改造斑馬魚基因組的構建物及改造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及改造斑馬魚基因組的構建物及改造方法。首次提供了一種以非同源整合方式將外源基因插入到基因組中的方法，可在不影響內源基因表達的基礎上有效插入外源基因并使其正常表達。本發(fā)明為高效而特異地進行基因組編輯操作提供了新途徑。
【專利說明】
改造斑馬魚基因組的構建物及改造方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明屬于基因技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及改造斑馬魚基因組的構建物及 改造方法。
【背景技術】
[0002] 斑馬魚是研究發(fā)育和疾病的重要模式動物。其幼魚小巧透明，組織系統(tǒng)既有一定 的代表性和保守性，同時又有一定的復雜度，方便在實驗室現(xiàn)有的各種操作手段下，動態(tài)地 觀察組織器官發(fā)育和各種生理活動。為充分發(fā)揮斑馬魚在研究上的諸多優(yōu)勢，需要建立針 對其基因的多種操作方法，制備基因功能缺失的突變體或將外源基因導入到特定的基因位 點中。目前，在斑馬魚中，產生基因功能缺失的方法已成熟，并已經被廣泛應用。然而，定向 敲入外源基因的轉基因技術還很不成熟，這是目前制約斑馬魚研究領域發(fā)展的瓶頸之一。
[0003] 目前，制備轉基因斑馬魚主要是通過隨機敲入質粒的方法來實現(xiàn)的。這種方法需 要構建包含目的基因啟動子的質粒，用于驅動所需蛋白的特異表達。但是在斑馬魚中，基因 的啟動子往往都很長，從幾萬個堿基到幾十萬個堿基，亦或更長。因此，構建啟動子的質粒 往往需要用細菌人工染色體同源重組等復雜的技術，耗時數(shù)月，且成功率低。同時，構建好 的質粒，經過顯微注射后經常會發(fā)現(xiàn)非特異的表達情況。其中一個很重要的原因是體外構 建的啟動子由于長度限制，只能包含內源性啟動子的一部分，往往失去了內源性的其他順 式元件的特異性調控，如增強子、沉默子等。
[0004] 因此，還需要開發(fā)新的基因改造方法，以實現(xiàn)向基因組中定向敲入外源基因，同時 能利用內源基因本身的調控元件。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供改造斑馬魚基因組的構建物及改造方法。
[0006] 在本發(fā)明的第一方面，提供一種將外源基因插入到基因組中目標基因位點的方 法，所述方法包括：
[0007] (1)以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止子和3' UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在 目的區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA(sgRNA)靶序列；針對目的區(qū)段確定左同源 臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的5'端的內含子和外顯子直至終止 子前的序列，且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序列，右同源臂序列包含該目的區(qū) 段的3'端終止子和3' UTR序列；
[0008] (2)制備供體質粒，其包括以下操作性連接的元件（按照5' 一 3'順序）：左同源 臂序列，外源基因序列，右同源臂序列；
[0009] (3)將供體質粒、單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA、Cas9mRNA或能形成 所述Cas9 mRNA的DNA共轉靶細胞，獲得基因組中以非同源整合方式插入了外源基因的重 組細胞。
[0010] 在一個優(yōu)選例中，所述的靶細胞是受精卵細胞或體細胞。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的單導向RNA與所述的單導向RNA靶序列互補，其長度 18-24nt ;較佳地為 19-22nt。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的將外源基因插入到基因組中目標基因位點的方法是不影 響內源基因表達的方法，所述的內源基因包括目標基因。
[0013] 在另一優(yōu)選例中，（1)中，右同源臂序列與起始于目標基因的終止密碼子且，涵蓋 目標基因的3' UTR全部區(qū)段；較佳地，左同源臂覆蓋目的區(qū)段中終止密碼子之前的區(qū)段。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的區(qū)段中，所述的內含子是目標基因按照5' 一3'順 序的近3'端1-3個內含子（即最靠近3'末端的1-3個內含子）；較佳地為目標基因按照 5' 一 3'順序的近3'端1-2個內含子（即最靠近3'末端的1-2個內含子）；或
[0015] 所述的外顯子是目標基因按照5' 一 3'順序的近3'端1-2個外顯子（即最靠近 3'末端的1-2個外顯子）；較佳地為目標基因按照5' 一 3'順序的近3'端1個外顯子（即 最靠近3'末端的1個外顯子）。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述的目的區(qū)段1000-6000bp ;或所述的左同源臂序列長度 150-5000bp ;或所述的右同源臂序列長度300-5000bp。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的靶細胞是斑馬魚的細胞，或所述的基因組是斑馬魚的基 因組。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，Cas9 mRNA序列是根據(jù)斑馬魚密碼子偏好優(yōu)化的，即zCas9 mRNA〇
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述的目標基因包括（但不限于）：酪氨酸羥化酶基因（th)，色 氨酸羥化酶2基因（tph2)，膠質纖維酸性蛋白基因（gfap)，血管內皮細胞生長因子受體2 基因（flkl)。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述的目標基因是酪氨酸羥化酶基因，所述的左同源臂序列如 SEQ ID NO: 1中第414-1711位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO: 1中第2501-3171 位所示；或
[0021] 所述的目標基因是色氨酸羥化酶2基因，所述的左同源臂序列如SEQ ID N0:2中 第414-2600位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO:2中第3390-4470位所示；或
