攜帶pap抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法與應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)及其構(gòu)建方法與其應(yīng)用。該rAAV載體是將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因替換為PAP抗原基因得到。本發(fā)明的rAAV的病毒載體可將其攜帶的PAP抗原基因輸送入單核細(xì)胞?樹突狀細(xì)胞系中，被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)證明，被本發(fā)明的rAAV的病毒載體感染的DC所誘導(dǎo)的CTL在體外或患者體內(nèi)可有效地抑制PAP抗原陽(yáng)性的惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅腫瘤細(xì)胞。本發(fā)明的重組腺相關(guān)病毒載體或其相關(guān)產(chǎn)品可被用于制備治療抗PAP抗原陽(yáng)性的前列腺癌的藥物。
【專利說明】
攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及構(gòu)建方法與應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及生物領(lǐng)域中的載體及其應(yīng)用，特別是涉及一種攜帶前列腺酸性磷酸酶 (prostatic acid phosphatase，PAP)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體及其構(gòu)建方法以及 其在制備抗PAP陽(yáng)性的前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus，AAV)的基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被鑒定。1983年， Samulski等人描述了AAV的末端重復(fù)片段(上游5'端片段，下游3'端片段）（Samulski RJ, Srivastava A,Berns KI,Muzyczka N. Rescue of adeno-associated virus from recombinant plasmids: gene correction within the terminal repeats of AAV. Cell. 33:135-143.)。1984年，Hermonat等人描述了 AAV的低感染顆粒(lip)基因和包膜 (cap)基因 （Hermonat PL,Labow MA,Wright R, Berns KI,Muzyczka N.Genetics of adeno-associated virus: isolation and preliminary characterization of adeno-associated virus type 2mutants.J Virol.51:329-339.Hermonat,P.L.,and Muzyczka, N. Use of adeno-associated virus as a mammalian DNA cloning vector: transduction of neomycin resistance into mammalian tissue culture cells .Proc .Natl .Acad. Sci.U.S.A.81:6466-6470 ·)。1986年，Labow 等人鑒定了位于上游 5'端片段和rep基因之間的p5啟動(dòng)子（Labow MA,Hermonat PL,Berns KI .Positive and negative autoregulation of the adeno-associated virus type 2genome.J Virol.160:251-258.)〇
[0003] 1984年，美國(guó)Paul L.Hermonat證明AAV載體可用于人類疾病的基因治療。目前，主 要是歐美國(guó)家在進(jìn)行以AAV為基礎(chǔ)的基因治療人類疾病的臨床試驗(yàn)。據(jù)美國(guó)糧食和藥品管 理局統(tǒng)計(jì)，現(xiàn)有十余項(xiàng)以AAV為基礎(chǔ)的基因治療臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，主要是將攜帶治療基因 的AAV病毒注入患者體內(nèi)，使其在體內(nèi)表達(dá)治療基因，從而達(dá)到治療疾病的目的。主要針對(duì) 治療的疾病是帕金森氏綜合癥、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、血友病、心力衰竭、進(jìn)行性肌萎縮和奧茲海 默綜合癥等非腫瘤性疾病。2012年11月2日歐盟批準(zhǔn)UniQure公司的Glybera產(chǎn)品在歐盟27 個(gè)成員國(guó)使用，這是西方國(guó)家第一個(gè)獲批準(zhǔn)的基因治療藥物，它是利用腺相關(guān)病毒I型 (AAV-Ι)攜帶外源基因用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病(LPLD)的基因藥物。
[0004] AAV是一種非致病性的缺陷性病毒，需要其它病毒(如腺病毒)的基因產(chǎn)物輔助，才 能裝配成為具有感染性的病毒顆粒。目前AAV可分為12種血清型(AAV-1~AAV-12)。其中，2 型腺相關(guān)病毒載體(AAV-2)因具有無(wú)致病性、宿主范圍廣、目的基因長(zhǎng)期表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)而成為 當(dāng)前基因治療中最有潛力的病毒載體之一。AAV-2基因組全長(zhǎng)約4700堿基對(duì)(bp)，兩端為重 復(fù)末端片段(TR)，中間為病毒的結(jié)構(gòu)基因，包括Rep和Cap基因。由于存在AAV病毒自身的不 穩(wěn)定性及其攜帶外源性基因（治療基因）長(zhǎng)度有限等方面缺陷，因此有必要對(duì)其進(jìn)行基因重 組形成重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)〇
[0005] 如何構(gòu)建可用于制備治療疾病的藥物的重組腺相關(guān)病毒及其相關(guān)產(chǎn)品是本領(lǐng)域 技術(shù)人員努力的方向。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是:彌補(bǔ)上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出一種穩(wěn)定性高、攜 帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒(recombinant adeno-associated virus，rAAV)載體及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)問題通過以下的技術(shù)方案予以解決：
[0008] -種攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體，將腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病 毒的結(jié)構(gòu)基因替換為PAP抗原基因得到的重組腺相關(guān)病毒載體。
[0009] 已知的腺相關(guān)病毒載體具有P5啟動(dòng)子，為提高目的基因的轉(zhuǎn)錄水平，還可進(jìn)一步 將PAP抗原基因插入已經(jīng)成功構(gòu)建的啟動(dòng)子為巨噬細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng) 子(β-actinp)、猴空泡病毒40(SV40)早期啟動(dòng)子(SV40p)中的一種的AAV載體中。
[0010] 本發(fā)明還提供攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法:在腺相關(guān)病 毒載體中，將腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因剔除，在剔除的位置上插入PAP抗原基因，得到重組腺 相關(guān)病毒載體。
