相互作用被有效地阻止。具有一些疏水特性的表面可以是合適的，如果它們具有足以支配表面的整體極性特征，這將排除用于進(jìn)行疏水相互作用色譜的大多數(shù)表面。
[0122]可以用多孔顆粒實(shí)施本方法的某些實(shí)施方案，但已經(jīng)證明無(wú)孔顆粒是有利的。多孔顆粒提供了各種蛋白質(zhì)，包括污染物和目標(biāo)產(chǎn)物擴(kuò)散到孔中的可能性，然后在過(guò)程的不同階段逐漸漏出，影響純度或產(chǎn)品回收率，或兩者。
[0123]在某些實(shí)施方案中，顆粒的尺寸可以為小于IOOnm至大于200 μ m。這涵蓋了從納米顆粒到微顆粒，這兩者已被證明是有效的。顆?？梢杂扇魏尾牧蠘?gòu)成，包括聚合物、礦物或金屬，其中任何一個(gè)可以是表面組成與顆粒內(nèi)部不同的復(fù)合結(jié)構(gòu)。這尤其包括設(shè)計(jì)成由磁性分離器進(jìn)行收集的鐵芯顆粒，以及其中存在核心以在當(dāng)以所謂的膨脹床模式實(shí)施該方法時(shí)產(chǎn)生高密度的合金芯顆粒。后者的實(shí)例可以包括，例如，涂有纖維素的碳化鎢芯顆粒。
[0124]在某些實(shí)施方案中，顆粒的數(shù)量應(yīng)該是足以容納所有的目標(biāo)物的結(jié)合的量。這可以很容易地通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)確定。典型量可以為5%至20%，但該方法可以使用更低和更高的量來(lái)實(shí)施而不降低其有效性。一般而言，當(dāng)預(yù)計(jì)樣品材料批次之間變化時(shí)，使用適度大于實(shí)驗(yàn)確定的最小量的量是明智的。所謂的適度較大的量可以包括大10%，或大50%，或兩倍于最小量，取決于樣品組合物變化的水平。更大的量可能導(dǎo)致目標(biāo)物的不可接受的損失。
[0125]在某些實(shí)施方案中，所述約束劑可以作為液態(tài)濃縮物添加，以增加它在整個(gè)液體的分散效率?？梢允謩?dòng)進(jìn)行添加，或者通過(guò)使用泵自動(dòng)方便地添加?；蛘叱恋韯┛梢宰鳛榉勰┨砑?。這提供了降低最終處理體積的優(yōu)勢(shì)，但增加了添加必須發(fā)生的時(shí)間段，因?yàn)楸仨毴菰S時(shí)間以允許沉淀劑溶解。作為總的出發(fā)點(diǎn)，作為液體濃縮液添加沉淀劑可以在30分鐘內(nèi)或更長(zhǎng)完成，而添加干粉可以在60分鐘內(nèi)或更長(zhǎng)完成。后續(xù)試驗(yàn)將揭示對(duì)于任何給定應(yīng)用的具體限制。
[0126]可用本發(fā)明的實(shí)施方案有效地純化的生物制品包括:蛋白質(zhì)包括抗體和凝血因子；病毒顆粒；細(xì)胞器如核糖體、線粒體和外泌體等。一般而言，本發(fā)明有利于純化可以通過(guò)用鹽或非離子型有機(jī)聚合物沉淀來(lái)部分地純化的任何產(chǎn)物。
[0127]盡管本發(fā)明的方法的某些實(shí)施方案將被最頻繁地用于從不純的混合物沉淀目標(biāo)產(chǎn)物，它也可以被應(yīng)用于從制劑中沉淀特定污染物，而目標(biāo)產(chǎn)品保持可溶。
[0128]可以用非常簡(jiǎn)單到非常復(fù)雜的機(jī)械系統(tǒng)實(shí)施本發(fā)明，只要不脫離其基本特征。
[0129]因?yàn)楸景l(fā)明的某些實(shí)施方案涉及到共同沉淀的方法，為了實(shí)施它們，具有從該處測(cè)量其好處的給定起始點(diǎn)將是非常有用。實(shí)現(xiàn)這個(gè)的一種方法是，首先按照標(biāo)準(zhǔn)操作方法進(jìn)行硫酸銨沉淀和/或PEG沉淀，以產(chǎn)生參考材料。然后進(jìn)行本發(fā)明的鹽和/或PEG配伍。例如，對(duì)于IgG抗體的情況，將淀粉與抗體制劑按20%的重量體積比混合。在將淀粉徹底分散(攪拌)在抗體制劑中之后，在30分鐘的時(shí)間段內(nèi)將30% PEG-6000加入其中至15%的PEG終濃度。離心樣品以沉淀淀粉和共沉淀的抗體。通過(guò)用生理緩沖液重懸浮所述共沉淀物混合物以回收抗體，所述生理緩沖液為例如磷酸鹽緩沖的或Hepes緩沖的鹽水(100-150mMNaCl)，ρΗ6.8-7.2。對(duì)于IgM，較低的PEG量通常滿足，例如12.5%。對(duì)于病毒種類(lèi)，更低的PEG量通常滿足，例如5-7.5%PEG。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室方法表征純度、回收率和聚集體含量。
[0130]除了 PEG通常比沉淀鹽產(chǎn)生更好的效果，在某些實(shí)施方案中其提供了更廣泛的機(jī)會(huì)以微調(diào)該方法的選擇性，從而優(yōu)化純度和回收率。沉淀鹽的高電導(dǎo)率抑制蛋白質(zhì)之間電荷的相互作用，這使得不可能探索低電導(dǎo)率的影響，并使得系統(tǒng)對(duì)PH值變化作出具有更少響應(yīng)性的行為。用PEG，電導(dǎo)率可以通過(guò)諸如氯化鈉的非沉淀鹽從零到非常高之間變化。在特別低的電導(dǎo)率值，PH值變化可能會(huì)提供顯著機(jī)會(huì)來(lái)改變系統(tǒng)的選擇性。
[0131]在某些實(shí)施方案中，通常會(huì)值得探討用碳水化合物有機(jī)成核中心相對(duì)于用酰脲有機(jī)成核中心得到的結(jié)果的差異。例如，通過(guò)簡(jiǎn)單地用尿囊素取代淀粉并比較結(jié)果，要特別注意回收蛋白質(zhì)的聚集體含量，允許對(duì)在本發(fā)明某些實(shí)施方案中某些有機(jī)成核中心的相對(duì)優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行評(píng)估。由本發(fā)明的酰脲版本回收的抗體常常含有低1-2%的聚集體。由于與某些蛋白質(zhì)弱結(jié)合，酰脲可傾向于產(chǎn)生比淀粉低的病毒回收率，但該效果可以通過(guò)在進(jìn)行共沉淀的緩沖器中包括精氨酸或尿素來(lái)進(jìn)行補(bǔ)償。在將淀粉相對(duì)于尿囊素進(jìn)行基本評(píng)價(jià)之后，值得評(píng)估從這兩類(lèi)的更廣泛選擇得到的結(jié)果。
[0132]通過(guò)指定的有機(jī)成核中心、沉淀劑、pH值和電導(dǎo)率條件，可進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以確定每體積樣品所需的有機(jī)成核中心的量。在某些實(shí)施方案中，上述建議的20%的量將通常被證明過(guò)量?？梢栽u(píng)估更大的量，但較少量通常將被證明足夠。一般情況下，較小的量將證明是有利的，特別是如果該方法打算擴(kuò)大規(guī)模。
[0133]不論材料和比例，在某些實(shí)施方案中，最終產(chǎn)品的純度一般可以通過(guò)在初始共沉淀和回收步驟之間進(jìn)行中間洗滌步驟來(lái)改善。這個(gè)洗滌步驟可以由以下組成:將所述第一共沉淀物重懸浮于含有與原共沉淀混合物的沉淀劑濃度相同的干凈緩沖液中，然后棄去第二上清液。該操作稀釋了在初始沉淀之后可能存在于共沉淀物間隙的液體中污染物。如果希望產(chǎn)生更高水平的純度，可以重復(fù)該步驟。通過(guò)以過(guò)濾形式進(jìn)行洗滌代替離心可以便于進(jìn)行該步驟。
[0134]不論材料和比例，在某些實(shí)施方案中，通過(guò)進(jìn)行第二回收步驟通?？梢愿纳平K產(chǎn)物的回收率。在移除包含再溶解的產(chǎn)物的初始回收緩沖液之后，可以加入另一份干凈的緩沖液以重懸浮有機(jī)成核中心。這允許在第一回收步驟之后回收有機(jī)成核中心間隙中難以接近的再溶解產(chǎn)物。
[0135]如在上文討論的多個(gè)點(diǎn)中所表明的，在某些實(shí)施方案中，可以離心或過(guò)濾形式執(zhí)行本方法。