[0022] 所述的目標基因是血管內皮細胞生長因子受體2基因，所述的左同源臂序列如 SEQ ID N0:3中第414-746位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID N0:3中第1536-3347位 所示；或
[0023] 所述的目標基因是膠質纖維酸性蛋白基因，所述的左同源臂序列如SEQ ID N0:4 中第414-656位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO:4中第1446-2774位所示。
[0024] 在另一優(yōu)選例中，（2)中，在所述的左同源臂序列與外源基因序列之間，還包括蛋 白切割序列；較佳地，所述的蛋白切割序列為P2A切割序列。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述的P2A切割序列如SEQ ID NO: 1中第1712-1777位所示。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述的外源基因包括（但不限于）：報告基因，結構基因或功能 基因。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述的報告基因包括但不限于：標簽蛋白編碼基因，GFP或EGFP 或 Gal4〇
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述的EGFP的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1中第1778-2494位所 不。
[0029] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于將外源基因插入到基因組中目標基因位點的 供體質粒，該供體質粒包括以下操作性連接的元件：左同源臂序列，外源基因序列，右同源 臂序列；所述的左同源臂和右同源臂如下獲得：以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止 子和3'UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在目的區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA(sgRNA)靶 序列；針對目的區(qū)段確定左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的 5'端的內含子和外顯子直至終止子前的序列，且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序 列，右同源臂序列包含該目的區(qū)段的3'端終止子和3' UTR序列；
[0030] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備用于將外源基因插入到基因組中目標基因位 點的供體質粒的方法，所述方法包括：
[0031] (1)以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止子和3' UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在 目的區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA(sgRNA)靶序列；針對目的區(qū)段確定左同源 臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的5'端的內含子和外顯子直至終止 子前的序列，且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序列，右同源臂序列包含該目的區(qū) 段的3'端終止子和3' UTR序列；
[0032] (2)制備供體質粒，其包括以下操作性連接的元件（按照5' 一 3'順序）：左同源 臂序列，外源基因序列，右同源臂序列。
[0033] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備基因組中目標基因位點插入有外源基因的斑 馬魚的方法，所述方法包括：
[0034] (a)利用所述的方法制備供體質粒；
[0035] (b)將獲得的供體質粒、單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA、Cas9 mRNA或 能形成所述Cas9 mRNA的DNA共轉斑馬魚受精卵，獲得基因組中以非同源整合方式插入了 外源基因的受精卵；
[0036] (c)將該受精卵培養(yǎng)為斑馬魚。
[0037] 在本發(fā)明的另一方面，提供一種用于將外源基因插入到基因組中的試劑盒，所述 試劑盒中包括：所述的供體質粒；單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA ;和Cas9 mRNA 或能形成所述Cas9 mRNA的DNA。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒中還可包括：用于進行顯微注射的試劑，使用說明 書等。
[0039] 本發(fā)明的其它方面由于本文的公開內容，對本領域的技術人員而言是顯而易見 的。
【附圖說明】
[0040] 圖1、內含子靶向介導的EGFP敲入到斑馬魚th基因中。
[0041] ㈧使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導EGFP敲入斑馬魚th基因位點 的模式圖。sgRNA革E序列標記為紅色，protospacer adjacent motif (PAM)序列標記為綠 色。Donor質粒的左臂（1298bp)和右臂序列（671bp)由棕色雙箭頭直線指示。將供體質 粒，sgRNA和zCas9mRNA共同注入斑馬魚胚胎中，就可以使th-P2A-EGFP質粒定向整合進入 th位點。斑馬魚具有13個外顯子，圖中E12，E13分別代表第12個和第13個外顯子。右 邊的模式圖顯示的是轉錄信使RNA(mRNA)和th基因位點被轉錄的蛋白。其中E12、E13分 別表示第12個外顯子和第13個外顯子。
[0042] (B) th-P2A-EGFP敲入的F1代3天幼魚的共聚焦投射圖。圖中顯示EGFP特異表達 在不同亞群的多巴胺能和去甲腎上腺素能的神經元中。比例尺：50 μ m。
[0043] (C)PCR鑒定在基因敲入祖斑馬魚中，th靶點處供體質粒（donor)的5'和3'端連 接。
[0044] (D)在基因敲入的三個不同祖斑馬魚中，EGFP敲入事件的5'和3'端連接點序列。 圖中序列如下：