[0011] 本發(fā)明所提供的構(gòu)建方法，是使用基因重組的方法，使用限制性內(nèi)切酶先將AAV載 體骨架DNA切斷，再運(yùn)用DNA連接技術(shù)，將特異抗原基因 PAP與被切斷的AAV載體DNA進(jìn)行連 接，得到攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體。該rAAV載體的啟動(dòng)子為p5啟動(dòng)子或者下 述三種啟動(dòng)子中的一種：巨細(xì)胞病毒（cytomegalovirus，CMV)啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng) 子、SV40早期啟動(dòng)子。
[0012] 一種與攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，包括ΡΑΡ重組腺相關(guān) 病毒的質(zhì)粒載體、ΡΑΡ重組腺相關(guān)病毒的病毒載體、被所述ΡΑΡ重組腺相關(guān)病毒的病毒載體 感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，所述ΡΑΡ重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體由上述攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組 腺相關(guān)病毒載體或者上述構(gòu)建方法制得的攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體制得； 所述ΡΑΡ重組腺相關(guān)病毒的病毒載體由所述ΡΑΡ重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng) 得到。
[0013] 一種與攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品的制備方法，ΡΑΡ重組 腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體的制備:將如上述攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或者上 述構(gòu)建方法制得的攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體導(dǎo)入基因工程大腸桿菌DH5a感 受態(tài)細(xì)胞，用含l〇〇yg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落，提取質(zhì)粒并 純化，得到PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體;PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體的制備：以所述 PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體和pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAVp細(xì)胞得到PAP重組腺相關(guān)病毒的 病毒載體;PAP重組腺相關(guān)病毒感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的制備：用所述PAP重組腺相關(guān)病毒的 病毒載體感染或轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞得到，所述細(xì)胞系包括單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞 系(所述AAV/PAP中的相關(guān)基因一 PAP抗原基因可在單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 子的作用下獲得表達(dá)）。
[0014] -種如上所述的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或者如上所述的相關(guān)產(chǎn) 品在制備抗PAP抗原陽(yáng)性的前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
[0015] 藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑的選擇是多種多樣的，如細(xì)胞培養(yǎng)液 (基）、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時(shí)候，在上述藥物中還可以加入一種或多種 藥學(xué)上可接受的載體。所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑等。
[0016] 用藥方式可為先分離出腫瘤患者體內(nèi)的單核細(xì)胞，再將AAV/PAP的病毒載體感染 或轉(zhuǎn)染患者的單核細(xì)胞?；?qū)⑥D(zhuǎn)化有PAP的成熟的樹突狀細(xì)胞所刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞回輸腫瘤患者。
[0017] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)對(duì)比的有益效果是：
[0018] 本發(fā)明提供了一種穩(wěn)定性高、攜帶外源性基因（PAP)的重組腺相關(guān)病毒(rAAV)載 體(可簡(jiǎn)稱為AAV/PAP)。AAV/PAP是在發(fā)明人已經(jīng)成功構(gòu)建的AAV載體的骨架中插入PAP抗原 基因。PAP抗原基因?yàn)橐环N前列腺癌抗原基因，AAV載體骨架有4種，其區(qū)別在于分別攜帶4種 不同的啟動(dòng)子基因，分別為P5啟動(dòng)子、巨噬細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子(CMVp)、人beta肌動(dòng)蛋白 啟動(dòng)子(β-actinp)或猴空泡病毒40(SV40)早期啟動(dòng)子(SV40p)。在本發(fā)明的重組腺相關(guān)病 毒(AAV/PAP)載體可將其攜帶的PAP抗原基因輸送入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系中，存在PAP抗 原基因的細(xì)胞被用于刺激免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞(不局限于T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞）。實(shí)驗(yàn)證 明，被本發(fā)明的rAAV感染的樹突狀細(xì)胞和所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在體外和患者體內(nèi) 可有效地抑制相關(guān)惡性腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅腫瘤細(xì)胞，因而，本發(fā)明的攜帶PAP抗原基 因的重組腺相關(guān)病毒載體或與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備抗PAP 抗原陽(yáng)性的惡性腫瘤的細(xì)胞免疫治療。本發(fā)明在惡性腫瘤的臨床治療和應(yīng)用中具有重要的 理論和實(shí)際意義，應(yīng)用前景廣闊。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(AAV/PAP) 的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0020] 圖2為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的構(gòu)建攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(AAV/ PAP)以及制備具有感染性的AAV/PAP流程圖。
[0021] 圖3A為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的PAP CDNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果圖。
[0022]圖3B為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的PAP基因克隆及重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的雙 酶切鑒定結(jié)果圖。
[0023]圖4為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的所獲得的PAP基因序列與美國(guó)NCBI Gene Bank公布 的基因序列比較圖。
