一種治療2型糖尿病的aav載體及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種治療2型糖尿病的AAV載體及其制備方法和應(yīng)用。所述AAV載體是在pAAV-MCS載體的多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)間插入GLP-1基因即得，其中所述GLP-1基因的序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本發(fā)明所得AAV載體宿主范圍廣，免疫原性很低；該載體致病性低，安全性好，引起插入突變的概率很低。同時(shí)本發(fā)明所述AAV載體表達(dá)外源基因GLP-1的時(shí)間長(zhǎng)，表達(dá)穩(wěn)定性好，可以有效治療2型糖尿病，該AAV載體的生產(chǎn)工藝完善，可以通過(guò)大規(guī)模生產(chǎn)獲得。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種治療2型糖尿病的AAV載體及其制備方法和應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種治療2型糖尿病的AAV載體及其制備方 法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 2型糖尿病（Type 2diabeteS mellitus，T2DM)是一種高度異質(zhì)性的代謝紊亂綜 合征，其基本病理?yè)p害是在胰島素抵抗的基礎(chǔ)上又合并有胰島功能的明顯減退。2型糖尿病 具有外周胰島素抵抗、胰島β細(xì)胞的血糖依賴(lài)性胰島素分泌受損這兩個(gè)主要特征。在疾病 初期，患者可通過(guò)口服降糖藥控制血糖，但隨著病程的延長(zhǎng)，幾乎所有的2型糖尿病患者都 將需要聯(lián)合胰島素進(jìn)行治療，這是因?yàn)門(mén)2DM的這些病變會(huì)加重胰島β細(xì)胞的功能障礙，最 終會(huì)出現(xiàn)胰島β細(xì)胞的功能衰竭及數(shù)量減少，導(dǎo)致胰島素的分泌減少。因此，只有保護(hù)好 胰島β細(xì)胞才能從根本上減緩或阻止2型糖尿病的進(jìn)展。
[0003] 胰高血糖素樣肽-I (glucagon-like peptide-1，GLP-1)是一種由小腸 L細(xì)胞分 泌的腸促胰素（incretin)，其調(diào)節(jié)糖代謝的作用明確，而以它為基礎(chǔ)的相關(guān)制劑也已經(jīng)用 于臨床。GLP-1可以促進(jìn)葡萄糖濃度依賴(lài)性的胰島素分泌、促進(jìn)胰島素合成；抑制胰高血糖 素分泌；通過(guò)促進(jìn)胰島β細(xì)胞的分化及增殖、抑制其凋亡，而使胰島β細(xì)胞數(shù)量增多；通 過(guò)作用于攝食中樞產(chǎn)生飽脹感、作用于胃抑制胃排空，從而減少進(jìn)食量及減輕體重。此外， GLP-1還被認(rèn)為對(duì)心血管系統(tǒng)有保護(hù)作用。雖然胰高血糖素樣肽-1及其類(lèi)似物被廣泛的用 來(lái)研究治療2型糖尿病，但是該多肽在體內(nèi)血漿中的半衰期很短，每天必須注射兩次甚至 更多，這些弊端使GLP-1難以在臨床上被廣泛使用。盡管目前采用了許多努力來(lái)解決這個(gè) 技術(shù)難題，但是因?yàn)樘悄虿』颊咭唤?jīng)診斷后必須長(zhǎng)期持續(xù)給藥，并且終生接受治療，因此對(duì) 于該類(lèi)制劑的安全性、經(jīng)濟(jì)性和使用便利性的要求都是極其迫切的。
[0004] 其次，由于GLP-1多肽的序列大部分呈無(wú)規(guī)則卷曲構(gòu)象，極易受蛋白酶攻擊而被 降解，這個(gè)不穩(wěn)定在兩個(gè)方面都體現(xiàn)了弊端：1.在進(jìn)行重組表達(dá)GLP-1多肽時(shí)，無(wú)論是生產(chǎn) 成本低廉的酵母表達(dá)系統(tǒng)還是高昂的哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，分泌在培養(yǎng)上清中的GLP-1/ HSA融合蛋白易受蛋白酶降解，既導(dǎo)致表達(dá)量下降，也會(huì)產(chǎn)生很多不均一酶解產(chǎn)物而使得最 終產(chǎn)物不均一；2.該多肽注射進(jìn)入體內(nèi)后在體內(nèi)循環(huán)時(shí)也易受蛋白酶降解而失效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，針對(duì)目前GLP-1多肽類(lèi)制劑用藥頻率高，對(duì)2型糖 尿病患者來(lái)說(shuō)該制劑的應(yīng)用便利性差，患者的順應(yīng)性很低，而且使用經(jīng)濟(jì)成本較高的技術(shù) 問(wèn)題，提供了一種治療2型糖尿病的AAV載體及其制備方法和應(yīng)用