[0045] sgRNA target ：CTTTATGAGTGTAACAACCC(SEQ ID NO :32)；
[0046]
[0047] (E)全腦雙熒光免疫組化顯示在th-P2A-EGFP敲入的FI代幼魚中，EGFP信號和Th 信號有很好的共定位。比例尺：20 μ m。
[0048] (F)免疫印跡顯示Th在野生型和th-P2A-EGFP敲入的F1代胚胎中的表達。
[0049] (G)多巴胺（DA)的全腦免疫組化顯示，多巴胺在th-P2A_EGFP敲入的F1代幼魚中 相對量和野生型中無明顯差異。比例尺：1〇μπι。
[0050] (Η-Ι)通過在體電生理記錄的方法驗證th-P2A-EGFP敲入的F1代幼魚th表達神 經元的神經活動完整性。比例尺：10 μ m。
[0051] 圖2、內含子靶向介導的轉錄激活蛋白Gal4敲入斑馬魚th基因位點。
[0052] (A)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導Gal4敲入斑馬魚th基因位點的 模式圖。
[0053] (B)th-P2A_Gal4敲入的F1代3天幼魚的共聚焦投射圖。比例尺：50 μπι。
[0054] (C)PCR鑒定th靶點處供體質粒的5'和3'端連接。
[0055] (D) 4個代表性的Gal4敲入事件的5'和3'端連接點序列。
[0056] sgRNA target:CTTTATGAGTGTAACAACCC(SEQ ID NO:41)
[0057] 圖中序列如下：
[0058]
[0059] 圖3、內含子靶向介導的EGFP敲入斑馬魚tph2基因。
[0060] (A)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導EGFP敲入斑馬魚tph2基因位點 的模式圖。其中E10、E11表不第10個外顯子和第11個外顯子。
[0061] (B)EGFP敲入tph2基因位點的3天幼魚的共聚焦投射圖。圖中顯示EGFP能夠很 特異且完整的標記出五羥色胺能神經元。比例尺：50 μm。
[0062] (C)PCR鑒定tph2靶點處供體質粒的5'和3'端連接。
[0063] (D) 3個代表性的EGFP敲入事件的5'和3'端連接點序列。圖中序列如下：
[0064] sgRNA target:ACCTGAGCATACTGACTGAG(SEQ ID NO :48)
[0065]
[0066] 圖4、內含子靶向介導的EGFP敲入斑馬魚gfap基因。
[0067] (A)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導EGFP敲入斑馬魚gfap基因位點 的模式圖。其中E9表不第9個外顯子。
[0068] (B)PCR鑒定gfap祀點處供體質粒的5'和3'端連接。
[0069] (C) 4個代表性的EGFP敲入事件的5'和3'端連接點序列。圖中序列如下：
[0070] sgRNA target:TGGTGCTATGTGTTGCGCAC(SEQ ID NO :67)
[0071]
[0072] (D)EGFP敲入gfap基因位點的3天幼魚的共聚焦投射圖。左圖中顯示EGFP特異 的標記出斑馬魚的腦部的膠質細胞，右圖是軀干中的膠質細胞。比例尺：50μπι。
[0073] (Ε)全腦雙熒光免疫組化實驗，利用兩種抗體分別標記EGFP和Gfap。比例尺： 50 μ m〇
[0074] (F)全細胞在體電生理記錄膠質細胞的電生理特性。黑色尖頭指示記錄電極的位 置。
[0075] (G)電流電壓曲線。
[0076] (H)膠質細胞和神經元的靜息膜電位。
[0077] (I)膠質細胞對光反應性。
[0078] 圖5、內含子靶向介導的EGFP敲入斑馬魚flkl基因。
[0079] ㈧使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導EGFP敲入斑馬魚flkl基因位點 的模式圖。其中E30表不第30個外顯子。
[0080] (B)EGFP敲入flkl基因位點的3天幼魚的共聚焦投射圖。圖中顯示EGFP特異的 標記出斑馬魚的軀干的血管。比例尺：50μπι。
[0081] (C)PCR鑒定flkl靶點處供體質粒的5'和3'端連接。
[0082] (D) 5個代表性的EGFP敲入事件的5'和3'端連接點序列。圖中序列如下：
[0083] sgRNA target:TCTGGTTTGGAAGGACACAG(SEQ ID NO :68)
[0086] 圖6、內含子靶向介導的EGFP敲入融合斑馬魚gfap基因。
[0087] (A)使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，通過內含子靶向介導EGFP敲入斑馬魚gfap基因位點 的模式圖。轉錄出的信使RNA(mRNA)沒有被剪開（沒有P2A序列）從而形成GFAP和EGFP 的融合蛋白。其中E9表示第9個外顯子。
[0088] (B)EGFP敲入gfap基因位點的3天幼魚的共聚焦投射圖。圖中顯示EGFP能夠很特 異標記神經膠質細胞。右邊放大圖，顯示纖維狀的標記。比例尺：50 μm(左），10 μm(右）。
[0089] (C)PCR鑒定gfap靶點處供體質粒的5'和3'端連接。
[0090] (D) 3個代表性的EGFP敲入事件的5'和3'端連接點序列。圖中序列如下：
[0091] sgRNA target:TGGTGCTATGTGTTGCGCAC(SEQ ID NO :87)
[0092]

【具體實施方式】
[0093] 本發(fā)明人經過深入的研究，首次提供了一種以非同源整合方式將外源基因插入到 基因組中特定目標基因位點的方法。本發(fā)明的方法可在不影響內源基因表達的基礎上有效 插入外源基因并使其正常表達，為高效而特異地進行基因組編輯操作提供了新途徑。
[0094] 如本文所用，所述的"操作性連接"或"可操作性相連"是指兩個或多個核酸區(qū)域 或核酸序列的功能性的空間排列。例如：啟動子區(qū)被置于相對于目的基因核酸序列的特定 位置，使得核酸序列的轉錄受到該啟動子區(qū)域的引導，從而，啟動子區(qū)域被"可操作地連接" 到該核酸序列上。
[0095] 如本文所用，所述的"元件"是指一些對于蛋白的表達有用的一系列功能性的核酸 序列，本發(fā)明中，所述的"元件"被系統(tǒng)地構建以形成一種表達構建體。所述的"元件"的序 列可以是本發(fā)明中所提供的那些，也包括它們的變體，只要這些變體基本上保留了所述"元 件"的功能，其通過插入或刪除一些堿基（如l -50bp ;較佳地l-30bp，更佳地l-20bp，更佳 地l-10bp)，或進行隨機或定點突變等來獲得。
[0096] 如本文所用，如本文所用，所述的"外源"或"異源"來自不同來源的兩條或多條核 酸或蛋白質序列之間的關系。例如，如果啟動子與目的基因序列的組合通常不是天然存在 的，則啟動子對于該目的基因來說是"外源"的。特定序列對于其所插入的細胞或生物體來 說是"外源"的。