[0024] 圖5為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體的病毒滴 度檢測(cè)結(jié)果圖。
[0025] 圖6為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP感染腫瘤患者單核細(xì) 胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)流程圖。
[0026] 圖7a_7d為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的分別含不同的啟動(dòng)子的重組腺相關(guān)病毒載體 AAV/PAP的病毒載體感染DC的效率檢測(cè)結(jié)果圖。
[0027]圖8a_8c為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染 的DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86水平的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0028]圖9為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的DC 所誘導(dǎo)的CTL的IFN- γ水平與對(duì)照組對(duì)比的檢測(cè)結(jié)果圖。
[0029] 圖10為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的DC 所誘導(dǎo)的CTL體外殺傷PAP陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的51Cr (絡(luò)-51)實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖。
[0030] 圖11為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的在重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的 DC所誘導(dǎo)的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特異性抗原(PSA)水平的變化情 況圖。
[0031 ]圖12為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】的在重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體感染的 DC所誘導(dǎo)的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清PAP水平的變化情況圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】并對(duì)照附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0033] 發(fā)明人已經(jīng)成功地將攜帶AAV 2型全基因組DNA的pBR322質(zhì)粒（pBR-AAV2)中的 AAV-2的包括rep和cap基因在內(nèi)的全部結(jié)構(gòu)基因刪除，僅保留末端重復(fù)片段，或保留末端重 復(fù)片段和P5啟動(dòng)子，并插入寡核苷酸片斷，以提高重組腺相關(guān)病毒(rAAV)DNA復(fù)制的效率和 重組腺相關(guān)病毒的穩(wěn)定性，由此獲得AAV-2載體的基本骨架，所應(yīng)用的AAV-2載體具有p5啟 動(dòng)子，將PAP抗原基因插入其中。此外，也成功地用巨細(xì)胞病毒(CMV)啟動(dòng)子、猴空泡病毒40 (SV40)早期啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子取代AAV-2載體中原有的p5啟動(dòng)子。也即本發(fā)明實(shí)施 方式中的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(AAV/PAP)的啟動(dòng)子可以為p5啟動(dòng)子或 CMV啟動(dòng)子或β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子。此外，在此基礎(chǔ)上成功地制備具有感染 性的rAAV病毒顆粒(參見中國(guó)專利ZL201110125683.X)，為研制新的rAAV產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。
[0034] 前列腺酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase,PAP)系酸性磷酸酶同工酶，由 兩個(gè)相同亞單位組成，其分子量為100kD，由成熟的前列腺上皮細(xì)胞溶酶體產(chǎn)生。PAP是一種 前列腺外分泌物中的糖蛋白，其在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無(wú)機(jī)磷酸的水解酶。 由于PAP特異性地在前列腺細(xì)胞表達(dá)，并在前列腺癌細(xì)胞高表達(dá)，并具有較強(qiáng)的免疫原性， 而前列腺為非維持人體生命的必需器官，故大量的實(shí)驗(yàn)和臨床研究證明PAP為免疫治療的 理想的革G抗原。2010年美國(guó)糧食和藥品管理局（FDA)正式批準(zhǔn)將美國(guó)Dendreon公司的 Provenge用來(lái)治療激素?zé)o效的無(wú)癥狀或癥狀輕微的轉(zhuǎn)移性前列腺癌，成為首個(gè)被美國(guó)FDA 批準(zhǔn)上市的新型治療性腫瘤疫苗。Provenge是一種自體源性樹突細(xì)胞疫苗，在該疫苗中，其 藥物成份為一種融合蛋白，即將前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原蛋白融合于免疫刺激細(xì)胞因 子粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)。將該融合蛋白刺激的患者樹突狀細(xì)胞輸回患 者體內(nèi)，發(fā)動(dòng)細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而使T細(xì)胞能辨識(shí)并殺滅PAP抗原陽(yáng)性的癌細(xì)胞。臨床試驗(yàn)表 明Provenge可降低患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)，平均延長(zhǎng)生存期4.1個(gè)月。雖然隨后的臨床試驗(yàn)證明 Provenge的療效并不理想，但該P(yáng)AP抗原已經(jīng)被公認(rèn)為細(xì)胞免疫治療的一個(gè)理想的祀抗原， 在抗腫瘤的細(xì)胞免疫治療中發(fā)揮重要的作用。
[0035]本發(fā)明的AAV/PAP載體是在發(fā)明人已經(jīng)成功構(gòu)建的腺相關(guān)病毒載體的骨架中插入 PAP抗原基因得到重組腺相關(guān)病毒載體，與載體相關(guān)的產(chǎn)品包括質(zhì)粒載體、病毒載體和細(xì)胞 系。
[0036]下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說明均為常規(guī)方法，具體步驟可參見： 《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》（Sambrook，J·，Russel1，David ff., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd edit ion，2001，NY，Cold Spring Harbor)〇
[0037] 所用引物、DNA序列合成及DNA序列測(cè)定均由美國(guó)Life Technologies公司完成。
[0038] 實(shí)施例1、攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(AAV/PAP)的構(gòu)建及鑒定
[0039] 一、材料及其來(lái)源：