[0006] 因此，本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案之一為：一種治療2型糖尿病 的AAV載體，所述AAV載體是在pAAV-MCS載體的多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)間插入GLP-1基因 即得，其中所述GLP-1基因的序列如序列表中SEQ ID N0:1所示。
[0007] 本發(fā)明所述pAAV-MCS載體為本領(lǐng)域常規(guī)的腺相關(guān)病毒載體（adeno associated virus，AAV)，所述腺相關(guān)病毒是一類(lèi)微小、無(wú)被膜及具有二十面體結(jié)構(gòu)的細(xì)小單鏈DNA病 毒。該pAAV-MCS載體的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)市售可得。其中所述 pAAV-MCS載體的多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)為本領(lǐng)域常規(guī)的酶切位點(diǎn)，只要能將所述GLP-1基 因克隆到pAAV-MCS載體即可，所述酶切位點(diǎn)優(yōu)選地為限制性?xún)?nèi)切酶BamH I與Xbal的酶切 位點(diǎn)。
[0008] 其中所述GLP-1基因的序列較佳地是SEQ ID No: 1的同系物，該同系物可以使啟 動(dòng)子變體。在所述的核酸序列之前的啟動(dòng)子或信號(hào)序列可通過(guò)一個(gè)或多個(gè)核酸的替換、插 入或缺失而改變，但這些改變對(duì)啟動(dòng)子的功能沒(méi)有負(fù)面影響。而且通過(guò)改變啟動(dòng)子的序列 或甚至用來(lái)自不同種生物體的更有效的啟動(dòng)子完全替換，可提高目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。SEQ ID No: 1的同系物還包括一類(lèi)具有在標(biāo)準(zhǔn)條件下能夠與SEQ ID No: 1所示序列的多聚核 酸進(jìn)行雜交的堿基序列的多聚核酸，所述標(biāo)準(zhǔn)條件下進(jìn)行的雜交可根據(jù)《分子克隆》（Cold Spring Harbor Laboratory Press)記載的分子生物學(xué)中的通用方案（Current Protocols in Molecular Biology)所述的方式進(jìn)行。SEQ ID No:l的同系物較佳地為在所述SEQ ID No :1序列之前添加信號(hào)肽分子，所述信號(hào)肽分子的作用在于控制該SEQ ID No :1序列 在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)移和定位等功能，其中所述信號(hào)肽分子為本領(lǐng)域常規(guī)的信號(hào)肽分子，信號(hào)肽 分子的序列可以通過(guò)人工合成多肽序列或者分子克隆技術(shù)獲得，可根據(jù)《分子克隆》（Cold Spring Harbor Laboratory Press)記載的分子生物學(xué)中的通用方案所述的方式進(jìn)行。
[0009] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案之二為：一種包含如上所述AAV載體 的轉(zhuǎn)化體。
[0010] 本發(fā)明所述轉(zhuǎn)化體較佳地為將本發(fā)明的AAV載體轉(zhuǎn)化至相應(yīng)的宿主細(xì)胞中制得。 所述的宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細(xì)胞，只要能滿足AAV載體可穩(wěn)定地自行復(fù)制即可， 其中所述宿主細(xì)胞較佳地為真核細(xì)胞，更佳地為HEK293細(xì)胞，最佳地為傳代培養(yǎng)第5-40代 的HEK293細(xì)胞。所述HEK293細(xì)胞株的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)市售可 得。