[0097] 如本文所用，所述的"目標基因"是指基因組上的一個內源基因，外源基因插入到 該"目標基因"的3'端內含子中。
[0098] 如本文所用，所述的"目的區(qū)段"是指"目標基因"的一個片段，該片段通常位于該 "目標基因"的3'端，一般覆蓋"目標基因"3'端的1個、2個或3個內含子，最后1個或者 2個外顯子，終止子，3'端基因間調控序列（3' UTR)。
[0099] 如本文所用，所述的"單導向RNA靶序列"是指在位于"目標基因"的"目的區(qū)段" 的內含子中的一段序列，基于該"單導向RNA靶序列"設計的單導向RNA可識別該靶序列， 由此在該位置可被Cas9編碼的蛋白切割。較佳地，所述的單導向RNA靶序列長度18-24個 核苷酸。
[0100] 本發(fā)明的方法是設計針對目標基因內含子（較佳地為3'末端內含子）的單導向 RNA (sgRNA)，構建包括有基因部分序列和外源基因序列的質粒作為供體（donor)，通過利用 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的核酸內切酶活性，同時切割基因組和供體質粒，使得被切割后的質粒在 基因組的切口處，通過非同源整合的修復方式，將外源基因敲入到基因組中。
[0101] 本發(fā)明通過優(yōu)化選擇所需插入的目標基因中的目的區(qū)段，提供了一種以非同源整 合方式將外源基因插入到基因組中的方法。這種優(yōu)化選擇主要體現(xiàn)在供體質粒的構建上。 本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，針對目標基因3'端內含子設計sgRNA，在相應位點插入外源基因，可以實現(xiàn) 不影響目標基因表達的外源基因插入和表達。
[0102] 本發(fā)明的方法中，sgRNA靶序列位于目的區(qū)段的一個內含子中，該位點將是sgRNA 識別位點和Cas9切割位點。通常內含子可以是靠近目標基因3'端的內含子，較佳地為最 靠近3'末端的1-3個內含子；更佳地為最靠近3'末端的1-2個內含子。
[0103] 由于目的區(qū)段5'端內含子和外顯子直至終止子的序列均被覆蓋入左同源臂中，因 此當進行非同源重組將外源基因插入后，該目標基因自身的表達及功能并不會受到影響。
[0104] 在供體質粒構建中，基因的核苷酸全長序列或其片段通?？梢杂肞CR擴增法、重 組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤 其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的基因自DNA庫或按本領域技術人員已知的常 規(guī)方法所制備的基因組DNA庫作為模板，擴增而得有關序列。
[0105] 所述的質粒中各元件的上游以及下游的位置，還可包括限制性的酶切位點，這樣 有利于各元件的有機連接。此外，所述質粒優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供 用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀。
[0106] 本發(fā)明的方法，可以實現(xiàn)利用基因的內源啟動子驅動外源基因的表達，這樣既可 以省去構建啟動子質粒麻煩，又能保證其表達的高度特異性。更重要的是，本發(fā)明的方法是 對目標基因的3'末端進行改造，不會破壞基因的讀碼框和表達水平。這對于基因功能完整 性的保持和接下來的基因功能研究都非常重要。
[0107] 本發(fā)明的方法可以應用于在基因組目標基因的特定位點插入各種外源基因。所述 外源基因可以是任何本領域技術人員感興趣的基因，包括報告基因（比如熒光蛋白基因）、 結構基因、功能性基因等。本發(fā)明的方法也適用于給內源基因（目標基因）添加標簽蛋白 編碼基因等。
[0108] 本發(fā)明的方法特別適用于在斑馬魚基因組中插入外源基因。表達外源基因的轉基 因模式動物是生命科學研究的重要工具，斑馬魚是近年來新興的一種脊椎動物模型。目前 使用的用于制作轉基因斑馬魚的方法存在一些缺點，如制作周期長、效率低、外源基因表達 特異性差、內源基因被破壞等。本發(fā)明提供的方法當應用于制作轉基因斑馬魚時，極大地提 高了制作效率，并且外源基因的表達特異，內源基因功能保持完整。運用本發(fā)明的方法，高 效地實現(xiàn)了對斑馬魚內源基因的定向操作，成功地將不同的外源基因敲入到內源基因的3' 端，實現(xiàn)了內源基因和外源基因的同時表達。進一步的實驗結果發(fā)現(xiàn)，外源蛋白表達的特異 性和內源蛋白一致，并且內源蛋白的表達和功能也保持完整?？傊?，本方法能高效而特異 地對斑馬魚的基因組進行編輯操作，擴展斑馬魚作為模式動物在生命科學研究領域中的應 用。與傳統(tǒng)的轉基因方法相比，本發(fā)明的方法具有高效和特異的特點，是目前建立表達外源 基因斑馬魚品系的最佳方法。
[0109] 利用本發(fā)明的方法，通過對內源基因進行操作，本發(fā)明人已成功地標記了不同類 型的細胞，包括兩種神經元，膠質細胞，血管內皮細胞等。
[0110] 通過斑馬魚遺傳篩選，本發(fā)明人已獲得穩(wěn)定的斑馬魚品系，這說明通過本發(fā)明的 方法改造的基因可通過生殖細胞穩(wěn)定遺傳到下一代。
[0111] 本發(fā)明還提供了包含有所述供體質粒的試劑盒，較佳地，該試劑盒中還可包括單 導向RNA或能形成單導向RNA的DNA ;以及Cas9 mRNA或能形成Cas9 mRNA的DNA。
[0112] 其它常用于進行轉基因操作的試劑也可被包含在所述的試劑盒中，以方便本領域 技術人員使用，例如顯微注射用的試劑等。此外，所述試劑盒中還可包含有指導本領域技術 人員操作的使用說明書。
[0113] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條 件如J.薩姆布魯克等編著，分子克隆實驗指南，第三版，科學出版社，2002中所述的條件， 或按照制造廠商所建議的條件。
[0114] 實施例中，轉基因的主要設計思路如下：
[0115] 1、設計針對目標基因3'端內含子的特異的sgRNA。
[0116] 2、以PDM-19T為骨架，構建供體質粒。質粒包括三部分：左臂序列、外源蛋白序列 和右臂序列。左臂的序列從上面設計的sgRNA序列的5'端開始，直到基因終止密碼子前的 一個堿基。左臂序列后面緊跟著外源蛋白的序列。接下來是右臂。右臂以終止密碼子開始， 包括基因的全部3' UTR序列。
[0117] 3、將上面合成好的sgRNA和供體質粒，連同zCas9 mRNA，共同顯微注射到一細胞 期的斑馬魚受精卵中。
[0118] 材料和方法
[0119] 1、供體質粒的制備
[0120] 1. 1.制備 T-P2A-EGFP 和 T-P2A_Gal4 質粒