[0040] 1.四種具有不同啟動(dòng)子的AAV 2型(AAV-2)pBR322質(zhì)粒(pBR-AAV2):由發(fā)明人構(gòu)建 成功（參見中國(guó)專利21^201110125683.乂，0056~0059段口81?-44￥2質(zhì)粒的改建、？0財(cái)廣增啟動(dòng) 子、將擴(kuò)增的啟動(dòng)子插入改建的PBR-AAV2質(zhì)粒中等內(nèi)容）。四種啟動(dòng)子分別為AAV p5啟動(dòng)子 (AAV p5)、巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMVp)、SV40早期啟動(dòng)子（SV40p)和人β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 (β-actinp)。該質(zhì)粒的特點(diǎn)為兩端完整的重復(fù)末端片段(TR)序列，并在兩端TR的第75位核 苷酸序列處均插入9個(gè)核苷酸CTGCGCTGG組成的片段，目的是提高重組AAV病毒(rAAV)的穩(wěn) 定性以及提高病毒的復(fù)制效率，并且已剔除了AAV-2的包括復(fù)制蛋白基因（rep)和包膜蛋白 基因（cap)在內(nèi)的全部結(jié)構(gòu)基因。
[0041 ] 2.人前列腺癌組織:來(lái)源于手術(shù)切除的癌組織，免疫組化證實(shí)PAP抗原陽(yáng)性。
[0042] 3.基因擴(kuò)增核苷酸引物：根據(jù)美國(guó)基因庫(kù)中公開發(fā)表的人前列腺酸性磷酸酶 (PAP)基因序列設(shè)計(jì)(GenBank: ΝΜ_001099 · 4)。
[0043] 二、構(gòu)建本實(shí)施例攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體(如圖1和2所示）
[0044] 構(gòu)建時(shí):包括以下步驟：：1)改建AAV 2型pBR322質(zhì)粒:使用限制性內(nèi)切酶Bst98 I 和Hpa I將AAV 2型pBR322質(zhì)粒中的AAV 2型腺相關(guān)病毒中的結(jié)構(gòu)基因切除，然后將含有限 制性內(nèi)切酶EcoR I和EcoR V酶切位點(diǎn)的核苷酸序列CGAATTCATGCGATATCGTT插入質(zhì)粒中，保 留兩端的TR序列或者在兩端的TR序列的第75位核苷酸序列處均插入由9個(gè)核苷酸組成的片 段CTGCGCTGG;2)將啟動(dòng)子插入步驟1)得到的改建的AAV 2型pBR322質(zhì)粒中，構(gòu)建攜帶有啟 動(dòng)子的AAV 2型pBR322質(zhì)粒;所述啟動(dòng)子為p5啟動(dòng)子或者下述三種啟動(dòng)子中的一種：巨噬細(xì) 胞病毒啟動(dòng)子、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子。3)獲取PAP cDNA; 4)將已構(gòu)建的攜帶 有啟動(dòng)子的AAV 2型pBR322質(zhì)粒和步驟1)得到的PAP cDNA進(jìn)行限制性內(nèi)切酶反應(yīng)，然后進(jìn) 行DNA連接反應(yīng)，得到攜帶有啟動(dòng)子和PAP cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體（可命名為AAV/ PAP)〇
[0045]具體過程包括以下步驟：
[0046] 1.獲取cDNA，具體方法為:采用Trizol試劑(美國(guó)Life Technology公司生產(chǎn))獲取 前列腺癌組織的總mRNA。首先將PAP抗原陽(yáng)性的前列腺癌組織反復(fù)碾磨后，加入5m 1 Trizol，按照其說明書進(jìn)行操作。離心獲取上清液后，以75%(V/V)乙醇洗滌二次，再加入無(wú) 水乙醇，離心沉淀。沉淀物以去離子水溶解，得到總mRNA溶液，將濃度調(diào)至1 Ong/μL。以10μ1 總mRNA溶液為模板，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(RT)，合成總cDNA。以25μ1為例的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包 括:0.5yg oligo(dT)15(美國(guó)Promega公司）、0.5mM dNTPs(美國(guó)Promega公司）以及200U Μ-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Promega公司）。反應(yīng)條件為37°C，1小時(shí)，得到總cDNA。
[0047] 2.獲取PAP cDNA，具體方法為：總cDNA在引物1(如SEQ ID NO: 1): CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2 (SEQ ID NO: 2): CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引導(dǎo)下PCR擴(kuò) 增，得到PAP cDNA。PCR擴(kuò)增條件為:先94°C4分鐘;再94°C30秒，60°C35秒，72°C90秒，共30個(gè) 循環(huán)；最后72°C5分鐘，反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在 1182bp處出現(xiàn)一條預(yù)期的特異性cDNA條帶。如圖3A所示，其中，1、2是PAP cDNA，3是DNA分子 量標(biāo)準(zhǔn)。
[0048] 3.構(gòu)建攜帶PAP cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體:分別對(duì)攜帶4種不同啟動(dòng)子的pAAV-2質(zhì)粒和PAP cDNA分別用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切后，進(jìn)行DNA連接反應(yīng)。所用限制性內(nèi)切酶 均購(gòu)自美國(guó)Promega公司。酶切反應(yīng)體系為：lyg pAAV質(zhì)?；騊AP cDNA; 10U限制性內(nèi)切酶 Xba I和Xho I(購(gòu)自美國(guó)Promega公司），2·5μ1 10X緩沖液C以及19·5μ1去離子水;反應(yīng)條 件為：在37°C下水浴4小時(shí)。連接反應(yīng)體系為：500ng酶切后的質(zhì)粒，300ng酶切后的ΡΑΡ cDNA，10IU T4DNA連接酶(購(gòu)自美國(guó)Promega公司），1.5μ1 10 XT4DNA連接緩沖液以及11.5μ1 去離子水;反應(yīng)條件為:在4°C下8小時(shí)。分別得到攜帶有AAV的ρ5啟動(dòng)子和PAP cDNA的重組 腺相關(guān)病毒載體、攜帶有CMV啟動(dòng)子和PAP cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體、攜帶有SV40早期啟 動(dòng)子和PAP cDNA的重組腺相關(guān)病毒載體、以及攜帶有β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子和PAP cDNA的重組 腺相關(guān)病毒載體。
[0049] 4.將連接后的AAV/PAP分別導(dǎo)入基因工程大腸桿菌(E.coli)DH5a感受態(tài)細(xì)胞(美 國(guó)Invitrogen公司），用含100yg/mL氨節(jié)青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落， 提取質(zhì)粒并純化，得到大量的AAV/PAP的質(zhì)粒載體。
[0050]三、重組腺相關(guān)病毒質(zhì)粒的鑒定
[0051 ] 1.限制性內(nèi)切酶酶切分析:將AAV/PAP質(zhì)粒載體以限制性內(nèi)切酶Xba I和Xho I進(jìn) 行酶切反應(yīng)，反應(yīng)體系、條件以及操作過程同實(shí)施例1中的二.3。分析結(jié)果見圖3B所示，其 中，1、2是兩個(gè)陽(yáng)性克隆;3是DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，證明構(gòu)建AAV/PAP質(zhì)粒載體成功。
[0052] 2. DNA序列測(cè)定:將AAV/PAP進(jìn)行DNA序列測(cè)定。其測(cè)序結(jié)果的核苷酸序列如圖4所 示，與基因庫(kù)相應(yīng)的PAP基因?qū)Ρ龋?9 %同源，進(jìn)一步證明構(gòu)建AAV/PAP質(zhì)粒成功。
[0053]實(shí)施例2、重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)的制備及滴度測(cè)定 [0054]材料及其來(lái)源：
[0055] A.實(shí)施例1構(gòu)建的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP。