[0136]在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供用于純化大型生物化合物的方法，不限于任何特定的理論，相信其通過(guò)以下起作用:僅通過(guò)約束性共享所述大型生物化合物各自的水合鞘之間的水，在非反應(yīng)性親水性表面捕獲它們。通過(guò)優(yōu)先水合親水表面的試劑如聚乙二醇(PEG)來(lái)誘導(dǎo)和穩(wěn)定捕獲。選擇性與分子尺寸相關(guān)。保留隨PEG尺寸和濃度而增加。在接近目標(biāo)生物分子的等電點(diǎn)(Pl)時(shí)結(jié)合增強(qiáng)。鹽通過(guò)降低PEG尺寸而減弱保留。對(duì)于IgG，粗原料流的單步純化系數(shù)為90%以上；對(duì)于病毒顆粒,單步純化系數(shù)為99.8%。近生理pH值和電導(dǎo)率分級(jí)分離保護(hù)長(zhǎng)期不穩(wěn)定的生物制品如病毒和IgM的活性。整料上的病毒結(jié)合能力為約I萬(wàn)億顆粒/mL。基于磁性納米顆粒的版本實(shí)現(xiàn)比相應(yīng)的陽(yáng)離子交換顆粒高30倍的IgG結(jié)合容量。
[0137]如何將工藝的規(guī)模擴(kuò)大至支持給定應(yīng)用所需的程度對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。
實(shí)施例
[0138]實(shí)施例1.1gM的純化。攪拌IOOmL包含約50 μ g/mL IgM克隆529的澄清細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。將4g 土豆淀粉分散于溶液中。在30分鐘的時(shí)間段，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含30%PEG-6000的50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0，加入其中至10%的終濃度。再持續(xù)攪拌30分鐘，然后離心并移除上清。通過(guò)在10%PEG50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0中重懸浮來(lái)洗滌共沉淀的IgM-淀粉，然后離心并移除上清。通過(guò)添加50mL的50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0，從淀粉解離并回收IgM。通過(guò)尺寸排斥色譜分析來(lái)自該方法的選擇步驟的樣品。在第一上清液中發(fā)現(xiàn)大部分的宿主蛋白和細(xì)胞培養(yǎng)物組分。在回收的級(jí)分中發(fā)現(xiàn)約90%的純IgM，回收率為約70%。用來(lái)自水稻和玉米的淀粉重復(fù)試驗(yàn)。從玉米和水稻淀粉回收的IgM具有稍多的宿主蛋白污染物，并且水稻具有更多的高分子量聚集體。
[0139]實(shí)施例2.1gG的純化。攪拌IOOmL包含約800 μ g/mL的IgG克隆her2的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液。將2g 土豆淀粉分散于溶液中。在30分鐘的時(shí)間段，通過(guò)蠕動(dòng)泵將含30%PEG-6000的50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0，加入其中至15%的終濃度。再持續(xù)攪拌30分鐘，然后離心并移除上清。通過(guò)在15%PEG50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0中重懸浮來(lái)洗滌共沉淀的IgG-淀粉，然后離心并移除上清。通過(guò)添加50mL的50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0，從淀粉解離并回收IgG。使用相同的溶液和終點(diǎn)，通過(guò)無(wú)淀粉的PEG沉淀另一份IOOmL的上清液。通過(guò)尺寸排斥色譜分析回收的抗體樣品。從兩種方法回收的IgG包含約2%的聚集體。與硫酸銨相比產(chǎn)生了相同的結(jié)果。重復(fù)試驗(yàn)，用尿囊素替代土豆淀粉。從用尿囊素共沉淀回收的IgG包含約0.2%的聚集體，比其他方法降低約10倍。隨后用200mM精氨酸處理尿囊素釋放了高度聚集的IgG級(jí)分。IgM的相關(guān)實(shí)驗(yàn)揭示了相同的趨勢(shì)。用20g/L尿囊素的IgM回收率為75%，而用40g/l尿囊素的回收率為55%。這些結(jié)果顯示尿囊素優(yōu)先保留較大分子量的物質(zhì)種類(lèi)。這些還表明尿囊素可能具有聚集體抑制效果，可能是通過(guò)其表面的輕微氧化還原性質(zhì)介導(dǎo)的。
[0140]實(shí)施例3.1gM的純化。制備IgM細(xì)胞培養(yǎng)物上清液的三份稀釋液:1 X、2X、4X。將 4 克土豆淀粉加入 IOOmL 的每份溶液，并用 10%PEG6000 (50mM Hepes, IOOmM NaCl, pH7.0稀釋)共沉淀。從兩份較低稀釋液回收的抗體為約80%，而從4倍稀釋液回收的抗體僅為25%。
[0141]實(shí)施例4.病毒的純化。對(duì)包含噬菌體M13的大腸桿菌細(xì)胞培養(yǎng)物上清液樣品進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)。重復(fù)實(shí)施例1的條件，除了 PEG濃度為4%和8%PEG-6000。分析型陰離子交換色譜揭示了所有制劑產(chǎn)生約90%純度的噬菌體。用8%PEG估算的回收率為75%，但用4%PEG為小于25%。用30%和40%淀粉在6%PEG進(jìn)行另一系列的實(shí)驗(yàn)。用30%淀粉的回收率為約80%，而用40%淀粉的回收率為至少90%。用6%PEG，20%淀粉但是400，600和800mMNaCl進(jìn)行另一系列的實(shí)驗(yàn)。在鹽濃度為600mM和高于600mM Nacl時(shí)，估算的回收率為至少90%。在6%PEG，20%淀粉，600mM NaCl但是pH值為5、6、7、8、9進(jìn)行另一系列的實(shí)驗(yàn)。在pH值6和更低時(shí)估算回收率為至少90%，并隨著pH值上升而下降。最終操作條件為40%淀粉，6%PEG, 600mM NaCl, pH6.0，產(chǎn)生了 90%的純度和90%的回收率。
[0142]實(shí)施例5.進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，其中在不同pH值和不同濃度的PEG-6000評(píng)價(jià)等電點(diǎn)為約5.5的純化IgM單克隆抗體的結(jié)合性質(zhì)。用334 μ L OH整料在4mL/min的流速進(jìn)行所有這些實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖1。在10%PEG，pH5.0實(shí)現(xiàn)IgM的100%結(jié)合。圖1顯示，ρΗ9.5可以足以實(shí)現(xiàn)100%結(jié)合。在ll%PEG，pH6.0和12%PEG，pH7.0實(shí)現(xiàn)100%結(jié)合。這些結(jié)果指示，結(jié)合在物質(zhì)種類(lèi)的等電點(diǎn)附近最強(qiáng)烈的。用等電點(diǎn)大于9.0的IgM和估算等電點(diǎn)為約
7.0的另一個(gè)IgM重復(fù)試驗(yàn)。在兩種情況下，在最低pH值條件下觀察到最強(qiáng)的結(jié)合。這一實(shí)例表明，與IgG相同，IgM的溶解度在低pH值時(shí)最低，而無(wú)關(guān)等電點(diǎn)。如果IgM的等電點(diǎn)也在低PH值，那么將觀察到圖表中示出的模式。
[0143]實(shí)施例6.進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，其中以NaCl濃度的函數(shù)評(píng)估IgM的結(jié)合性質(zhì)。用PEG-6000在334 μ L OH整料以4mL/min的流速進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。結(jié)果在圖2中示出，隨著鹽濃度的增加，結(jié)合效率顯著下降，需要增加PEG-6000濃度以實(shí)現(xiàn)在高鹽濃度下的結(jié)合。用不同種類(lèi)的鹽進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，例如硫酸銨和硫氰酸鈉。硫氰酸鈉具有與NaCl大體上相同的效果，而硫酸銨對(duì)結(jié)合具有比NaCl更強(qiáng)的效果。這些結(jié)果共同表明鹽的效果會(huì)影響PEG的有效尺寸。