[0011] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案之三為：一種包含治療2型糖尿病的 AAV載體的病毒顆粒的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：
[0012] (1)培養(yǎng)宿主細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%~90%融合，加入轉(zhuǎn)染試劑，加入權(quán)利要求 1所述AAV載體，pAAV2-RC載體和pHelper載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，35°C -38°C培養(yǎng)20~25小 時(shí)后換新鮮培養(yǎng)基，35°C _38°C培養(yǎng)60~74小時(shí)后，將所得培養(yǎng)液800~1200rpm離心8~ 10分鐘收集細(xì)胞；
[0013] (2)將步驟⑴收集的細(xì)胞反復(fù)凍融裂解，加入Dnase I和Rnase A，2500~ 3000rpm離心10~30分鐘收集上清液，將所得上清液加入脫氧膽酸，35°C -38°C水浴加熱 28~32min，離心20~40分鐘收集上清液；
[0014] (3)將步驟（2)所得上清液過(guò)層析柱進(jìn)行分離，利用鹽溶液洗脫層析柱，收集包含 病毒的洗脫液即得。
[0015] 其中步驟（1)為：培養(yǎng)宿主細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%~90%融合，加入轉(zhuǎn)染試劑， 加入權(quán)利要求1所述AAV載體，pAAV2-RC載體和pHelper載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，35°C -38°C 培養(yǎng)20~25小時(shí)后換新鮮培養(yǎng)基，35°C -38°C培養(yǎng)60~74小時(shí)后，將所得培養(yǎng)液800~ 1200rpm離心8~10分鐘收集細(xì)胞。其中所述宿主細(xì)胞為本領(lǐng)域常規(guī)的宿主細(xì)胞，較佳地 為真核細(xì)胞，更佳地為HEK293細(xì)胞，最佳地為傳代培養(yǎng)后第5-40代HEK293細(xì)胞。所述轉(zhuǎn) 染試劑為本領(lǐng)域常規(guī)的轉(zhuǎn)染試劑，只要能滿足將外源質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到宿主細(xì)胞中即可，較佳地 為聚乙烯亞胺試劑（也稱(chēng)為PEI試劑）。所述聚乙烯亞胺試劑的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制 備方法，或者市售可得。其中所述培養(yǎng)的時(shí)間為本領(lǐng)域常規(guī)的細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間，更佳地為72 小時(shí)。所述離心的速度更佳地為l〇〇〇rpm，所述離心的時(shí)間更佳地為10分鐘。所述AAV載 體、PAAV2-RC載體、pHelper載體的加入量較佳地為等質(zhì)量比例加入，所述三種質(zhì)粒的加入 量較佳地為5-10 μ g，加入質(zhì)粒后37°C水浴30min。當(dāng)所述三種質(zhì)粒的加入量和離心的速度 和離心的時(shí)間不在上述范圍值之內(nèi)時(shí)，會(huì)產(chǎn)生AAV病毒包裝效率低下，甚至無(wú)法包裝出AAV 病毒的現(xiàn)象發(fā)生。其中所述PAAV2-RC載體、pHelper載體為本領(lǐng)域常規(guī)的pAAV2-RC載體、 pHelper載體，所述載體的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò)市售可得。
[0016] 其中步驟⑵為：將步驟⑴收集的細(xì)胞反復(fù)凍融裂解，加入Dnase I和Rnase A，2500~3000rpm離心10~30分鐘收集上清液，將所得上清液加入脫氧膽酸，35°C -38°C 水浴加熱28~32min，離心20~40分鐘收集上清液。其中所述凍融裂解的次數(shù)較佳地為 3次，所述凍融裂解的方法較佳地為水浴加熱法。所述水浴加熱法的步驟較佳地為：將收 集的細(xì)胞_80°C過(guò)夜，37°C水浴加熱30min-lh，充分搖勻。其中所述離心的速度更佳地為 3000rpm，所述離心的時(shí)間更佳地為30分鐘。