[0056] B.含AAV的Rep基因和Lip/Cap基因的輔助質(zhì)粒pHelper:由美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院 附屬醫(yī)院基因治療中心劉勇教授構(gòu)建(Liu，Y.，Chiriva_Internati，M.，Grizzi，F(xiàn). Salati， E.,Roman,J.J.,Lim S.,and Hermonat,P.L.Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0057] C.含有整合于細(xì)胞染色體并表達(dá)的腺病毒基因化142八44、￥八1和￥八11基因）的 AAVp細(xì)胞株：由美國(guó)阿肯色大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基因治療中心建立（1^11，￥.，(：11化"&-Internati，M.，Grizzi，F(xiàn).Salati，E.，Roman，J·J·，Lim S·，and Hermonat,P.L. Rapid induction of cytotoxic T cell response against cervical cancer cells by human papillomavirus type 16E6antigen gene delivery into human dendritic cells by an adeno-associated virus vector.Cancer Gene Therapy 8:948-957.)〇
[0058] D.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipof ectin:購(gòu)自美國(guó)Invotrogen公司。
[0059] E.DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(或小牛血清）：購(gòu)自美國(guó)Cellgro公司。
[0060] F. PCR DIG標(biāo)記試劑盒和DIG雜交檢測(cè)試劑盒:購(gòu)自瑞士Roche公司。
[0061 ] G.DNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：分別為1012拷貝數(shù)（copies)Ail至109(copies)Ail，購(gòu)自美國(guó) Promage公司。
[0062] -、重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)的制備
[0063] 參照?qǐng)D2,用下述方法制備重組腺相關(guān)病毒(rAAV)，以制備一盤10.0cm細(xì)胞培養(yǎng)皿 的病毒為例，當(dāng)AAV-HEK293細(xì)胞在二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)至約占培養(yǎng)皿面積70%時(shí)， 進(jìn)行如下操作：
[0064] A.按照Lipofectin的使用說明進(jìn)行操作：將1 .Oyg AAV/PAP的質(zhì)粒載體，1. Oyg pHelper質(zhì)粒，4.ΟμL Lipofectin和50.ΟμL含5% (V/V)胎牛血清(或小牛血清）的DMEM培養(yǎng) 基混勻，室溫靜置20分鐘。
[0065] Β.將混合液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，繼續(xù)置于二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0066] C. 72小時(shí)后，收獲培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞和培養(yǎng)液。
[0067] D.劇烈振蕩1分鐘后，離心，保留上清，即rAAV病毒液。
[0068] E.將收集的rAAV病毒液過濾除菌，獲得的攜帶前列腺酸性磷酸酶基因 （PAP cDNA) 的AAV病毒命名為AAV/PAP的病毒載體。
[0069] 二、重組腺相關(guān)病毒載體(rAAV)的病毒滴度測(cè)定
[0070] 采用常規(guī)的斑點(diǎn)雜交法，對(duì)步驟一獲得的AAV/PAP的病毒載體進(jìn)行病毒滴度測(cè)定， 具體方法包括以下步驟:僅所用的DNA探針為針對(duì)PAP基因的特異性探針。
[0071] A.采用常規(guī)的DNA苯酚/氯仿提取法，提取rAAV病毒顆粒DNA。
[0072] B.將尼龍膜置于斑點(diǎn)印跡儀中，加入經(jīng)堿變性的rAAV病毒顆粒DNA，并加入DNA拷 貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，抽真空。
[0073] C.取出尼龍膜干燥后，紫外線固定。
[0074] D.用PCR DIG標(biāo)記試劑盒并參照試劑盒說明書制備DIG標(biāo)記的特異性探針，探針為 "實(shí)施例1中所獲得的PAP cDNA" 1CR擴(kuò)增結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.2% (V/V)瓊脂糖凝 膠電泳，在紫外線下檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，結(jié)果出現(xiàn)陽(yáng)性條帶，表明探針標(biāo)記成功。
[0075] E.用DIG雜交檢測(cè)試劑盒并參照試劑盒說明書，在雜交爐中對(duì)各種rAAV病毒顆粒 DNA進(jìn)行DNA雜交。AAV/PAP的病毒載體的病毒滴度檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，其中：1為標(biāo)準(zhǔn)品。2-4為3批AAV/PAP。每批AAV/PAP的滴度約在1012copies/ml;AAV/PAP的病毒載體的病毒滴度 為 1012拷貝（copies)/ml。
[0076]實(shí)施例3、AAV/PAP的病毒載體導(dǎo)入單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞系的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn) [0077]材料及其來(lái)源：
[0078] A.rAAV病毒:AAV/PAP的病毒載體。
[0079] B.AIM-V細(xì)胞培養(yǎng)基:購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。
[0080] c.細(xì)胞因子:集落細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)，白細(xì)胞介素2,4(IL-2，IL-4)以及腫瘤 壞死因子(TNF-α)購(gòu)自美國(guó)R&D公司。
[0081 ] D. PAP陽(yáng)性的原代腫瘤細(xì)胞:為從患者的腫瘤組織中分離的前列腺癌細(xì)胞。
[0082] E.PAP陽(yáng)性細(xì)胞:為從患者的正常前列腺組織分離的前列腺細(xì)胞。
[0083] F.PAP陰性原代細(xì)胞:肺、乳腺、肝和腎臟的上皮細(xì)胞分別從正常組織中分離獲得。
[0084] G.分別針對(duì)人MHC I類抗原的多克隆抗體和人前列腺酸性磷酸酶的單克隆抗體： 購(gòu)自美國(guó)BD公司。
[0085] 一、殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)
[0086]如圖6所示，將本發(fā)明的攜帶PAP抗原基因的rAAV的病毒載體感染腫瘤患者單核細(xì) 胞為基礎(chǔ)的殺滅腫瘤實(shí)驗(yàn)的過程包括以下步驟：
[0087] A.取腫瘤患者50-150毫升外周血，用血細(xì)胞分離儀(或淋巴細(xì)胞分離液)按常規(guī)方 法獲取外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，與AM-V培養(yǎng)基混勻后，加入細(xì)胞培養(yǎng)瓶，置于恒溫二氧 化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2小時(shí)。
[0088] B.分離細(xì)胞，除去懸浮細(xì)胞，保留貼壁細(xì)胞（即單核細(xì)胞）。懸浮細(xì)胞即外周血淋巴 細(xì)胞，將其與AIM-V培養(yǎng)基混勻后，繼續(xù)培養(yǎng)備用。
[0089] C.在單核細(xì)胞中加入一種(或多種，效果更佳)本發(fā)明實(shí)施例2獲得的rAAV病毒，加 入量為1〇〇~1000M0I(本例匯中為100M0I)，同時(shí)再加入GM-CSF(800IU/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4小 時(shí)。