[0144]實(shí)施例7.PEG尺寸的效果。進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，其中以PEG尺寸的函數(shù)評(píng)價(jià)IgM結(jié)合。在334 μ L OH整料以4mL/min的流速進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。結(jié)果在圖3中示出，顯示較大的PEG能夠在較低濃度實(shí)現(xiàn)結(jié)合。
[0145]實(shí)施例8.通過(guò)約束共水合在淀粉改性的磁性納米顆粒上來(lái)純化單克隆IgG。將包含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液與淀粉改性的磁性顆?；旌?。通過(guò)蠕動(dòng)泵在30分鐘的時(shí)間段內(nèi)將含50%PEG-6000的50mM Hepes, 50mM NaCl, pH7.0，輸入其中至15%PEG的終濃度，然后在磁場(chǎng)中捕獲顆粒并移除上清液。通過(guò)將顆粒再次分散于15%PEG-6000，50mM Hepes, 50mMNaCl, pH7.0來(lái)洗滌它們，然后再次在磁場(chǎng)中收集它們并移除上清。將顆粒再次分散于5倍顆粒體積的50mM Hepes, 50mM NaCl, pH7.0,在磁場(chǎng)中收集顆粒并回收包含IgG的上清液。實(shí)施例4示出了通過(guò)該方法獲得的純度。估算回收率為90%。一系列的其他實(shí)驗(yàn)揭示了，能夠以相同組合物的蛋白A親和納米顆粒30倍的容量獲得90%的回收率和類(lèi)似的純化性能。這些結(jié)果被解釋為揭示了約束共水合色譜允許在納米顆粒的表面積累多層產(chǎn)物層，而純銅的吸附納米顆粒僅允許結(jié)合單層抗體。
[0146]實(shí)施例9.PEG濃度的效果。用病毒(質(zhì)量16.7MDa)、IgM(質(zhì)量960kDa)、IgG(質(zhì)量160kDa)和牛血清白蛋白(BSA，質(zhì)量67kDa)在不同的PEG濃度進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)，以評(píng)估生物分子尺寸的相對(duì)貢獻(xiàn)。用PEG-6000在334 μ L OH整料進(jìn)行所有實(shí)驗(yàn)。結(jié)果示于圖
5。具有最大質(zhì)量的物質(zhì)種類(lèi)在最低PEG濃度結(jié)合，而較小的物質(zhì)種類(lèi)需要較大的PEG濃度以實(shí)現(xiàn)同樣的結(jié)合。BSA在15%PEG-6000勉強(qiáng)開(kāi)始結(jié)合。這些結(jié)果突出了本技術(shù)的尺寸選擇性。使用不溶性淀粉或尿囊素作為基底代替OH整料進(jìn)行的平行試驗(yàn)顯示，同樣的關(guān)系繼續(xù)存在，而無(wú)論使用了哪種高度水合(親水)的基底。
[0147]實(shí)施例10.1gM的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。通過(guò)在12%PEG以恒定濃度供應(yīng)IgM，直到IgM開(kāi)始流過(guò)334 μ L OH整料柱(通過(guò)UV吸收增加來(lái)指示)，確定IgM單克隆抗體的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。這發(fā)生在已經(jīng)裝載39mg的IgM的時(shí)間點(diǎn)。在多種條件下用其他IgM的更早實(shí)驗(yàn)指示，動(dòng)態(tài)結(jié)合能力通常大于20mg/mL。
[0148]實(shí)施例11.病毒的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。通過(guò)在6%PEG以恒定濃度供應(yīng)噬菌體M13，直到噬菌體開(kāi)始流過(guò)334 μ L OH整料柱(通過(guò)UV吸收增加來(lái)指示)，確定噬菌體Μ13的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力。這發(fā)生在已經(jīng)裝載9.9Χ IO12個(gè)病毒顆粒的時(shí)間點(diǎn)。
[0149]實(shí)施例12.病毒感染性的保留。將在OH整料上以6%PEG_6000通過(guò)約束共水合色譜純化的噬菌體M13和未純化的噬菌體比較以測(cè)量相對(duì)生物活性。純化的噬菌體的感染性為約95%。在這種實(shí)驗(yàn)類(lèi)型內(nèi)在的誤差因子的情況下，應(yīng)當(dāng)理解這最可能反映了病毒活性的完全保留。
[0150]實(shí)施例13.病毒的結(jié)合效率和回收率。通過(guò)感染性和色譜的分析指示，上述的噬菌體M13的約束共水合色譜實(shí)現(xiàn)了來(lái)自原始未純化原料流的大于90%的結(jié)合效率，并且基本上所有噬菌體M13在洗脫液中被回收。
[0151]實(shí)施例14.病毒純化效率。對(duì)于大腸桿菌宿主蛋白的ELISA分析指示，通過(guò)約束共水合色譜的純化在該單一純化步驟中從噬菌體M13除去了 99.8%的蛋白污染物。隨后通過(guò)陰離子交換色譜步驟繼續(xù)純化，總計(jì)降低宿主細(xì)胞蛋白的99.99%ο AccuBlue分析顯示，約束共水合色譜移除了大于90%的DNA，并且隨后的陰離子交換步驟將DNA又降低10倍。
[0152]實(shí)施例15.單克隆IgG的純化。將具有約2 μ m平均通道尺寸的0.34mL的羥基整料附加至色譜。用50mM Hepes, 300mM氯化鈉，15%PEG_6000, pH7.0溶液以4mL/分鐘的流速平衡。然后通過(guò)在線稀釋向柱供應(yīng)125mL的樣品，20%的樣品，80%的稀釋緩沖液以產(chǎn)生15%的PEG終濃度。裝載完成后，用平衡緩沖液洗滌床以移除未結(jié)合的污染物。然后用漸降PEG梯度洗脫床。IgG在該梯度的最后四分之一中被洗脫。分析尺寸排斥色譜表明，抗體純度大于95%，而聚集體含量與通過(guò)蛋白A親和色譜純化的參照IgG類(lèi)似。
[0153]實(shí)施例16.用單克隆IgM比較不同高度水合的整料。在分開(kāi)的試驗(yàn)中，比較了用羥基基團(tuán)、陽(yáng)離子交換基團(tuán)(SO3)和陰離子交換基團(tuán)(QA)涂覆的0.34mL的整料。用50mMHepes, IM氯化鈉，12.5%PEG_6000，pH7.0溶液以4mL/分鐘的流速平衡各種整料。然后通過(guò)在線稀釋向柱供應(yīng)125mL的樣品，20%的樣品，80%的稀釋緩沖液以產(chǎn)生12.5%的PEG終濃度。裝載完成后，用平衡緩沖液洗滌床以移除未結(jié)合的污染物。然后用漸降PEG梯度洗脫床。終點(diǎn)緩沖液也包含IMNaCl，使得鹽濃度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間為同高的，從而抵消電荷相互作用的效果。
[0154]實(shí)施例17.從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液(克隆A3，20 μ g/mL IgM,補(bǔ)充有20%血清)純化單克隆IgM。將具有約2μπι平均通道尺寸的8mL的羥基整料附加至色譜。用50mMHepes, 300mM氯化鈉，12.5%PEG-6000, pH7.0溶液以75mL/分鐘的流速平衡。然后通過(guò)在線稀釋向柱供應(yīng)1250mL的含有IgM的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，20%的樣品，80%的稀釋緩沖液以產(chǎn)生12.5%的PEG終濃度。裝載完成后，用平衡緩沖液洗滌床以移除未結(jié)合的污染物。然后用漸降PEG梯度洗脫床。IgG在該梯度的最后四分之一中被洗脫。分析尺寸排斥色譜顯示，抗體純度大于95%，回收率為63%。