[0017] 其中步驟（3)為：將步驟（2)所得上清液過(guò)層析柱進(jìn)行分離，利用鹽溶液洗脫層析 柱，收集包含病毒的洗脫液即得。其中所述層析柱為本領(lǐng)域常規(guī)的層析柱，只有能夠?qū)?AAV載體的病毒顆粒純化即可。所述層析柱的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)制備方法，或者通過(guò) 市售可得。其中所述鹽溶液為本領(lǐng)域常規(guī)的鹽溶液，較佳地為：洗脫雜質(zhì)的低鹽溶液〇. 15M NaCl溶液以及洗脫包含AAV載體的病毒顆粒的高鹽溶液0. 4M NaCl溶液，所述NaCl溶液中 較佳地還包含PBS溶液。所述鹽溶液洗脫層析柱的次數(shù)較佳地為1~3次。
[0018] 本發(fā)明所述AAV載體的制備方法較佳地還包括濃縮步驟，所述濃縮的方法為本領(lǐng) 域常規(guī)的濃縮方法，較佳地為用濃縮柱濃縮處理收集的包含病毒的洗脫液。其中所述濃縮 朱為本領(lǐng)域常規(guī)的濃縮柱，只要能夠濃縮所得包含AAV載體的病毒顆粒即可。所述濃縮柱 的制備方法為本領(lǐng)域常規(guī)的制備方法，或者通過(guò)市售可得。
[0019] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案之四為：一種如上所述AAV載體用于 制備抗2型糖尿病藥物中的用途。
[0020] 本發(fā)明所述抗2型糖尿病藥物為本領(lǐng)域常規(guī)的抗2型糖尿病藥物，更佳地為利用 本發(fā)明所述AAV載體將外源基因 GLP-1導(dǎo)入宿主細(xì)胞中并表達(dá)該基因的基因藥物。本發(fā)明 所述AAV載體安全性較高。本發(fā)明所述AAV載體能夠?qū)⑵鋽y帶的GLP-1基因?qū)胨拗骷?xì)胞 以糾正基因缺陷或者發(fā)揮治療作用，從而達(dá)到治療2型糖尿病的目的。
[0021] 本發(fā)明為解決上述技術(shù)問(wèn)題采取的技術(shù)方案之五為：一種藥物組合物，該藥物組 合物包括如上所述的AAV載體為活性成分和至少一種藥用載體。本發(fā)明所述藥用載體為本 領(lǐng)域常規(guī)藥用載體，較佳地為填充劑、稀釋劑或賦形劑等。
[0022] 在符合本領(lǐng)域常識(shí)的基礎(chǔ)上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各較佳實(shí) 例。
[0023] 本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。
[0024] 本發(fā)明的積極進(jìn)步效果在于：⑴宿主范圍比較廣，本發(fā)明所得AAV載體的受體 硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG)以及共受體ανβ 5整合素和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體 (FGFR1)在多種宿主細(xì)胞表面存在，這使得AAV載體能感染多種不同的組織和細(xì)胞，并能感 染分裂期和非分裂期細(xì)胞；（2)免疫原性低，本發(fā)明所得AAV載體不會(huì)像腺病毒載體那樣產(chǎn) 生強(qiáng)烈的Τ細(xì)胞反應(yīng)。雖然產(chǎn)生的體液免疫反應(yīng)也會(huì)導(dǎo)致病毒中和，但可以通過(guò)其它血清 型或者聯(lián)合免疫抑制治療加以解決；（3)非致病性，到目前為止未發(fā)現(xiàn)與人類(lèi)疾病有關(guān)的 AAV病毒感染，rAAV去除了所有的病毒基因，只保留兩端的ITR序列，進(jìn)一步提高了安全性； (4)本發(fā)明所得AAV載體己失去定點(diǎn)整合的能力，不再與宿主細(xì)胞基因組整合，不會(huì)因?yàn)椴?入突變?cè)斐稍┗虻幕罨?，引起插入突變的概率很低，具有較好的安全性；(5)本發(fā)明所 得AAV載體攜帶的外源基因表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)。盡管失去了野生型AAV病毒的整合能力，但能通 過(guò)形成首尾相接的環(huán)狀高分子量多聚體以染色體外的形式存在，這種結(jié)構(gòu)使得外源基因存 在的時(shí)間大大增加，表達(dá)時(shí)間較長(zhǎng)；(6)本發(fā)明所得AAV載體能夠有效緩解由2型糖尿病引 起的高血糖或者體重過(guò)高的癥狀，能夠有效治療2型糖尿病。（7)本發(fā)明所述AAV載體生產(chǎn) 工藝完善，可進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)，可以在人體細(xì)胞和昆蟲(chóng)細(xì)胞中大規(guī)模生產(chǎn)，并滿足臨床和市 場(chǎng)化需求。
