一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，包括：(1)從斑馬魚基因組中克隆Mdr1蛋白的啟動子調(diào)控序列；(2)將克隆的DNA片段融合于GFP編碼序列的上游構(gòu)建表達(dá)載體；(3)將該表達(dá)載體進(jìn)行斑馬魚胚胎顯微注射；(4)將注射后的胚胎培養(yǎng)至性成熟，并與野生型斑馬魚交配產(chǎn)卵；(5)熒光顯微鏡下篩選陽性的F1代，繼續(xù)自交傳至F2代，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系。由于熒光蛋白的表達(dá)水平可受到重金屬及多環(huán)芳烴等多種環(huán)境污染物濃度依賴性的誘導(dǎo)，因而本案所制備的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可用于探測環(huán)境中的上述化學(xué)污染物的存在及濃度，且具有經(jīng)濟(jì)、快速、方便、準(zhǔn)確的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種環(huán)境污染物生物探測器的生產(chǎn)方法，具體涉及一種靈敏監(jiān)測環(huán)境污染物濃度的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的構(gòu)建方法。
【背景技術(shù)】
[0002]隨著社會的發(fā)展，人類生產(chǎn)和利用的合成化學(xué)物質(zhì)越來越多，這些物質(zhì)通過各種途徑進(jìn)入環(huán)境中，不僅會引起水生生物死亡和水生態(tài)系統(tǒng)破壞，還會直接或間接威脅到人類健康。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，重金屬、多環(huán)芳烴及多氯聯(lián)苯等化學(xué)污染物導(dǎo)致世界每年大約數(shù)百萬人死亡，更是60~90%癌癥的誘因。僅在中國，每年因工業(yè)污染物引發(fā)的新增癌癥患者數(shù)量就高達(dá)94.5萬。然而，當(dāng)今社會已無法離開化學(xué)工業(yè)及其產(chǎn)品，為此，通過加強(qiáng)對環(huán)境中污染物水平的檢測，進(jìn)而限制工廠污染物排放就變得更為緊迫。
[0003]作為一種來自印度的熱帶淡水魚，斑馬魚最初被用于發(fā)育生物學(xué)與遺傳學(xué)的研究。由于其具有自身的獨(dú)特優(yōu)勢，如:體型小、體外受精、卵生且產(chǎn)卵量大、胚胎透明且發(fā)育速度快，此外其培養(yǎng)液中可直接加入化學(xué)污染物，進(jìn)而檢測污染物毒性。因此，斑馬魚也逐漸被應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)研究中，而歐盟、美國及日本各國更是將斑馬魚列入環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)測試生物中。
[0004]與此同時(shí)，根據(jù)污染物作用于斑馬魚后的生物學(xué)指標(biāo)變化，結(jié)合綠色熒光蛋白(GFP)及紅色熒光蛋白等轉(zhuǎn)基因技術(shù)，研究者還構(gòu)建了各種轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型使其可用于定量反映環(huán)境污染物濃度。如根據(jù)多環(huán)芳烴對于細(xì)胞色素酶(CYP)IAl的誘導(dǎo)作用，Hung等人構(gòu)建了表達(dá)綠色熒光蛋白(CYP-GFP)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，可在0.04 μ g/L多氯化三聯(lián)苯的誘導(dǎo)下表達(dá)綠色熒光， 提示環(huán)境中多環(huán)芳烴的含量超標(biāo)(Hung K.ff.，Suen M.F.，ChenY.F.，Cai H.B.，Mo Z.X.，Yung Κ.K.；Detection of water toxicity using cytochromeP450transgenic zebrafish as live biosensor:for polychlorinated biphenylstoxicity ；Biosens Bioelectron, 2012, 31 (I)，548-553)。復(fù)旦大學(xué)宋后燕、鐘濤領(lǐng)銜的課題組則篩選出對雌激素類物質(zhì)敏感的斑馬魚vtg基因啟動子，據(jù)此構(gòu)建了隨Vtg表達(dá)綠色熒光蛋白進(jìn)而可直觀監(jiān)測環(huán)境中雌激素含量的轉(zhuǎn)基因斑馬魚，響應(yīng)濃度可達(dá)到μ g/L級(Chen H.，Hu J.,Yang J.,Wang Y.，Xu H.，Jiang Q.,Gong Y.，Gu Y., Song H.,Generationof a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens.Aquat Toxicol，2010，96(l)，53-61)。與傳統(tǒng)環(huán)境檢測方法相比，轉(zhuǎn)基因斑馬魚模型具有快捷方便且經(jīng)濟(jì)有效等優(yōu)勢，但目前已有的監(jiān)測模型往往僅能針對特定化學(xué)污染物進(jìn)行反應(yīng)，缺乏廣譜性。