[0155]實(shí)施例18.從細(xì)胞培養(yǎng)物上清液純化單克隆IgM。將具有約2 μ m平均通道尺寸的8mL的羥基整料附加至色譜。用50mM Hepes, 300mM氯化鈉，12.5%PEG-6000, pH7.0溶液以75mL/分鐘的流速平衡。然后通過(guò)在線稀釋向柱供應(yīng)1250mL不同的含有IgM的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液，20%的樣品，80%的稀釋緩沖液以產(chǎn)生12.5%的PEG終濃度。裝載完成后，用平衡緩沖液洗滌床以移除未結(jié)合的污染物。然后用漸降PEG梯度洗脫床。IgG在該梯度的最后四分之一中被洗脫。分析型尺寸排斥色譜顯示，抗體純度大于95%。將IgM級(jí)分施加到IOmL的羥基磷灰石柱(II型CHT，40 μ m),并用線性梯度增加至300mM的磷酸鈉洗脫。用水1:1稀釋IgM級(jí)分，并在50mM Hepes, pH7.0中以75mL/分鐘的流速裝載在8ml QA陰離子交換整料上，然后用10倍柱體積包含線性梯度遞增至300mM的氯化鈉的50mM Hepes, pH7.0洗脫。分析型尺寸排斥色譜指示，3-步法支持60%的總回收率，而產(chǎn)生大于99%的純IgM^S有可檢測(cè)到的聚集體或片段。本實(shí)施例證明了，本發(fā)明與其他純化方法組合產(chǎn)生了完整的純化過(guò)程。以200mM Na Cl重復(fù)試驗(yàn)。與300mM相比，回收率和純度基本不變。
[0156]實(shí)施例19.纖維蛋白原的分級(jí)分離。用50mM Hepes, 2.0M甘氨酸，IOmMEDTA, pH7.0平衡0.34mL的羥基整料。通過(guò)在線稀釋向柱供應(yīng)125mL的部分純化的人纖維蛋白原，20%的樣品，80%的稀釋緩沖液以產(chǎn)生2.0M的甘氨酸終濃度。在樣品應(yīng)用期間一些污染物流過(guò)柱。裝載完成后，用平衡緩沖液洗滌床以移除未結(jié)合的污染物。然后用漸降甘氨酸梯度洗脫床，產(chǎn)生寬的不均勻纖維蛋白原峰。操作壓力在運(yùn)行期間增加，通過(guò)用3M胍洗滌柱逆轉(zhuǎn)這一效果。
[0157]實(shí)施例20.抗血友病因子(因子VII1-vWF復(fù)合物)的純化。用8%PEG_6000，50mMHepes, 200mM NaCl，pH7.0平衡0.34mL的羥基整料。將抗血友病因子與人血清白蛋白(HSA)的混合物施加到相同濃度的PEG-6000。HAS難以結(jié)合，并在裝載期間被清除。用平衡緩沖液短暫地沖洗柱，以IOmL的線性梯度至50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0洗脫抗血友病因子。
[0158]實(shí)施例21.病毒純化。用 6%PEG-6000, 50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0 平衡 ImL的羥基整料。通過(guò)用 12%PEG-6000, 50mM Hepes, 600mM NaCl, ρΗ7.0 與 50mM Hepes, 600mMNaCl, pH7.0的50:50混合物平衡來(lái)進(jìn)行這一步驟。通過(guò)用12%PEG緩沖液在線稀釋裝載IOOmL的噬菌體M13，產(chǎn)生200mL于6%PEG中的病毒樣品。大部分污染物流過(guò)整料，而用平衡緩沖液沖洗掉其殘余物。然后用IOmL線性梯度至50mM Hepes, 600mM NaCl，pH7.0來(lái)洗脫柱。分析型陰離子交換色譜證明90%回收90%的純病毒，并且去除了 90%的DNA。隨后的分析顯示病毒保持感染性。在陰離子交換整料上進(jìn)行的第二純化步驟實(shí)現(xiàn)大于99%的純度，綜合回收率為80%，DNA再降低1000倍。完整的2-步方法在2小時(shí)內(nèi)完成。
[0159]實(shí)施例22.外泌體的優(yōu)先排斥色譜純化。用6%PEG6000, 50mM Hepes, 200mM NaClρΗ7.0 以 8mL/min 平衡 ImL 羥基整料。通過(guò)用 8%PEG6000, 50mM HEPES, 200mM NaCl ρΗ7.0在線稀釋得到6%當(dāng)量的PEG6000濃度以裝載由間充質(zhì)干細(xì)胞分泌的外泌體制劑。然后用6%PEG6000洗滌整料，并用8mL線性梯度至50mM HEPES, 200mM NaCl pH7.0洗脫。通過(guò)在600nm觀察吸光度在線檢測(cè)外泌體的存在。離線檢測(cè)使用動(dòng)態(tài)光散射。兩種檢測(cè)方法均顯示洗脫液中外泌體的存在，突出了本方法純化細(xì)胞器的實(shí)用性。
[0160]實(shí)施例23.在羥基多孔微顆粒上純化單克隆IgG。將IOmL Toyopearl HW75M顆粒分散于IOOmL包含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。在I小時(shí)的過(guò)程中添加飽和的硫酸銨至1.5M的終濃度。將顆粒放置在過(guò)濾器上并吸出液體。然后將顆粒填充在柱中，用
12.5%PEG-600050mM Hepes, 300mM NaCl, pH7.0洗滌，然后用10倍柱體積的遞減PEG梯度洗脫。觀察到聚集體比非聚集的抗體洗脫得更晚。分析型尺寸排斥色譜(SEC)顯示IgG純度大于95%。
[0161]實(shí)施例24.在無(wú)孔二氧化硅顆粒上純化單克隆IgG。將5mL無(wú)孔二氧化硅10 μ m微球分散于IOOmL包含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。在30分鐘的過(guò)程中添加飽和的硫酸銨至
1.5M的終濃度。將顆粒放置在過(guò)濾器上并抽掉液體。用1.5M硫酸銨沖洗仍在過(guò)濾儀器中保留的顆粒，然后將硫酸銨吸出。更換過(guò)濾容器，通過(guò)添加2倍床體積的50mM Hepes, 0.3Msodium chloride, pH7.0從所述顆粒解離IgG,然后通過(guò)過(guò)濾器吸出。分析型SEC顯示抗體純度大于95%。
[0162]實(shí)施例25.在無(wú)孔二氧化硅微球上兩步法純化單克隆IgG。將5mL無(wú)孔二氧化硅IOym微球分散于IOOmL包含IgG的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。在30分鐘的過(guò)程中將含30%PEG-6000的50mM Hepes, pH7.0,加入其中至15%的終濃度。將顆粒放置在過(guò)濾器上并吸出液體。用15%PEG，300mM氯化鈉，50mM Hepes, pH7.0洗滌保留在過(guò)濾儀器中的顆粒，然后將其吸出。更換過(guò)濾容器，通過(guò)添加2倍床體積的50mM Hepes, 0.3M sodiumchloride, pH7.0從所述顆粒解離IgG,然后通過(guò)過(guò)濾器吸出。分析型SEC顯示抗體純度大于95%。在羥基磷灰石柱(I型CHT，40 μ m)上分級(jí)分離這種材料以除去IgG片段和聚集體。分析型SEC顯示材料沒(méi)有聚集體，純度為約99%。
[0163]實(shí)施例26.在羥基多孔微顆粒上純化IgM單克隆抗體。將5mLS印hadex G25超細(xì)粉分散于IOOmL包含IgM的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。在15分鐘的過(guò)程中將飽和的硫酸銨加入其中至1.2M的終濃度。將懸浮液施加到0.22 μ m過(guò)濾膜上并吸出液體。將顆粒重懸浮在1.2M硫酸銨中，并再次吸出液體。將顆粒重懸浮在12.5%PEG-6000, IOOmM氯化鈉，50mMHepes, pH7.0中。更換過(guò)濾容器,用50mM Hepes, IOOmM氯化鈉，pH7.0重懸浮顆粒,通過(guò)過(guò)濾器吸出包含抗體的液體。分析型SEC顯示材料純度大于95%。