【附圖說(shuō)明】
[0025] 圖1為pAAV-MCS的質(zhì)粒圖譜。
[0026] 圖2為RT-PCR檢測(cè)GAPDH基因結(jié)果圖。
[0027] 圖3為RT-PCR檢測(cè)GLP-1片段結(jié)果圖。
[0028] 圖4為各組小鼠血糖均值隨時(shí)間的變化結(jié)果圖。
[0029] 圖5為各組小鼠體重均值隨時(shí)間的變化結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面通過(guò)實(shí)施例的方式進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實(shí) 施例范圍之中。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商 品說(shuō)明書(shū)選擇。若無(wú)特別說(shuō)明，本發(fā)明所用的限制性?xún)?nèi)切酶或連接酶購(gòu)買(mǎi)自TAKARA公司， 所用的試劑購(gòu)買(mǎi)自sigma公司，為分析純?cè)噭?br>[0031] 實(shí)施例1制備含GLP-1基因的實(shí)驗(yàn)序列
[0032] 首先通過(guò)英濰捷基公司化學(xué)合成得到含GLP-1基因的核苷酸序列，該核苷酸序列 包含：141bp信號(hào)肽序列與96bp的GLP-1基因序列，在核苷酸序列的首尾分別加上6bp的酶 切位點(diǎn)序列（5' -TCTAGA ;以及GGATCC-3'）并在5'和3'端各自添加2bp的保護(hù)性堿基， 得到共253bp的核苷酸序列，該核苷酸序列如序列表中SEQ ID N0 :1所示。
[0033] 利用PCR方法擴(kuò)增并富集上述核苷酸序列，用于擴(kuò)增核苷酸序列的特異性引物分 別是：
[0034] GLP-1-5' ：5'-CGTCTAGAATGAAGATTATCCTGTGGC-3'（如序列表中 SEQ ID N0 :2 所 示）；
[0035] GLP-1-3' ：5' -ATGGATCCTTATCCTCGGCCTT-3'（如序列表中 SEQ ID N0 :3 所示）。
[0036] PCR反應(yīng)體系為：在50 μ 1的PCR反應(yīng)總體系中，以1 μ 1的上述化學(xué)合成的含有 GLP-1基因的核苷酸序列為模板，加入上述引物GLP-1-5'，GLP-1-3'各1 μ 1，dNTP 4 μ 1， 5 X緩沖液10 μ 1，Ex Taq酶（購(gòu)買(mǎi)自TAKARA) 1 μ 1，加入雙蒸水補(bǔ)足至總體系50 μ 1。
[0037] PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋海?)95°C預(yù)變性5分鐘；（2)94°C變性30秒，（3)52°C退火30 秒，（4)72°C延伸30秒，步驟⑵~（4)重復(fù)30個(gè)循環(huán)；（5)72°C延伸10分鐘，PCR程序結(jié) 束后，獲得GLP-1基因的核苷酸片段，并將所得核苷酸片段進(jìn)行純化處理（純化試劑盒購(gòu)買(mǎi) 自 Axygen，貨號(hào)為 AP-GX-50)。
[0038] 實(shí)施例2GLP-1基因的亞克隆
[0039] 將實(shí)施例1制備所得純化處理的GLP-1基因的核苷酸片段與pEasy blunt載體 (購(gòu)買(mǎi)自TransGen Biotech公司）進(jìn)行連接反應(yīng)，構(gòu)建出pEasy blunt-GLP-1載體。首先 將pEasy blunt載體利用BamH I與Xba I進(jìn)行一次雙酶切，再將實(shí)施例1獲取的純化后的 GLP-1基因的核苷酸片段也利用BamH I與Xba I進(jìn)行雙酶切處理，雙酶切的條件請(qǐng)參考該 限制性?xún)?nèi)切酶的使用說(shuō)明書(shū)。