[0121] 以pEGFP-Nl(Clonetech)為模板，以P2A-EGFP融合序列PCR擴增引物擴增獲得 P2A-EGFP融合序列；以PEM-Gal4VP16 (Tol2Kit)為模板，以P2A-Gal4融合序列擴增引物擴 增P2A-Gal4融合序列。然后通過T-A克隆的方法連入到PMD-19T載體（購自Takara)中。 通過用M13正向引物測序質粒，篩選正向插入的質粒，完成T-P2A-EGFP和T-P2A-Gal4質粒 的制作。
[0122] P2A-EGFP融合序列PCR擴增引物：

[0128] 質粒中，P2A序列是一種被剪切的序列，用于分別表達P2A序列前后兩種蛋白。 EGFP 序列來自質粒 pEGFP-Nl (Clonetech)。Gal4 序列來自質粒 PEM-Gal4VP16(Tol2Kit)。
[0129] 用于表達融合蛋白的gfap-EGFP供體質粒的構建：
[0130] 將供體質粒中的片段P2A-EGFP用BamHI和Agel切下，連接上TCTTCT-EGFP序列：
[0131] TCTTCT-EGFP序列來自通過以下引物，用pEGFP-Nl (Clonetech)為模板PCR擴增得 到。
[0134] 1.2.制備最終質粒
[0135] 用斑馬魚基因組DNA為模板，用表1所示引物分別PCR擴增各基因的左臂右臂。將 左臂用ΚρηΙ和BamHI雙酶切，連接到T-P2A-EGFP質粒中。在此基礎上，再將右臂通過Agel 和Sail連接到已連接左臂的T-P2A-EGFP質粒中，如圖1A，形成最終的供體質粒。
[0136] 表1、各個基因左右臂PCR擴增用引物
[0137]
[0138] 2、sgRNA 和 zCas9 mRNA 的合成
[0139] 表達zCas9的質粒PGH-T7-zCas9獲自北京大學生命科學院。將該質粒用Xba I 內切酶線性化后，用mMACHINE T7 Ultra kit(Ambion)試劑盒轉錄純化，獲得zCas9 mRNA。
[0140] 用于制備不同sgRNA的DNA序列如下所示：
[0141] th :GGGTTGTTACACTCATAAAG(SEQ ID NO:28) (reverse strand，在反義鏈上）；
[0142] gfap :GTGCGCAACACATAGCACCA(SEQ ID NO:29) (reverse strand，在反義鏈上）；
[0143] tph2 :ACCTGAGCATACTGACTGAG(SEQ ID NO:30) (forward strand，在正義鏈上）；
[0144] flkl :TCTGGTTTGGAAGGACACAG(SEQ ID NO:31) (forward strand，在正義鏈上）。
[0145] 分別將上面的sgRNA序列克隆到PT7_sgRNA質粒（獲自北京大學生命科學院） 的 Bbsl 位點中，通過 MAXIscript T7 Kit(Ambion)，進行體外轉錄，并用 mirVana? miRNA Isolation Kit (Ambion)試劑盒回收，獲得 sgRNA。
[0146] 3、斑馬魚飼養(yǎng)
[0147] 成年斑馬魚采用北京愛生公司水生動物養(yǎng)殖系統(tǒng)，培養(yǎng)在水溫28°C，PH7-8,以及 光周期14小時亮/10小時暗的環(huán)境中。胚胎飼養(yǎng)在10%的Hank' s溶液中。溶液成分如 下（毫摩）：14〇NaCl，5. 4KC1，0· 25Na2HP04,0· 44KH2P04,1. 3CaCl2,1. 0MgS04和 4. 2NaHC0 3 (pH 7. 2)。
[0148] 4、顯微注射
[0149] zCas9 mRNA，sgRNA和供體質粒一起通過顯微注射注入到一細胞期的斑馬魚受精 卵中。每個受精卵注入lnl液體。其中含有800ng/ μ 1 zCas9 mRNA，80ng/ μ 1 sgRNA，和 15ng/ μ 1供體質粒。
[0150] 受精卵在體外培養(yǎng)條件下（見3.斑馬魚飼養(yǎng)）可以直接發(fā)育為斑馬魚。
[0151] 5、共聚焦成像
[0152] 共聚焦成像使用FV1000共聚焦顯微鏡（Olympus，Japan)，用20倍或者40倍的水 鏡（Ν.Α.，0. 80)以光切片的方式在Z軸方向采集連續(xù)的熒光圖片。所有圖片的分辨率是 1024X1024或者800X600。后期通過ImageJ軟件（NIH)重構結構形態(tài)。
[0153] 6、在體雙光子鈣成像
[0154] 3到5天清醒的斑馬魚幼魚首先埋在1. 5%的低熔點膠中，再利用帶有40倍水鏡 的FV1000共聚焦顯微鏡（Olympus，Japan)進行實時成像，采樣頻率是2赫茲。為了分析|丐 信號，圖像首先利用ImageJ軟件（NIH)進行對齊。每一次實驗，感興趣區(qū)域（regions of interest，ROIs)都通過手動圈出。感興趣區(qū)域的熒光強度隨時間的變化通過（F-F0)/F0計 算得出。其中，是感興趣區(qū)域每次實驗前20張沒有給刺激的熒光灰度均值。實驗中的 機械刺激是通過電極通過氣壓噴出水流到幼魚尾巴上給出（0. 5s持續(xù)，40s間隔）。
[0155] 7、在體電生理記錄
[0156] 3到5天的斑馬魚幼魚首先用α -銀環(huán)蛇毒素（a-bungarotoxin，100 μ g/ml， Sigma)經過10到15分鐘時間麻痹，然后埋于1. 0%的低熔點膠中。電生理記錄電極是由外 徑 1. 0mm，內徑 0· 58mm 的硼娃酸鹽玻璃管（Borosilicateglass，Sutter Instrument)在水 平微電極拉制儀（Model P-97, Sutter Instrument)上用三步法拉制而成，電阻大約20ΜΩ， 尖端約 1. 5 μ m。外液成分（毫摩）為 134 NaCl，2. 9KC1，2. lCaCl2,1. 2MgCl2,10HEPES，and 10 glucose(pH 7.8);內液成分為 110K-gluconate，5KCl，0.3Na4-GTP，2Mg2-ATP，2CaCl 2,5 Phosphocreatine，10HEPES，and 10 EGTA(pH 7· 3)。記錄前需在準備記錄位置附近劃一個 小傷口。記錄時，電極里灌入一定量的內液，并加上少許正壓，緩慢但以穩(wěn)定速度和適宜角 度斜向下移動到要記錄細胞附近。當電極接觸到胞體，電極阻抗會有明顯增大，此時立即釋 放正壓，形成巨歐姆封接（gigaseal)。吸破之后便可記錄到細胞內的電活動。數(shù)據(jù)的采集 和信號的處理使用的是膜片鉗放大器（MultiClamp 700B，Axon Instruments)和Clampex 10. 2 (Molecular Devices)〇
[0157] 8、全腦免疫組織化學