[0090] D.除去步驟C的舊培養(yǎng)基，補(bǔ)充含GM-CSF，IL-4(800IU/ml)以及TNF-a(20IU/ml)的 AIM-V培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0091] E.培養(yǎng)6天后，收獲成熟的樹突狀細(xì)胞(DC)，并與所培養(yǎng)的外周血淋巴細(xì)胞混合， 在A頂-V培養(yǎng)基中加入IL-2(20IU/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0092] F.培養(yǎng)至6-12天后，收獲激活的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)進(jìn)行檢測(cè)。
[0093] 二、樹突狀細(xì)胞(DC)和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)的檢測(cè)
[0094] A. rAAV病毒感染外周血單個(gè)核細(xì)胞的效率檢測(cè)
[0095] 采用常規(guī)的熒光抗體標(biāo)記染色法，用針對(duì)前列腺酸性磷酸酶(PAP)的特異性熒光 抗體(購(gòu)自美國(guó)BD公司）標(biāo)記步驟一獲得的被本發(fā)明的rAAV病毒感染的單核細(xì)胞或未成熟 的DC，再進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。其中，rAAV病毒感染外周血單核細(xì)胞的效率 檢測(cè)結(jié)果如圖7&-7(1所示，分別攜帶不同啟動(dòng)子，即AAV p5、CMVp、SV40p或β-actinp的AAV/ PAP的病毒載體感染單核細(xì)胞或DC的效率分別為87.2%、90.5%、91.8%和90.6%，即約 90 %的DC可表達(dá)PAP抗原，證明約90 %左右的DC可被PAP抗原刺激，DC的抗原攝取、加工和提 呈率較高。
[0096] B.樹突狀細(xì)胞(DC)表達(dá)的⑶分子水平的檢測(cè)
[0097] DC表達(dá)⑶80、⑶83以及⑶86的水平與DC的功能呈正相關(guān)。用與步驟A相同的檢測(cè)方 法，即分別采用熒光標(biāo)記的針對(duì)這三種CD分子的抗體(購(gòu)自美國(guó)BD公司）對(duì)步驟一獲得的被 本發(fā)明AAV/PAP的病毒載體感染的DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86的水平進(jìn)行常規(guī)的流式細(xì)胞 技術(shù)檢測(cè)。AAV/PAP的病毒載體感染的DC表達(dá)CD80、CD83以及CD86水平的檢測(cè)結(jié)果分別如圖 8 &-8〇所示，被44￥"^?感染的0(：所表達(dá)的^分子水平較高（平均表達(dá)率分別為42.07%、 82.54%和74.21 % )，有利于刺激細(xì)胞免疫反應(yīng)。證明構(gòu)建和制備的PAP抗原基因的rAAV病 毒感染DC后，所誘導(dǎo)的DC的功能強(qiáng)大。
[0098] C.細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表達(dá)的γ干擾素（IFN-γ )水平的檢測(cè) [0099] CTL的功能及其殺傷腫瘤細(xì)胞的能力與IFN-γ的表達(dá)水平呈正相關(guān)。用與步驟Α類 似的方法檢測(cè)被本發(fā)明rAAV病毒感染的DC所誘導(dǎo)的CTL表達(dá)IFN-γ的水平（以無(wú)刺激的DC 所誘導(dǎo)的CTL為對(duì)照）AC與外周血淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)束后，收獲細(xì)胞，采用傳統(tǒng)的胞內(nèi)染 色法進(jìn)行細(xì)胞熒光染色標(biāo)記，所用抗體為針對(duì)IFN-γ的熒光標(biāo)記抗體(購(gòu)自美國(guó)BD公司）， 最后利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果。其中，以攜帶CMV啟動(dòng)子(CMVp)的重組腺相關(guān)病毒AAV/PAP 的病毒載體為例，檢測(cè)其感染的DC所刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)表達(dá)的伽瑪干擾 素（IFN-γ)水平，如圖9所示，其中，左圖為對(duì)照組，右圖為實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果顯示，其CTL表達(dá) IFN- γ的水平(平均表達(dá)率為39.0% )明顯高于對(duì)照，提示細(xì)胞免疫反應(yīng)較強(qiáng)，CTL的殺傷活 性高。證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導(dǎo)的CTL功能強(qiáng)大。 [0100]三、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)殺傷腫瘤細(xì)胞試驗(yàn)
[0101]被AAV/PAP的病毒載體感染的DC與淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)結(jié)束后，將被AAV/PAP的病毒 載體感染的DC所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic T lymphocytes，CTL)按20:1(淋巴 細(xì)胞:腫瘤細(xì)胞)與PAP陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞混合后，采用傳統(tǒng)的51Cr(鉻-51)殺傷試驗(yàn)，檢測(cè)CTL 殺傷腫瘤細(xì)胞的活性、MHC class I限制性和殺傷特異性。如圖10所示，以攜帶CMV啟動(dòng)子 (CMVp)的重組腺相關(guān)病毒載體AAV/PAP的病毒載體為例，其感染的DC所誘導(dǎo)的CTL體外殺傷 PAP陽(yáng)性和陰性細(xì)胞的51Cr (鉻-51)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。被本發(fā)明的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘 導(dǎo)的CTL能夠有效地裂解(殺傷)PAP陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，前列腺癌細(xì)胞的平 均殺傷率近60%，而對(duì)PAP陽(yáng)性的前列腺細(xì)胞的平均殺傷率近35%，明顯低于前列腺癌的殺 傷率，可能與正常的前列腺細(xì)胞的PAP低水平表達(dá)有關(guān)。
[0102] 以PAP抗原陰性的肺、乳腺細(xì)胞、肝和腎臟的上皮細(xì)胞為對(duì)照，再用上述相同的方 法檢測(cè)上述被AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導(dǎo)的CTL殺傷細(xì)胞的特異性。被本發(fā)明構(gòu)建 和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導(dǎo)的CTL對(duì)上述PAP抗原陰性的細(xì)胞無(wú)殺傷作 用，如圖10所示，證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的AAV/PAP的病毒載體感染的DC所誘導(dǎo)的CTL具 有抗原特異性，即對(duì)抗原陰性的細(xì)胞無(wú)殺傷作用。
[0103] 對(duì)于上述PAP陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，分別先用MHC I類抗體(購(gòu)自美 國(guó)R&D公司)或前列腺酸性磷酸酶的單克隆抗體進(jìn)行預(yù)處理后，再采用傳統(tǒng)的51Cr(鉻-51)殺 傷試驗(yàn)，以檢測(cè)CTL的殺傷活性。檢測(cè)結(jié)果表明對(duì)PAP陽(yáng)性細(xì)胞的殺傷效果明顯下降。該結(jié)果 證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備的AAV/PAP感染的DC所誘導(dǎo)的CTL具有MHC Class I限制性和PAP 抗原特異性。