[0164]實(shí)施例27.3-步法純化單克隆IgM。將IOmL無(wú)孔10 μ m二氧化硅微球分散于IOOmL包含IgM的細(xì)胞培養(yǎng)物上清液中。在30分鐘的過(guò)程中將30%PEG-6000in50mM Hepes, pH7.0，加入其中至10%PEG的終濃度。將懸浮液施加到0.22 μ m過(guò)濾膜上并吸出液體。將顆粒重懸浮在10%PEG-6000，IM NaCl, 50mM Hepes, pH7.0中并吸出液體。更換過(guò)濾容器，通過(guò)添加25mL50mM Hepes, IM NaCl, 0.1%聚山梨醇酯_20從顆粒解離IgM,并通過(guò)過(guò)濾器吸出IgM。將IgM施加到羥基磷灰石柱(II型CHT，40 μ m)上，并用磷酸鹽梯度洗脫。IgM級(jí)分沒(méi)有聚集體和片段。用水1:1稀釋羥基磷灰石洗脫液，并施加到用50mM !fepes，pH7.0平衡的陰離子交換整料(QA，8mL)，然后用線性梯度至300mM氯化鈉，50mM Hepes, pH7.0洗脫。IgM純度大于99%，并且沒(méi)有聚集體。
[0165]實(shí)施例28.抗血友病因子(因子VII1-vWF復(fù)合物)的純化。將ImL的ΙΟμπι無(wú)孔二氧化硅微球分散于濃度為lmg/mL的人重組抗血友病因子和濃度為10mg/mL的人血清白蛋白(HSA)的 IOmL溶液中，。將包含 30%PEG_6000 的 50mM Hepes, IOOmM NaCl, ρΗ7.0，加入其中至10%的終濃度。將懸浮液施加到0.22 μ m過(guò)濾器上并吸出液體。將顆粒重懸浮在IOmL的50mM Hepes, IOOmM NaCL, 10%PEG-6000, pH7.0,并移除液體。更換過(guò)濾容器，并通過(guò)將顆粒重懸浮在50mM Hepes, IOOmM NaCl, pH7.0中來(lái)從顆粒洗脫抗血友病因子?？寡巡∫蜃記](méi)有HSA，回收率為67%。
[0166]實(shí)施例29.病毒純化。將ImL的10 μ m無(wú)孔二氧化娃微球分散于20mL的卩遼菌體 M13 中。將包含 12%PEG-6000 的 50mM Hepes, 600mM NaCl, pH7.0，加入其中至 6% 的終濃度。將懸浮液施加到0.22 μ m過(guò)濾器上并吸出液體。將顆粒重懸浮在IOmL的50mMHepes, 600mM NaCl, 6%PEG-6000, pH7.0,并移除液體。更換過(guò)濾容器，并通過(guò)將顆粒重懸浮在50mM Hepes, 50mM NaCl, pH7.0中來(lái)從顆粒洗脫病毒。分析型陰離子交換色譜證明30%回收了 80%純的病毒，并且去除了 90%的DNA。隨后的分析顯示病毒保持感染性。
[0167]實(shí)施例30.外泌體的純化。將IOmL的10 μ m無(wú)孔二氧化硅微球分散于IOOmL的由人干細(xì)胞分泌的外泌體制劑中。將包含30%PEG-6000的50mM Hepes, 200mM NaCl, pH7.0,加入其中至6%的終濃度。將懸浮液施加到0.22 μ m過(guò)濾器上并吸出液體。將顆粒重懸浮在IOmL的50mM Hepes, 200mM NaCl, 6%PEG-6000, pH7.0，并移除液體。更換過(guò)濾容器，并通過(guò)將顆粒重懸浮在50mM Hepes, 50mM NaCl, pH7.0中來(lái)從顆粒洗脫外泌體。差示光散射和多波長(zhǎng)監(jiān)測(cè)確認(rèn)了洗脫液中外泌體的存在。
[0168]實(shí)施例31.使用無(wú)孔淀粉涂覆的磁性納米顆粒純化IgG。向ImL的Her2細(xì)胞培養(yǎng)物上清液樣品中加入5mg的200nm或I μ m的磁性納米顆粒。將包含45%(w/v)PEG6000的50mM HEPESlOOmM NaCl pH7.0加入到微量離心管中，至15%PEG6000的終濃度，并手動(dòng)混合。通過(guò)施加磁場(chǎng)澄清懸浮液，使`用微量吸管去除上清液。通過(guò)將珠懸浮在50mM HEPES, IOOmMNaCl pH7.0中來(lái)從顆粒洗脫結(jié)合的IgG。分析型SEC顯示IgG純度大于95%。
[0169]實(shí)施例32.病毒的基于整料的CCC純化。具有羥基化的表面和平均2μπι通道的聚甲基丙烯酸酯整料被用于評(píng)價(jià)約束共水合實(shí)現(xiàn)選擇性保留病毒的能力。整料中的質(zhì)量傳遞通過(guò)對(duì)流發(fā)生，其不受擴(kuò)散率限制的影響，所述擴(kuò)散率限制阻塞用多孔顆粒填充的柱[Hahn, R., Panzer, Μ., Hansen, Ε., Mollerup, J., Jungbauer, A., Monoliths forseparation of biomolecules.Sep.Sc1.Technol., 371545-1565 (2002).;Strancar, A., Podgornik, A., Barut, M., Necina, R., Short monolithic columns as stationary phasesfor biochromatography.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.7649-85(2002);Jungbauer, A.,Chromatographic Media for Bioseparation, J.Chromatogr.A, 10653 - 12(2005)]。 通過(guò)擴(kuò)展，色譜性能不受粘度影響。整料也缺乏空隙空間，在顆粒柱中主要在空隙空間產(chǎn)生瑞流剪切力[Levy, M.S., O，Kennedy, R.D., Ayaz1-Shamlou, P., Dunni 11, P., Biochemicalengineering approaches to the challenges of producing pure plasmid DNA.TrendsBiotechnol., 18296-305(2000);Lendero-Krajnc, N., Smrekar, F., Strancar, A., Podgornik，A.，Adsorption behavior of large plasmids on the anion-exchange methacrylatemonolithic columns.J.Chromatogr.A.，12182413-2424 (2011)]，并且它們的大通道降低了穿過(guò)床的壓力降。噬菌體M13以弱柔性棒存在，長(zhǎng)度為916mn，直徑為7.2nm,分子量為約16.7MDa24。通過(guò)一個(gè)泵加載過(guò)濾的大腸桿菌上清液，并用通過(guò)另一個(gè)泵以相同流速輸送的12%PEG-6000在線稀釋。病毒在6%PEG混合物中的整料前(pre-monolith)停留時(shí)間計(jì)算為約I秒，不足以在病毒與整料表面接觸之前發(fā)生顯著沉淀。未保留的物質(zhì)通過(guò)整料的時(shí)間為約5秒。大于90%來(lái)自2.5L樣品的病毒被0.34mL整料保留，突出了快速結(jié)合動(dòng)力學(xué)和高濃度指數(shù)。隨后用6%PEG，600mM NaCl, 50mM ifepes，pH7.0洗滌整料，然后用線性梯度至50mM Hepes, 600mM NaCl，pH7.0洗脫。洗脫曲線使人聯(lián)想到親和色譜，幾乎所有污染物從柱流過(guò)，并在2.5mL的級(jí)分中回收病毒(圖6)。用純化的噬菌體確定的動(dòng)態(tài)結(jié)合能力為
9.9X1012cfu/mL整料。宿主細(xì)胞ELISA證明了大腸桿菌蛋白減少99.8%。AccuBlue證明了 DNA減少92%。CCC純化的病毒的感染性與未純化的病毒相當(dāng)，突出了該分離方法和條件的溫和影響。(參見(jiàn)圖6)。