[0005]作為機(jī)體抵御外源物攝入的主要工具之一，Mdrl等ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白被發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于受精24h后的斑馬魚中，可顯著降低重金屬毒素、多環(huán)芳烴和多氯聯(lián)苯等多種毒素的積累及其毒性(Faria M.,Navarro A.，Luckenbach T.,Pina B.，Barata C.,Characterizationof the multixenobiotic resistance (MXR)mechanism in embryos and larvae of thezebra mussel(Dfeissena polymorpha)and studies on its role in tolerance tosingle and mixture combinations of toxicants.AquatToxicol,2011,101(I), 78-87)。此外，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)(He Q.,Liu K.,Wang S.,Hou H.,Yuan Y.,Wang X.,Toxicityinduced by emodin on zebrafish embryos.Drug Chem Toxicol,2012,35 (2),149-154)均表明，Mdrl可在毒素存在的情況下被誘導(dǎo)表達(dá)，從而提示可針對性地開發(fā)新的環(huán)境監(jiān)測型斑馬魚。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚可方便快捷地對多種化學(xué)污染物濃度進(jìn)行監(jiān)測，為水環(huán)境保護(hù)工作提供新的工具。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，達(dá)到上述技術(shù)效果，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0008]一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，包括以下步驟:
[0009]步驟(1)，從斑馬魚基因組中克隆Mdrl蛋白的啟動子調(diào)控序列；
[0010]步驟(2)，將步驟(1)中克隆的DNA片段融合于GFP編碼序列的上游，構(gòu)建成表達(dá)載體 Mdrlpromoter-GFP ；
[0011]步驟(3),將所述表達(dá)載體Mdrlpromoter-GFP進(jìn)行斑馬魚胚胎顯微注射；
[0012]步驟(4)，將注射后的胚胎培養(yǎng)至性成熟，并與野生型斑馬魚交配產(chǎn)卵；
[0013]步驟(5)，熒光顯微鏡下篩選陽性的Fl代，繼續(xù)自交傳至F2代，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系。
[0014]優(yōu)選地，所述的用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，步驟(1)中克隆的DNA片段來源于Mdrl蛋白編碼基因的ATG起始密碼子5’端上游的280bp序列。
[0015]優(yōu)選地，所述的用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，在步驟(3)中，所述表達(dá)載體Mdrlpromoter-GFP注入的時(shí)間點(diǎn)為斑馬魚受精卵單細(xì)胞時(shí)期。
[0016]本發(fā)明的有益效果是:通過本案的制備方法生產(chǎn)出的轉(zhuǎn)基因斑馬魚可穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白，且蛋白表達(dá)水平受外源性化學(xué)污染物濃度依賴性的誘導(dǎo)，因而該轉(zhuǎn)基因斑馬魚可用于探測環(huán)境中的重金屬及多環(huán)芳烴等化學(xué)污染物的存在及濃度，且其具有經(jīng)濟(jì)、快速、方便、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎培養(yǎng)至24hpf時(shí)，氯化鎘處5h后，GFP基因表達(dá)被氯化鎘濃度依賴性的誘導(dǎo)的PCR結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0018]下面結(jié)合附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步的詳細(xì)說明，以令本領(lǐng)域技術(shù)人員參照說明書文字能夠據(jù)以實(shí)施。
[0019]實(shí)施例1-轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法