[0158] Th/GFP免疫熒光共標組化，首先需將4天的斑馬魚幼魚在含有4%多聚甲醛 (paraformaldehyde，PFA)的 PBS(phosphate_bufTered saline)中 4°C固定過夜。次日， 將斑馬魚頭部用眼科剪剪下，加入含有10 %山羊血清（normal goat serum，NGS，Gibco)室 溫封閉2小時。之后將標本轉到用1 % NGS的PBST配置的含有Th抗體（mouse anti-Th， 1:200)和GFP抗體（mouse anti-Gfap，l:200)的抗體溶液中，4°C搖床孵育4到5天。一抗 孵育好之后于室溫搖床上洗脫12小時。隨后將標本轉移至含有Alex568偶聯(lián)的抗鼠二抗 (1:1000)的1% NGS PBST溶液中。二抗4°C孵育2天后洗脫12小時，即可拿去成像。
[0159] 多巴胺免疫組化染色時，4天斑馬魚幼魚需在含有5%戊二醛（glutaraldehyde， GA)和 1%焦亞硫酸鈉 （sodium metabisulfite，SMB，PH 7. 2)的 PBS 中 4°C過夜固定。之 后埋于6%的低熔點膠中固定，用振動切片機（Leica VT1200S)將標本切成70μπι每張，轉 移至ΕΡ管中進行余下的組化步驟。其中多巴胺抗體是兔源的多克隆抗體（1:500)，來源于 Dr.Harry Steinbuchel 實驗室。GFP 抗體是鼠源的單克隆抗體（l:800，Molecular probe)。 其余步驟基本與Th/GFP共標實驗一致。
[0160] 實施例1、內含子靶向介導的增強型綠色熒光蛋白（EGFP)敲入斑馬魚酪氨酸羥化 酶（th)基因位點
[0161] 酪氨酸羥化酶是合成多巴胺和去甲腎上腺素兩大神經遞質的限速酶，可以作為多 巴胺能神經元和去甲腎上腺素能神經元特異的標記。本發(fā)明人設計了一個sgRNA，靶向定 位到斑馬魚酪氨酸羥化酶基因最后一個內含子，通過CRISPR/Cas9切割形成的雙鏈缺口， 利用非同源重組的方式介導一個含有EGFP編碼序列的供體質粒的敲入（圖1A)。該sgRNA 對靶向位點的切割效率可達到83. 3% (表2)。供體質粒由左臂，P2A-EGFP編碼序列以及 右臂三部分組成（圖1A)。為了保留th基因完整的編碼序列，左臂的設計是從sgRNA靶點 序列的5'端開始，包含了最后一個外顯子（第十三個外顯子），直到酪氨酸羥化酶基因終止 密碼子前的最后一個堿基。同時為了保證酪氨酸羥化酶表達的正?？刂?，右臂包含了終止 密碼子和3'端的調控序列。其中的P2A短肽是多順表達的一個連接元件，用于酪氨酸羥化 酶和增強型綠色熒光蛋白的分別表達。
[0162] 表2、不同基因 sgRNA的切割效率和供體質粒的敲入效率
[0163]
[0164] 將供體質粒，sgRNA和斑馬魚Cas9的信使RNA (mRNA)顯微注射到一細胞期（即單 細胞期）的斑馬魚受精卵中，通過同時切割供體質粒和基因組中酪氨酸羥化酶基因上的靶 點，使得供體質粒以非同源整合方式高效率的敲入到酪氨酸羥化酶最后一個內含子中。
[0165] 在25個具有嵌合熒光表達的注射過的胚胎中，本發(fā)明人一共篩選到3條可以將 熒光遺傳到F1代的斑馬魚。其產生的下一代中，EGFP表達的效率在15. 5%到21. 1%之間 (表 3)。
[0166] 同時，本發(fā)明人用PCR的方法檢測了這3條斑馬魚中供體質粒敲入基因組的突變 情況（圖1C-D)，證明了質粒在基因組特定位點的敲入。在F1代斑馬魚中，EGFP的表達范 圍包括具有多巴胺能神經元的嗅球（olfactory bulb，0B)，前頂蓋（pretectum，Pre)，中間 下丘腦（intermediate hypothalamus，HI)，后結核（posterior tubercular，PT)等腦區(qū)，以 及具有去甲腎上腺素能神經元的藍班（locus coeruleus，LC)和延髓（medulla oblongata， M0)(圖 1B)。
[0167] 為了驗證敲入的增強型綠色熒光蛋白表達的特異性，本發(fā)明人在FI代幼魚上做 了全腦雙熒光免疫組化實驗，利用兩種抗體分別標記增強型綠色熒光蛋白和酪氨酸羥化 酶。結果顯示兩者具有很好的共定位（圖1E)。
[0168] 同時通過免疫印跡實驗，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在敲入外源基因的斑馬魚實驗組有兩條 帶，分別是Th-P2A融合蛋白（58KD)和野生型Th。這兩帶的灰度值一樣，并且兩者的加和顯 示出酪氨酸羥化酶的蛋白表帶水平在增強型綠色熒光蛋白敲入的幼魚和野生型幼魚中沒 有差異（圖1F)。
[0169] 進一步地，為了驗證這種敲入方式沒有影響神經元的正常生理功能，本發(fā)明人分 別在th-P2A-EGFP敲入的F1代幼魚中進行多巴胺全腦組化和在體電生理記錄。組化結果 顯示，F(xiàn)1代的幼魚中多巴胺在相對量和野生型中并無差異（圖1G)。
[0170] 電生理的結果也顯示，表達增強型綠色熒光蛋白的神經元仍具有正常的神經電活 動（圖 1H-I)。
[0171] 上述結果說明，本發(fā)明的方法不會破壞斑馬魚的內源基因，同時被標記細胞的正 常生理功能也沒有受到影響。
[0172] 表3、三個th-P2A-EGFP敲入祖斑馬魚的EGFP陽性F1代的比率
[0173]
[0174] 實施例2、內含子靶向介導的Gal4敲入斑馬魚th基因位點
[0175] 為了擴大本發(fā)明的方法應用面，本發(fā)明人用同樣的方法在th位點敲入了轉錄激 活蛋白Gal4(圖2A)。將注射的胚胎養(yǎng)大到成年，與Tg(UAS :Kaede)的轉基因斑馬魚（獲自 美國俄勒岡大學）雜交，在28條魚中篩選到2個表達Gal4蛋白的祖代。這2個祖代斑馬 魚產生的陽性F1代的效率分別是2. 8%和12. 0% (表4)。
[0176] 在和Tg(UAS:Kaede)轉基因斑馬魚雜交的后代上，可以看到熒光蛋白Kaede特異 表達在后結核（PT)和中間下丘腦（HI)(圖2B)。
[0177] 同時，用PCR檢測了這2個祖代中供體質粒的插入情況，結果如圖2C-D，顯示了準 確的插入。
[0178] 表4、兩個th-P2A_Gal4祖斑馬魚產生Gal4陽性F1代的比率
[0179]
[0180] 實施例3、內含子革El向介導的EGFP敲入斑馬魚色氨酸輕化酶2 (tryptophan hydroxylase 2, tph2)基因位點
[0181] Tph2蛋白是合成五羥色胺的限速酶，可以作為五羥色胺能神經元特異的標記。 本發(fā)明人設計了一個sgRNA靶向定位到斑馬魚tph2基因倒數(shù)第二個內含子，同時通過 CRISPR/Cas9切割形成的雙鏈缺口，利用非同源重組的方式介導一個含有EGFP編碼序列的 供體質粒的敲入（圖3A)。該sgRNA對靶向位點的切割效率可達到63. 6% (表2)。
[0182] 本發(fā)明人觀察了注射后具有嵌合EGFP表達的3天斑馬魚幼魚，能夠特異標記出中 縫核（Raphe)和脊髓（spinal cord)內的五輕色胺能神經元（圖3B)。
[0183] 同時，本發(fā)明人PCR檢測了供體質粒的插入情況，確認其正確敲入到位點，如圖 3C-D〇