[0170]實(shí)施例33.1GM的基于整料的CCC純化。OH整料也用于評(píng)估約束共水合實(shí)現(xiàn)選擇性保留IgM的能力。這一類(lèi)型的抗體是特別不穩(wěn)定的，分子量為約lMDa25。通過(guò)在線稀釋加載生長(zhǎng)在補(bǔ)充有20%血清的細(xì)胞培養(yǎng)基中的單克隆IgM，以I份上清比4份12.5%PEG-6000,產(chǎn)生10%的PEG終濃度。隨后用10%PEG，200mM NaCl, 50mM Hepes, pH6.0洗滌整料，然后用線性梯度至50mM Hepes, 200mM NaCl, pH6.0洗脫。CCC能夠?qū)崿F(xiàn)單克隆IgM的90%純度和70%回收率，盡管最初抗體濃度僅為約20μ g/mL(圖7)。此后，我們用在相同條件下生長(zhǎng)的多于20份IgM克隆實(shí)現(xiàn)類(lèi)似的CCC結(jié)果。對(duì)于在無(wú)蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的更高產(chǎn)克隆，純度增加至高達(dá)95%，回收率高達(dá)90%。對(duì)于不同的克隆，動(dòng)態(tài)結(jié)合容量范圍為20至38mg IgM/mL整料。有時(shí)，實(shí)際容量更多地由壓力而不是表面可利用率確定，因?yàn)閴毫﹄S樣品整個(gè)上載的過(guò)程線性地增加。人們認(rèn)為這是由于整料的通道因蛋白在其表面堆積而逐漸變窄，或如圖6所不由病毒介導(dǎo)。(參見(jiàn)圖7)。
[0171]本發(fā)明可以與其他純化方法組合以實(shí)現(xiàn)更高水平的純化。實(shí)例包括但不限于，常用于純化蛋白或病毒的其他方法，例如沉淀法、親和層析、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定化金屬親和層析，以及其他混合模式的色譜法。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠開(kāi)發(fā)針對(duì)不同方法的合適條件，并將它們與本發(fā)明整合以實(shí)現(xiàn)特定抗體的必要純化。
[0172]所有本文引用的參考文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文并用于所用目的，如同特別和單獨(dú)指出通過(guò)引用將每一個(gè)單獨(dú)的出版物或?qū)＠驅(qū)＠暾?qǐng)以其整體并入本文并用于所用目的一樣。對(duì)于通過(guò)引用并入的出版物和專(zhuān)利或?qū)＠暾?qǐng)的范圍與本說(shuō)明書(shū)中包含的公開(kāi)之間的矛盾，說(shuō)明書(shū)旨在取代和/或優(yōu)先于任何此類(lèi)矛盾的材料。
[0173]所有表示成分、操作條件等的量以及在說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求中使用的量的數(shù)字都應(yīng)當(dāng)理解為在所有情況下被術(shù)語(yǔ)“約”所修飾。因此，除非有相反的指示，在本說(shuō)明書(shū)和所附的權(quán)利要求中所列舉的數(shù)值參數(shù)是近似值，根據(jù)本發(fā)明試圖獲得的所需性能，其可以發(fā)生變化。
[0174]可以對(duì)本發(fā)明作出多種修飾和改變而不偏離其實(shí)質(zhì)和范圍，這對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。本文描述的具體實(shí)施方案僅以示例的方式提供而不意圖為任何方式的限制。意圖本說(shuō)明書(shū)和實(shí)施例僅是示例性的，本發(fā)明的真實(shí)范圍和實(shí)質(zhì)由所附權(quán)利要求所指
/Jn ο
【權(quán)利要求】
1.用于純化樣品中生物來(lái)源的水合目標(biāo)物的方法，其包括以下步驟:將所述樣品與不溶材料的水合表面接觸，和將所述樣品與約束劑接觸，所述約束劑的量足以使目標(biāo)物的至少一部分被保留在所述不溶材料的水合表面上。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中多于50%的所述水合目標(biāo)物被保留在所述不溶材料的水合表面上。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中基本上所有所述水合目標(biāo)物被保留在所述不溶材料的水合表面上。
4.如權(quán)利要求1-3所述的方法，其中由于至少一種約束劑的存在，所述水合目標(biāo)物的至少一個(gè)個(gè)體僅通過(guò)約束共水合被保留在水合表面上。
5.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其中所述目標(biāo)物是蛋白質(zhì)、抗體、凝血因子、細(xì)胞器、病毒、病毒樣顆粒、基因治療載體或細(xì)胞。
6.如權(quán)利要求1-5所述的方法，其中所述樣品是細(xì)胞培養(yǎng)物收集物、細(xì)胞培養(yǎng)物上清液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含蛋白質(zhì)的溶液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含抗體的溶液、來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)物的含病毒的溶液，或來(lái)自純化前期的包含目標(biāo)物的溶液。
7.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述目標(biāo)物是蛋白質(zhì)。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其中所述目標(biāo)物是凝血因子。
9.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述目標(biāo)物是IgA、IgD、IgE、IgG或IgM類(lèi)型的多克隆抗體或單克隆抗體， 或其片段或化合物重組構(gòu)建體。
10.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述目標(biāo)物是原核細(xì)胞、真核細(xì)胞、干細(xì)胞。
11.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述目標(biāo)物是病毒、脂質(zhì)包膜病毒、蛋白質(zhì)衣殼病毒或病毒樣顆粒。
12.如權(quán)利要求1-6所述的方法，其中所述目標(biāo)物是外來(lái)體、脂質(zhì)體、線粒體、葉綠體、溶酶體或其他細(xì)胞器。
13.如權(quán)利要求1-12所述的方法，其中所述不溶材料的表面具有一個(gè)或多個(gè)極性的化學(xué)部分。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其中所述極性的化學(xué)部分選自羥基、胺、亞胺、酰脲、碳水化合物、氨基酸、肽、陽(yáng)離子帶電基團(tuán)或陰離子帶電基團(tuán)。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述極性的化學(xué)部分是選自葡萄糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、單糖、二糖和多糖中的碳水化合物。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述極性的化學(xué)部分為選自尿素、尿酸、尿囊素、乙內(nèi)酰脲中的酰脲。
17.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述極性的化學(xué)部分是組氨酸、甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、賴(lài)氨酸、精氨酸或硒代半胱氨酸。
18.如權(quán)利要求1-17所述的方法，其中所述約束劑選自鹽、糖、非離子有機(jī)聚合物、無(wú)機(jī)聚合物、親液鹽、同時(shí)具有正電荷和負(fù)電荷的兩性聚合物和氨基酸。
19.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述約束劑是硫酸銨、檸檬酸鈉、檸檬酸鉀、磷酸鉀和氯化鈉。