[0020](I)從斑馬魚基因組中克隆Mdrl蛋白的啟動子調(diào)控序列，即Mdrl蛋白編碼基因的ATG起始密碼子的5’端上游280bp的一段DNA序列；
[0021]通過mRNA序列與斑馬魚基因組序列的BLASTIN程序比對分析，在GENEBANK上找到斑馬魚Mdrl基因的啟動子序列，設(shè)計(jì)對應(yīng)的正反向引物，兩端分別接入XhoI和BamHI的酶切穩(wěn)點(diǎn)，高保真PCR的方法擴(kuò)增到片段，此片段進(jìn)一步連接到pGME-T載體中，經(jīng)過測序后確認(rèn)此克隆為目標(biāo)片段。
[0022](2)構(gòu)建表達(dá)載體 mdr lpromoter-GFP
[0023]用XhoI和BamHI將斑馬魚Mdrl啟動子280bp從載體上切下，裝入pEGFP載體中，所得到的重組表達(dá)載體mdrlpromoter-GFP，包含斑馬魚Mdrl基因的調(diào)控序列和GFP編碼序列。
[0024](3)顯微注射
[0025]收集單細(xì)胞時(shí)期的斑馬魚受精卵，將約2 μ I的載體溶液裝入微電極中，顯微注射到細(xì)胞漿中，每個(gè)胚胎約2nl，胚胎培養(yǎng)到性成熟。
[0026](4)轉(zhuǎn)基因斑馬魚的獲得
[0027]將轉(zhuǎn)基因斑馬魚與野生型雜交，通過重金屬鎘處理和熒光篩選，獲得具有穩(wěn)定綠色熒光表達(dá)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。之后提取胚胎的基因組DNA，用GFP的特異性引物來擴(kuò)增出對應(yīng)大小的片段進(jìn)行測序確認(rèn)。
[0028]實(shí)施例2 —轉(zhuǎn)基因斑馬魚環(huán)境監(jiān)測效果驗(yàn)證
[0029](I)配制含一系列濃度氯化鎘(Cd)的斑馬魚培養(yǎng)液
[0030]分別配制含10ug/L、100ug/L、1000ug/L Cd的斑馬魚培養(yǎng)液以及不含Cd的空白斑
馬魚培養(yǎng)液。
[0031](2)重金屬CM誘 導(dǎo)斑馬魚突光蛋白的表達(dá)
[0032]24hpf預(yù)培養(yǎng)后,斑馬魚胚胎置于含系列濃度CM的培養(yǎng)液中，5hpf后,突光顯微鏡下鏡檢，可驗(yàn)證胚胎隨Cd濃度的升高，表達(dá)出更強(qiáng)的綠色熒光。其他重金屬亦可誘導(dǎo)斑馬魚熒光蛋白的表達(dá)。
[0033](3) PCR 驗(yàn)證
[0034]提取經(jīng)Cd預(yù)處理后的胚胎DNA，PCR檢測其中GFP的表達(dá)情況，請參見圖1，可知，隨Cd濃度的提高，GFP表達(dá)量逐漸升高。即該轉(zhuǎn)基因斑馬魚可良好地檢測水環(huán)境中鎘離子的存在。在本實(shí)施例中只列舉了 Cd的數(shù)據(jù)，該轉(zhuǎn)基因斑馬魚同樣可檢測水環(huán)境中其他重金屬離子及多環(huán)芳烴的存在。
[0035]盡管本發(fā)明的實(shí)施方案已公開如上，但其并不僅僅限于說明書和實(shí)施方式中所列運(yùn)用，它完全可以被適用于各種適合本發(fā)明的領(lǐng)域，對于熟悉本領(lǐng)域的人員而言，可容易地實(shí)現(xiàn)另外的修改，因此在不背離權(quán)利要求及等同范圍所限定的一般概念下，本發(fā)明并不限于特定的細(xì)節(jié)和這里示出與描述的圖例。
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟(1)，從斑馬魚基因組中克隆Mdrl蛋白的啟動子調(diào)控序列； 步驟(2)，將步驟(1)中克隆的DNA片段融合于GFP編碼序列的上游，構(gòu)建成表達(dá)載體Mdrlpromoter-GFP ； 步驟(3),將所述表達(dá)載體Mdtlpromoter-GFP進(jìn)行斑馬魚胚胎顯微注射； 步驟(4)，將注射后的胚胎培養(yǎng)至性成熟，并與野生型斑馬魚交配產(chǎn)卵； 步驟(5)，熒光顯微鏡下篩選陽性的Fl代，繼續(xù)自交傳至F2代，得到穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因品系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，其特征在于，步驟(1)中克隆的DNA片段來源于Mdrl蛋白編碼基因的ATG起始密碼子5’端上游的280bp序列ο
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于檢測環(huán)境污染物的轉(zhuǎn)基因斑馬魚的制備方法，其特征在于，在步驟(3)中,所述表達(dá)載體Mdrlpromoter-GFP注入的時(shí)間點(diǎn)為斑馬魚受精卵單細(xì)胞時(shí)期。`
【文檔編號】C12N15/63GK103667327SQ201310654584
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月6日
【發(fā)明者】殷建, 林穎, 胡軍 申請人:中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所