[0104] 圖10中的檢測(cè)結(jié)果表明CTL殺傷(裂解)PAP陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞以及前列腺細(xì)胞 的效率分別為約60%和35%，但對(duì)PAP抗原陰性的肺、乳腺、肝和腎細(xì)胞無(wú)殺傷作用。而且預(yù) 先分別經(jīng)PAP抗體以及MHC I抗體封閉后，CTL對(duì)PAP陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞以及前列腺細(xì)胞殺 傷作用明顯下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示該殺傷作用具有PAP抗原特異性和MHC I抗原限制性，具有 CTL殺傷作用的特征。綜合上述檢測(cè)結(jié)果，證明被本發(fā)明構(gòu)建和制備攜帶前列腺酸性磷酸酶 (PAP)抗原基因的rAAV病毒感染的DC所誘導(dǎo)的CTL對(duì)PAP陽(yáng)性細(xì)胞具有較好的殺傷效果，有 可能用于臨床抗前列腺癌的靶向性細(xì)胞免疫治療。
[0105] 實(shí)施例4、以PAP為靶點(diǎn)的抗前列腺癌的靶向性細(xì)胞免疫治療初步臨床試驗(yàn)
[0106] 本實(shí)施例提供一種攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或者其相關(guān)產(chǎn)品在制 備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，尤其是在抗PAP陽(yáng)性的惡性腫瘤藥物中的應(yīng)用，其中PAP陽(yáng)性的惡 性腫瘤包括但不限于前列腺癌等。
[0107]抗腫瘤藥物的活性成分為上述攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或與攜帶 PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品。藥物可采用溶劑或粉劑等劑型。所述溶劑 的選擇是多種多樣的，如細(xì)胞培養(yǎng)液(基）、生理鹽水或磷酸鹽緩沖液等均可。需要的時(shí)候， 在上述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述載體可包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī) 的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑等。
[0108] 如以本發(fā)明的PAP重組腺相關(guān)病毒為載體，將PAP基因?qū)雴魏思?xì)胞-樹突狀細(xì)胞 系，并誘導(dǎo)產(chǎn)生樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DC)，以達(dá)到患者體外和體內(nèi)免疫刺激細(xì)胞 免疫反應(yīng)的目的，用以殺滅PAP抗原陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞，或以該DC刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴 細(xì)胞(Cytotoxic T Lymphocytes，CTL)，以CTL直接殺滅PAP陽(yáng)性的腫瘤細(xì)胞。也即用藥方式 可為先分離出腫瘤患者體內(nèi)的單核細(xì)胞，再將AAV/PAP的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染患者的單核 細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞(DC)，再將轉(zhuǎn)化有PAP抗原基因的DC或其刺激產(chǎn)生的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 (CTL)回輸腫瘤患者。為提高療效，上述藥物還可以與抗生素、免疫刺激劑和腫瘤靶向藥物 等進(jìn)行組合治療。
[0109] 上述藥物的用量一般AAV/PAP: 100M0I/單核細(xì)胞/次，可根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整。
[0110] 本實(shí)施例還提供一種體外殺滅PAP陽(yáng)性的腫瘤的方法，包括以下步驟：
[0111] 1)將腫瘤所在體系（該體系可通過人工模擬的方式產(chǎn)生或腫瘤患者體內(nèi)）中自然 產(chǎn)生的單核細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞(DC)被AAV/PAP的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染，或被與AAV/PAP載體 相關(guān)的產(chǎn)品處理，各自得到處理后的細(xì)胞；
[0112] 2)將步驟1)中處理后的單核細(xì)胞-DC加入腫瘤所在體系中殺滅腫瘤;或?qū)⑽幢惶?理的T淋巴細(xì)胞與所述處理后的單核細(xì)胞-DC混合培養(yǎng)形成抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞 ( CTL)，再將該抗原特異性CTL加入腫瘤所在體系中殺滅PAP陽(yáng)性的腫瘤;或?qū)⒈惶幚淼腃TL 和未被處理的單核細(xì)胞-DC加入腫瘤所在體系中殺滅PAP陽(yáng)性的腫瘤。
[0113]也即，給予一個(gè)腫瘤患者回輸PAP抗原特異性CTL，該細(xì)胞由來(lái)源于患者的自然產(chǎn) 生的T淋巴細(xì)胞與來(lái)源于該患者的單核細(xì)胞-DC混合培養(yǎng)產(chǎn)生的。在混合培養(yǎng)之前，這些在 單核細(xì)胞-DC已經(jīng)被本發(fā)明攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒的病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染， 或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處理;或者，給予一個(gè)腫瘤患者回輸來(lái)源于 患者的單核細(xì)胞-DC。在回輸之前，這些在單核細(xì)胞-DC已經(jīng)被本發(fā)明攜帶PAP抗原基因的重 組腺相關(guān)病毒的病毒載體感染或者轉(zhuǎn)染，或被與本發(fā)明重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品處 理。
[0114] 本例中具體為:將實(shí)施例3中被AAV/PAP的病毒載體感染從腫瘤患者分離的樹突狀 細(xì)胞(DC)所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)回輸6例內(nèi)分泌治療失敗并復(fù)發(fā)，血清PSA和 PAP升高的前列腺癌癥患者，以患者的血清PSA和PAP的變化為標(biāo)準(zhǔn)判斷療效。
[0115] 輸注細(xì)胞數(shù)為1 X 108-5 X 108個(gè)CTL細(xì)胞(本例中，輸注量為100μ1/5Χ 106個(gè)單核細(xì) 胞/每次）。治療療程:通常為6個(gè)月，每月2次，如圖11和12所示，分別為重組腺相關(guān)病毒AAV/ ΡΑΡ病毒感染的DC所誘導(dǎo)的CTL治療過程中6例前列腺癌患者的血清前列腺特異性抗原 (PSA)和PAP水平的變化情況，結(jié)果顯示經(jīng)過6個(gè)月的治療，被本發(fā)明的rAAV的病毒載體感染 的DC所誘導(dǎo)的CTL在大部分受試患者體內(nèi)能夠發(fā)揮一定的療效，可降低血清PSA和PAP的水 平，甚至恢復(fù)正常以及改善癥狀。經(jīng)治療，患者的血清PSA和PAP的變化呈一致性，其中4例的 血清PSA和PAP水平明顯降低，甚至恢復(fù)正常，1例變化不明顯，1例出現(xiàn)上升。所有患者在治 療過程中無(wú)明顯的毒副作用發(fā)生。該試驗(yàn)結(jié)果提示通過該種技術(shù)制備的CTL不僅具有一定 的療效而且安全性較高，未來(lái)可用于臨床抗前列腺癌的靶向性細(xì)胞免疫治療。
[0116] 工業(yè)應(yīng)用性
[0117] 實(shí)驗(yàn)證明，被本發(fā)明攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒 (AAV/PAP)的病毒載體感染的樹突狀細(xì)胞(DC)和所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)可有效 地抑制PAP陽(yáng)性的前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)或者殺滅該種腫瘤細(xì)胞。因而，本發(fā)明的PAP重組腺 相關(guān)病毒載體(AAV/PAP)或與本發(fā)明PAP重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品可被用于制備抗 腫瘤藥物進(jìn)行規(guī)?；蜆?biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，在前列腺癌的臨床治療應(yīng)用中具有重要的意義。