20.如權(quán)利要求18所述的方法，其中所述約束劑是水溶性不帶電的直鏈或支鏈的非離子有機(jī)聚合物。
21.如權(quán)利要求20所述的方法，其中所述約束劑選自聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、葡聚糖、淀粉、纖維素。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其中所述約束劑是聚乙二醇。
23.如權(quán)利要求22所述的方法，其中所述聚乙二醇具有100至10，000D的平均聚合物重量。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其中所述聚乙二醇具有600至8，000D的平均聚合物重量。
25.如權(quán)利要求22-24所述的方法，其中以約2%至50%(w/v)的濃度提供所述聚乙二醇。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其中以約2%至25%(w/v)的濃度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有高于約6，000D的平均聚合物重量。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其中以約15%至50%(w/v)的濃度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有低于約6，000D的平均聚合物重量。
28. 如權(quán)利要求25所述的方法，其中以約2%至25%(w/v)的濃度提供所述聚乙二醇，并且所述聚乙二醇具有約4，000D至約8，000D的平均聚合物重量。
29.如權(quán)利要求1-28所述的方法，其中所述不溶材料構(gòu)成有機(jī)成核中心。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述有機(jī)成核中心包含碳水化合物、酰脲或肽。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述酰脲是尿囊素。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述碳水化合物是淀粉或纖維素。 32.如權(quán)利要求31所述的方法，其中所述有機(jī)成核中心包括核心，目標(biāo)物的外層通過(guò)化學(xué)或靜電引力與所述核心結(jié)合或者通過(guò)約束共水合保留在所述核心上，其中目標(biāo)物的該外層提供了不溶材料的水合表面。
33.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述有機(jī)成核中心僅通過(guò)約束共水合保留目標(biāo)物的多個(gè)層。
34.如權(quán)利要求31-34所述的方法，其中在將所述樣品與所述約束劑接觸的步驟之前，將所述樣品與所述有機(jī)成核中心接觸。
35.如權(quán)利要求35所述的方法，其還包括以下步驟:將含有污染物的上清液從有機(jī)成核中心分離，所述有機(jī)成核中心具有保留在所述有機(jī)成核中心的水合表面上的目標(biāo)物。
36.如權(quán)利要求36所述的方法，其還包括以下步驟:通過(guò)將所述有機(jī)成核中心暴露于促進(jìn)目標(biāo)物從有機(jī)成核中心解離的條件下，以從所述有機(jī)成核中心回收所述目標(biāo)物。
37.如權(quán)利要求37所述的方法，其中通過(guò)充分地降低約束劑的濃度從所述有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物。
38.如權(quán)利要求37-38所述的方法，其包括將所述有機(jī)成核中心與不包含所述約束劑的溶液接觸的步驟。
39.如權(quán)利要求37-39所述的方法，其中所述鹽的濃度增大到足以減少約束劑的有效性，從而將所述目標(biāo)物保留在所述有機(jī)成核中心的水合表面。
40.如權(quán)利要求37-39所述的方法，其中所述糖的濃度增大到足以降低約束劑將所述目標(biāo)物約束在所述有機(jī)成核中心的水合表面的能力。
41.如權(quán)利要求41所述的方法，其中所述糖選自山梨糖醇、木糖醇和蔗糖，并且所述約束劑是聚乙二醇。
42.如權(quán)利要求37-41所述的方法，其中在從所述有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物之前，所述方法還包括一個(gè)或多個(gè)洗漆有機(jī)成核中心的步驟。
43.如權(quán)利要求37-42所述的方法，其中在從所述有機(jī)成核中心解離所述目標(biāo)物的步驟中使用的溶液與用于回收所述目標(biāo)物的溶液是基本相同的。
44.試劑盒，其包括有機(jī)成核中心、約束劑，所述試劑盒配置用于方便執(zhí)行權(quán)利要求1-43中任一項(xiàng)所述的方法。
45.如權(quán)利要求1-28所述的方法，其中所述不溶材料包含顆粒。
46.如權(quán)利要求45所述的方法，其中所述顆粒是納米顆粒、微粒。
47.如權(quán)利要求45-46所述的方法，其中所述顆粒是磁性的、順磁性的或高密度的。
48.如權(quán)利要求45-47所述的方法，其中所述顆粒包含選自以下的材料:具有聚合物涂層的金屬芯顆粒、具有纖維素涂層的金屬芯顆粒、玻璃顆粒、聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯、親硫的磁性顆粒、纖維素涂覆的碳化鎢顆粒、二氧化硅顆粒、瓊脂糖顆粒、纖維素顆粒和復(fù)合顆粒。
49.如權(quán)利要求46-48所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約IOOnm至約500μ m。
50.如權(quán)利要求49所 述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約IOOnm至約50μ m。
51.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約IOOnm至約4μm。
52.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約IOOnm至約3μ m。
53.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約IOOnm至約Iμ m。
54.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約200nm至約2μ m。
55.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約200nm至約500nm。
56.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約500nm至約Iμ m。
57.如權(quán)利要求49所述的方法，其中所述顆粒的尺寸為約5μ m至約50 μ m。
58.如權(quán)利要求45所述的方法，其中將靶樣品與顆粒接觸的步驟發(fā)生在將樣品與約束劑接觸的步驟之前。
59.如權(quán)利要求45-58所述的方法，其還包括以下步驟:從液相中分離顆粒，所述顆粒具有與其水合表面結(jié)合的目標(biāo)物，和從所述顆粒解離所述目標(biāo)物。
60.如權(quán)利要求58-71所述的方法，其中如果所述顆粒的表面包括帶電荷部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、電導(dǎo)率和鹽濃度以阻止目標(biāo)物與所述帶電荷部分之間的直接相互作用。
61.如權(quán)利要求58-71所述的方法，其中如果所述對(duì)流色譜材料的表面包括帶電荷部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、電導(dǎo)率和鹽的濃度，以在將所述樣品與約束劑接觸的步驟的至少一部分過(guò)程中阻止所述目標(biāo)物與所述帶電荷部分之間的直接相互作用，使得在所述一部分過(guò)程中所述目標(biāo)物僅通過(guò)約束共水合被保留在水合表面上。