[0184] 實施例4、內含子靶向介導的EGFP敲入斑馬魚膠質纖維酸性蛋白基因 （Glial fibrillary acidic protein，GFAP)位點
[0185] Gfap蛋白是在膠質細胞中特異表達。本發(fā)明人設計了一個sgRNA靶向定位到斑馬 魚gfap基因最后一個內含子，同時通過CRISPR/Cas9切割形成的雙鏈缺口，利用非同源重 組的方式介導一個含有EGFP編碼序列的供體質粒的敲入（圖4A)。
[0186] 本發(fā)明人用PCR檢測了供體質粒的插入情況，確認其正確敲入到gfap基因的位點 (圖4B-C)。該sgRNA對靶向位點的切割效率可達到40% (表2)。
[0187] 本發(fā)明人觀察了注射后的3天斑馬魚幼魚，其腦部和脊髓中的膠質細胞特異表達 EGFP (圖 4D)。
[0188] 通過全腦雙熒光免疫組化實驗，利用兩種抗體分別標記EGFP和Gfap，本發(fā)明人發(fā) 現(xiàn)兩者具有很好的共定位（95±4% )，表明敲入的EGFP表達的特異性和內源性Gfap -致 (圖 4E)。
[0189] 為了進一步驗證被敲入外源基因的膠質細胞的功能是否正常，本發(fā)明人通過全細 胞在體電生理記錄的方法檢測其電活動（圖4F)。發(fā)現(xiàn)其具有線性的電流電壓曲線（圖 4G)，膜靜息電位值更負（圖4H)，并且會出現(xiàn)對光照的緩慢的去極化反應（圖41)，這些都 是膠質細胞典型的電生理特質。
[0190] 實施例5、內含子靶向介導的EGFP敲入斑馬魚血管內皮細胞生長因子受體 2(fetal liver kinasel，flkl)基因位點
[0191] Flkl蛋白是血管發(fā)育生長必須的受體，是血管內皮細胞特異的標記。本發(fā)明人設 計了一個sgRNA靶向定位到斑馬魚flkl基因最后一個內含子，同時通過CRISPR/Cas9切割 形成的雙鏈缺口，利用非同源重組的方式介導一個含有EGFP編碼序列的供體質粒的敲入 (圖5A)。該sgRNA對靶向位點的切割效率可達到38% (表2)。
[0192] 本發(fā)明人觀察了注射后的3天斑馬魚幼魚，其血管特異表達EGFP，并且血管的形 態(tài)和發(fā)育正常（圖5B)。
[0193] 同時，本發(fā)明人用PCR檢測了供體質粒的插入情況，確認其正確敲入到flkl基因 的位點（圖5C-D)。
[0194] 實施例6、內含子革巴向介導的EGFP融合到膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，gfap)基因位點
[0195] 觀察受體蛋白的分布或者胞內蛋白的運動在細胞生物學領域必不可少。為了驗證 本發(fā)明人的技術也能應用到這個層面，本發(fā)明人在設計實驗時把連接元件P2A給去掉，換 成TCTTCT的絲氨酸-絲氨酸連接序列，這樣敲入位點蛋白和EGFP將不會被剪開而形成融 合蛋白，從而可以很好地觀察該位點蛋白的分布和運動。
[0196] GFAP蛋白是中間纖維的一種，主要存在于神經膠質中，常被作為膠質細胞的一個 典型的標記蛋白。如前，制備了一個sgRNA革巴向定位到斑馬魚gfap基因最后一個內含子， 同時通過CRISPR/Cas9切割形成的雙鏈缺口，利用非同源重組的方式介導一個含有EGFP編 碼序列的供體質粒的敲入。由于缺少P2A，編碼出來的gfap和EGFP mRNA沒有被剪開，使得 Gfap和EGFP蛋白通過一個柔軟絲氨酸-絲氨酸連接融合在一起（圖6A)。該sgRNA對革巴 向位點的切割效率為35%。
[0197] 本發(fā)明人觀察了注射后具有嵌合EGFP表達的3天斑馬魚幼魚，能夠特異標記出脊 髓內的神經膠質細胞（圖6B左）。放大來看，能看到絲狀纖維的形態(tài)，表明EGFP和GFAP融 合在一起，標記出GFAP纖維狀的形態(tài)（圖6B右）。
[0198] 同時，本發(fā)明人PCR檢測了供體質粒的插入情況，確認其正確敲入到位點（圖 6C-D)〇
[0199] 討論
[0200] 目前定向基因敲入在斑馬魚中的應用剛剛起步。制約的因素主要是體外培養(yǎng)和斑 馬魚胚胎干細胞操作技術還不具備，現(xiàn)階段也無法實現(xiàn)斑馬魚的代孕和嵌合體斑馬魚的產 生。因此，目前還無法運用小鼠中常用的同源重組體外打靶的方法建立斑馬魚基因敲入品 系。同時，由于細胞本底水平的同源重組效率非常低，如果只將包含左右同源臂的打靶載體 注射到受精卵中，很難實現(xiàn)在體水平的基因敲入。然而，如果利用基因組產生的雙鏈DNA斷 裂（double strands break, DSB)，可以使同源重組的效率提高若干個數(shù)量級。Cas9系統(tǒng)的 高效切割DNA產生DSB的特點為基因敲入提供了更簡單的途徑。美國Jaenisch教授實驗 室首先在小鼠中應用Cas9系統(tǒng)，實現(xiàn)了大片段DNA的定點插入。他們將Cas9 mRNA、sgRNA 和模板質粒共同注射到一細胞期小鼠受精卵中，通過同源重組機制，將大片段的報告基因 插入到Nanog和0ct4基因的3'端，成功地實現(xiàn)了對胚胎干細胞和被靶向基因表達的蛋白 標記（Yang, H. et al. Cell 154, 1370-1379)。然而，這種策略現(xiàn)在還無法高效的應用在在斑 馬魚中，來實現(xiàn)大片段DNA敲入，其中一個很重要的原因是斑馬魚受精卵在一細胞期停留 時間非常短，只有十幾分鐘（小鼠則有數(shù)小時），如此短的時間窗口難以實現(xiàn)高效的介導同 源重組的發(fā)生，因而整合效率也就很低。另一個重要原因是斑馬魚的基因組背景相對復雜， 近交品系基因組序列的純合度不夠，克隆序列完全一致的長片段同源臂比較困難（同源重 組需要左右臂的序列與基因組完全一致）。這兩點制約了利用同源重組整合的方法建立斑 馬魚定點基因敲入。
[0201] 針對以上存在的問題，本發(fā)明利用了非同源重組的原理來實現(xiàn)外源基因在斑馬魚 中的高效定點敲入。與同源重組的利用cas9切割基因組而避免使其切割供體質粒方式不 同，非同源重組的DNA整合需要將供體質粒和基因組共同切割，從而在基因組切口處插入 被cas9切割后的線性化的供體質粒。因此，本發(fā)明在供體質粒中引入了 cas9的切割位點 (存在有左臂的內含子中），即sgRNA對應的位點。利用非同源重組的策略也避免了前面 所說的同源重組中同源臂序列必須與基因組序列完全一致的苛刻條件，降低了同源臂序列 的選擇難度及供體質粒的制作難度。更重要的是，本發(fā)明的策略是在供體質粒內部增加了 內源基因的最后一到兩個內含子和外顯子以及3'端的非翻譯調控區(qū)（3' UTR)，避免了外源 DNA序列的插入對內源目標基因的完整性的破壞?？傊蚯萌氲男侍禺愋院蛯仍椿?因功能完整性的保持，是本發(fā)明的創(chuàng)新點。
[0202] 在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨 引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范 圍。