[0118]以上內(nèi)容是結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定 本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說，在 不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下做出若干替代或明顯變型，而且性能或用途相同，都應(yīng)當(dāng)視為 屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種攜帶前列腺酸性磷酸酶(PAP)抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于:將 腺相關(guān)病毒載體中的腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因替換為PAP抗原基因得到的重組腺相關(guān)病毒載 體。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組腺相關(guān)病毒載體，其特征在于:所述重組腺相關(guān)病毒載體 中的啟動(dòng)子為AAV p5啟動(dòng)子、巨噬細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子或SV40早期啟動(dòng)子 中的一種。3. -種攜帶ΡΑΡ抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建方法，其特征在于:在腺相關(guān)病 毒載體中，將腺相關(guān)病毒的結(jié)構(gòu)基因剔除，在剔除的位置上插入ΡΑΡ抗原基因，得到重組腺 相關(guān)病毒載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于:還包括以下步驟:將所述腺相關(guān)病毒 的ρ5啟動(dòng)子替換為下述三種啟動(dòng)子中的一種：巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子、β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、 SV40早期啟動(dòng)子。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的構(gòu)建方法，其特征在于:包括以下步驟： 1) 獲取PAP cDNA; 2) 將已構(gòu)建的攜帶有啟動(dòng)子的AAV 2型pBR322質(zhì)粒和步驟1)得到的PAP cDNA進(jìn)行限制 性內(nèi)切酶反應(yīng)，然后進(jìn)行DNA連接反應(yīng)，得到攜帶有啟動(dòng)子和PAP cDNA的重組腺相關(guān)病毒載 體。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟1)中包括以下步驟：11)從前 列腺癌組織中提取PAP的總mRNA，由總mRNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成總cDNA; 12)以所述總cDNA 為模板，在引物 1: CATGAGAGCTGCACCCCTCC和引物2: CTAATCTGTACTGTCCTCAGT的引導(dǎo)下進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，得到所述PAP cDNA。7. -種與攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品，其特征在于:所述產(chǎn)品 為PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體、PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體、或被所述PAP重組腺相 關(guān)病毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系;所述PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體由權(quán)利要求1 ~2所述的或者權(quán)利要求3~6任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法制得的攜帶PAP抗原基因的重組腺相 關(guān)病毒載體制得;所述PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體由所述PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載 體進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)得到。8. 如權(quán)利要求7所述的產(chǎn)品，其特征在于:所述細(xì)胞系為單核-樹突狀細(xì)胞系，該單核-樹突狀細(xì)胞系為PAP陽(yáng)性的前列腺癌所在體系中自然產(chǎn)生的，被所述PAP重組腺相關(guān)病毒的 病毒載體感染或轉(zhuǎn)染得到；或者所述細(xì)胞系為PAP抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞系，該細(xì) 胞系是PAP陽(yáng)性的前列腺癌所在體系中自然產(chǎn)生的T淋巴細(xì)胞與被所述PAP重組腺相關(guān)病毒 的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的單核-樹突狀細(xì)胞系混合培養(yǎng)形成的。9. 一種與攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)的產(chǎn)品的制備方法，其特征在 于： PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體的制備:將如權(quán)利要求1~2所述的或者權(quán)利要求3~6 任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法制得的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體導(dǎo)入基因工程大腸 桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，用含lOOyg/mL氨芐青霉素的LB平板進(jìn)行抗性篩選，挑取白色單菌落， 提取質(zhì)粒并純化，得到PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體； PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體的制備：以所述PAP重組腺相關(guān)病毒的質(zhì)粒載體和 pHelper質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染AAVp細(xì)胞得到PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體； PAP重組腺相關(guān)病毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的制備：用所述PAP重組腺相關(guān)病 毒的病毒載體感染或轉(zhuǎn)染單核細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞得到，所述細(xì)胞系包括單核細(xì)胞-樹突狀 細(xì)胞系。10. -種如權(quán)利要求1所述的攜帶PAP抗原基因的重組腺相關(guān)病毒載體或者權(quán)利要求7 所述相關(guān)的產(chǎn)品在制備抗PAP抗原陽(yáng)性的前列腺癌藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K35/28GK105985984SQ201610416754
【公開日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2016年6月14日
【發(fā)明人】劉勇, 史鵬燕, 董文娟, 高洪吉, 李帆, 馮雪
【申請(qǐng)人】深圳益世康寧生物科技有限公司, 劉勇