62.如權(quán)利要求59所述的方法，其中解離所述目標(biāo)物的步驟包括用溶液洗滌所述顆粒，其中所述溶液:(i)不包含所述約束劑，(ii)包含所述約束劑，所述約束劑的量足以將所述目標(biāo)物保留在所述顆粒的水合表面，(iii)包含引起所述目標(biāo)物從所述顆粒的水合表面解離的試劑，(iv) (i)和(iii)的組合，或(iv) (ii)和(iii)的組合。
63.如權(quán)利要求62所述的方法，其中所述在約束劑的存在下引起所述目標(biāo)物從所述顆粒的水合表面解離的試劑選自表面活性劑、酰脲、糖、鹽、螯合劑或離液劑。
64.如權(quán)利要求45-63所述的方法，其中在約I分鐘至約5小時(shí)、2分鐘至15分鐘、2分鐘至30分鐘、10分鐘至30分鐘、2分鐘至2小時(shí)或約2分鐘至2小時(shí)的時(shí)間段內(nèi)，將所述約束劑加入到所述樣品和顆粒中。
65.如權(quán)利要求45-64所述的方法，其中通過(guò)離心、沉淀、傾濾、使混合物接受磁場(chǎng)或通過(guò)過(guò)濾，從混合物的液體組分中分離所述顆粒。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中用包含所述約束劑的溶液洗滌所述分離的顆粒。
67.如權(quán)利要求59-66所述的方法，其中所述解離步驟是以將解離緩沖液加入到所述顆粒中的單獨(dú)步驟進(jìn)行的。
68.如權(quán)利要求59-66所述的方法，其中所述解離目標(biāo)物的步驟是通過(guò)降低所述約束劑的濃度來(lái)遞增進(jìn)行的。
69.如權(quán)利要求45-68所述的方法，其中所述方法在執(zhí)行用于從其他材料中分級(jí)分離所述目標(biāo)物的方法之前或之后進(jìn)行，并且所述用于分級(jí)分離的方法選自:高效液相色譜、親和色譜、蛋白A色譜、蛋白G色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定化金屬親和色譜、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、離心和超速離心。
70.如權(quán)利要求1-28所述的方法，其中所述不溶材料是對(duì)流色譜材料。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述對(duì)流色譜材料選自整料、膜和無(wú)孔的顆粒。
72.如權(quán)利要求7 1所述的方法，其中所述對(duì)流色譜材料包括填充在柱中的無(wú)孔二氧化娃顆粒。
73.如權(quán)利要求71所述的方法，其中所述對(duì)流色譜材料是整料。
74.如權(quán)利要求73所述的方法，其中所述整料由選自聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、苯乙烯二乙烯基苯和二氧化硅中的材料組成。
75.如權(quán)利要求73-74所述的方法，其中所述整料包括約Iμ m至200 μ m的平均通道尺寸。
76.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸為約Iμ m至5 μ m。
77.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸為約ΙΟμπι至20μπι。
78.如權(quán)利要求75所述的方法，其中所述通道的尺寸為約50μ m至200 μ m。
79.如權(quán)利要求73-78所述的方法，其中所述整料涂有聚合物。
80.如權(quán)利要求73-78所述的方法，其中所述整料被化學(xué)修飾以增加其表面的水合能力。
81.如權(quán)利要求70-80所述的方法，其中所述對(duì)流色譜材料表面被羥基化、糖基化或多羥基化。
82.如權(quán)利要求70-81所述的方法，其中如果所述對(duì)流色譜材料的表面包括帶電荷部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、電導(dǎo)率和鹽濃度以阻止目標(biāo)物與所述帶電荷部分之間的直接相互作用。
83.如權(quán)利要求70-81所述的方法，其中如果所述對(duì)流色譜材料表面包括帶電荷部分，則選擇輸送到柱的緩沖液的PH值、電導(dǎo)率和鹽的濃度，以在將所述樣品與約束劑接觸的步驟的至少一部分過(guò)程中阻止所述目標(biāo)物與所述帶電荷部分之間的直接相互作用，使得在所述一部分過(guò)程中所述目標(biāo)物僅通過(guò)約束共水合被保留在水合表面上。
84.如權(quán)利要求70-81所述的方法，其中在約束劑的存在下進(jìn)行將所述樣品與所述對(duì)流色譜材料的水合表面接觸的步驟。
85.如權(quán)利要求70-81所述的方法，其中將所述樣品與所述對(duì)流色譜材料的水合表面接觸的步驟是通過(guò)以下步驟進(jìn)行的:通過(guò)一個(gè)入口線路施加所述樣品，同時(shí)通過(guò)另一條線路施加濃縮的約束劑，在緊鄰所述對(duì)流色譜材料之前放置的混合器中混合兩種液流，使得混合物的柱前滯留時(shí)間短到不足以形成足夠的沉淀而堵塞對(duì)流色譜材料或干擾所述方法。
86.如權(quán)利要求84-85所述的方法，其中在將樣品輸送到對(duì)流色譜材料之前，所述樣品與含有至少一種約束劑的緩沖液混合，并且其中在所述目標(biāo)樣品的這種輸送之前，用約束劑平衡所述對(duì)流色譜材料。
87.如權(quán)利要求84-86所述的方法，其還包括以下步驟:用包含約束劑的溶液洗滌水合的對(duì)流色譜材料，所述約束劑的量足以除去未保留在不溶材料的水合表面上的污染物，并隨后從所述對(duì)流色譜材料解離所述目標(biāo)物。
88.如權(quán)利要求87所述的方法，其中解離所述目標(biāo)物的步驟包括用溶液洗滌所述對(duì)流色譜材料，其中所述溶液:(i)不包含所述約束劑，(ii)包含所述約束劑，所述約束劑的量足以將所述目標(biāo)物保留在所述對(duì)流色譜材料的水合表面，(iii)包含引起所述目標(biāo)物從所述對(duì)流色譜材料的水合表面解離的試劑，(iv)⑴和(iii)的組合,或(iv) (ii)和(iii)的組合。
89.如權(quán)利要求70-88中任一項(xiàng)所述的方法，其中所述方法在執(zhí)行用于從其他材料分級(jí)分離所述目標(biāo)物的方法之前或之后進(jìn)行，并且所述用于分級(jí)分離的方法選自:高效液相色譜、親和色譜、蛋白A色譜、蛋白G色譜、陰離子交換色譜、陽(yáng)離子交換色譜、疏水相互作用色譜、固定化金屬親和色譜·、沉淀法、聚乙二醇沉淀、辛酸沉淀、離心和超速離心。
90.如權(quán)利要求88所述的方法，其中所述在約束劑的存在下引起所述目標(biāo)物從所述對(duì)流色譜材料的水合表面解離的試劑選自表面活性劑、酰脲、糖、鹽、螯合劑或離液劑。
91.如權(quán)利要求1-90所述的方法，其中所述不溶材料具有在第一組條件下可與目標(biāo)物結(jié)合，而在第二組條件下不與目標(biāo)物結(jié)合的化學(xué)或官能部分，并且其中所述方法包括在第二組條件下于約束劑的存在下將目標(biāo)物保留在不溶材料的水合表面上的步驟。
92.如權(quán)利要求91所述的方法，其中所述第一組條件和所述第二組條件的差異僅在于，在第二組條件下存在約束劑。
93.如權(quán)利要求91-92所述的方法，其中在所述第二組條件下將所述目標(biāo)物保留在所述不溶材料的水合表面上的步驟之前，所述方法還包括在第一組條件下洗滌所述樣品的步驟且同時(shí)所述目標(biāo)物結(jié)合到不溶材料上。
94.如權(quán)利要求93所述的方法，其中所述第一組條件和第二組條件的pH值、導(dǎo)電率和鹽濃度中至少一項(xiàng)有差異。
【文檔編號(hào)】C07K16/06GK103717284SQ201280038354
【公開(kāi)日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2012年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2011年6月8日
【發(fā)明者】彼得·斯坦利·加尼翁 申請(qǐng)人:新加坡科技研究局