【主權項】
1. 一種將外源基因插入到基因組中目標基因位點的方法，其特征在于，所述方法包 括： (1) 以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止子和3' UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在目的 區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA靶序列；針對目的區(qū)段確定左同源臂序列和右同 源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的5'端的內含子和外顯子直至終止子前的序列， 且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序列，右同源臂序列包含該目的區(qū)段的3'端終止 子和3' UTR序列； (2) 制備供體質粒，其包括以下操作性連接的元件：左同源臂序列，外源基因序列，右 同源臂序列； (3) 將供體質粒、單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA、Cas9mRNA或能形成所 述Cas9mRNA的DNA共轉靶細胞，獲得基因組中以非同源整合方式插入了外源基因的重組細 胞。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的目的區(qū)段中，所述的內含子是目標基 因按照5' 一 3'順序的近3'端1-3個內含子；較佳地為目標基因按照5' 一 3'順序的近3' 端1-2個內含子；或 所述的外顯子是目標基因按照5' 一 3'順序的近3'端1-2個外顯子；較佳地為目標基 因按照5' 一 3'順序的近3'端1個外顯子。3. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的靶細胞是斑馬魚的細胞，或所述的基 因組是斑馬魚的基因組。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，所述的目標基因包括：酪氨酸羥化酶基因， 色氨酸羥化酶2基因，膠質纖維酸性蛋白基因，血管內皮細胞生長因子受體2基因。5. 如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的目標基因是酪氨酸羥化酶基因，所 述的左同源臂序列如SEQ ID NO: 1中第414-1711位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO: 1中第2501-3171位所示；或 所述的目標基因是色氨酸羥化酶2基因，所述的左同源臂序列如SEQ ID N0:2中第 414-2600位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO:2中第3390-4470位所示；或 所述的目標基因是血管內皮細胞生長因子受體2基因，所述的左同源臂序列如SEQ ID NO:3中第414-746位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID NO:3中第1536-3347位所示； 或 所述的目標基因是膠質纖維酸性蛋白基因，所述的左同源臂序列如SEQ ID N0:4中第 414-656位所示；所述的右同源臂序列如SEQ ID N0:4中第1446-2774位所示。6. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，（2)中，在所述的左同源臂序列與外源基因 序列之間，還包括蛋白切割序列；較佳地，所述的蛋白切割序列為P2A切割序列。7. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的外源基因包括：報告基因，結構基因 或功能基因。8. -種用于將外源基因插入到基因組中目標基因位點的供體質粒，其特征在于，該供 體質粒包括以下操作性連接的元件：左同源臂序列，外源基因序列，右同源臂序列； 所述的左同源臂和右同源臂如下獲得：以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止子 和3' UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在目的區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA靶序列；針 對目的區(qū)段確定左同源臂序列和右同源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的5'端的內 含子和外顯子直至終止子前的序列，且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序列，右同 源臂序列包含該目的區(qū)段的3'端終止子和3' UTR序列。9. 一種制備用于將外源基因插入到基因組中目標基因位點的供體質粒的方法，其特征 在于，所述方法包括： ⑴以目標基因3'端包含內含子、外顯子、終止子和3' UTR區(qū)段作為目的區(qū)段，在目 的區(qū)段的內含子序列中確定一段單導向RNA靶序列；針對目的區(qū)段確定左同源臂序列和 右同源臂序列，左同源臂序列包含該目的區(qū)段的5'端的內含子和外顯子直至終止子前的序 列，且左同源臂序列中包含所述單導向RNA靶序列，右同源臂序列包含該目的區(qū)段的3'端 終止子和3' UTR序列； (2)制備供體質粒，其包括以下操作性連接的元件：左同源臂序列，外源基因序列，右 同源臂序列。10. -種制備基因組中目標基因位點插入有外源基因的斑馬魚的方法，其特征在于，所 述方法包括： (a) 利用權利要求9所述的方法制備供體質粒； (b) 將獲得的供體質粒、單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA、Cas9mRNA或能形 成所述Cas9mRNA的DNA共轉斑馬魚受精卵，獲得基因組中以非同源整合方式插入了外源基 因的受精卵； (c) 將該受精卵培養(yǎng)為斑馬魚。11. 一種用于將外源基因插入到基因組中的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中包括： 權利要求8所述的供體質粒； 單導向RNA或能形成所述單導向RNA的DNA ;和 Cas9mRNA或能形成所述Cas9mRNA的DNA。
【文檔編號】C12N15/11GK105985982SQ201510075155
【公開日】2016年10月5日
【申請日】2015年2月12日
【發(fā)明人】杜久林, 李佳, 張白冰
【申請人】中國科學院上海生命科學研究院