[0040] 將雙酶切后所得pEasy blunt載體和GLP-1基因的核苷酸片段進(jìn)行連接反應(yīng)。 連接的體系及方法為：取雙酶切后的pEasy blunt載體1 μ 1，取雙酶切后的GLP-1基因的 核苷酸片段3 μ 1，Η20 1 μ 1，溶液I 5 μ 1，16°C反應(yīng)30分鐘。將所得連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿 菌DH5 α (大腸桿菌DH5 α購(gòu)買(mǎi)自TAKARA公司），并篩選重組質(zhì)粒，經(jīng)電泳鑒定無(wú)誤后送至 life technologies公司測(cè)序，序列測(cè)定后確定所得GLP-1基因的核苷酸片段序列完全正 確。
[0041] 實(shí)施例3pAAV-GLP-l載體的構(gòu)建
[0042] 使用限制性?xún)?nèi)切酶BamHI、Xba I雙酶切實(shí)施例2制備所得pEasy blunt-GLP-1載 體與pAAV-MCS載體（該載體購(gòu)買(mǎi)自life technologies公司），pAAV_MCS載體的質(zhì)粒圖譜 如圖1所示，圖1為pAAV-MCS的質(zhì)粒圖譜。酶切得到GLP-1基因的酶切片段GLP-UB/x)和 pAAV-MCS載體的酶切片段pAAV- (B/x)，將所得酶切產(chǎn)物GLP-1 (B/x)與pAAV- (B/x)純化處 理（所用的純化試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Axygen，貨號(hào)為AP-GX-50)，回收純化所得產(chǎn)物使用T4DNA連 接酶進(jìn)行連接，16°C連接4h至過(guò)夜，構(gòu)建得到pAAV-GLP-Ι載體。其中所述BamHI，Xbal雙 酶切體系如下所示：
[0043] lOXbuffcrH 緩沖液 2ul Jili 粒 4μ1 BamHi ΙμL Xbal ΙμL 四蒸水 12μΙ
[0044] 反應(yīng)條件：在37°C孵育4h。
[0045] 其中所述連接體系如下所示：
[0046] T4DNA連接酶 ΙμL 10 X Τ4 DNA連接酶緩沖液 2 5μ1
[0047] GLP-l(B/x) 10μ1 pAAV-(B/x) Ο 5μ1 四蒸水 11 μL
[0048] 反應(yīng)條件：在16 °C過(guò)夜。
[0049] 實(shí)施例4pAAV-GLP-l載體的病毒包裝
[0050] 將HEK293細(xì)胞作為包裝細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液、10 %新生牛血清傳代培養(yǎng)，細(xì)胞 生長(zhǎng)至85% -90 %融合，采用PEI(PEI試劑購(gòu)買(mǎi)自polyscience公司）轉(zhuǎn)染法將實(shí)施例3 構(gòu)建的 pAAV-GLP-Ι 及輔助質(zhì)粒 pAAV2-RC(pAAV2-RC 載體購(gòu)買(mǎi)自 life technologies 公 司）、pHelper(pHelper載體購(gòu)買(mǎi)自life technologies公司）三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì) 胞（HEK293細(xì)胞株購(gòu)買(mǎi)自中科院細(xì)胞資源庫(kù)），三質(zhì)?？偭? μ g/lml (其中AAV載體： PAAV2-RC載體：pHelper載體的加入量比例為1 :1 :1)轉(zhuǎn)染液PEI (lmol/L) 40 μ 1/皿 (10ml)，加 PBS至lml/皿（10ml)，混勻靜置10分鐘，即開(kāi)始轉(zhuǎn)染ΗΕΚ293細(xì)胞，2ml/皿，繼 續(xù)置二氧化碳培養(yǎng)箱5% C02、37°C、飽和濕度培養(yǎng)24小時(shí)，更換新鮮培養(yǎng)基，72小時(shí)收集細(xì) 胞放入-70°C冰箱凍存。接下來(lái)進(jìn)行純化，將凍存的細(xì)胞物從-70°C取出置37°C水浴箱中 30分鐘，反復(fù)凍融兩次后加入DNasel和RNaseA終濃度分別為0. lmg/ml，37°C水浴30分 鐘，離心3000RPM，30分鐘，移上清于新的50ml離心管中，加入脫氧膽酸至終濃度為0. 5%， 再置37°C水浴30分鐘，離心3000RPM (30分鐘），移上清于新的50ml離心管中，分別用5 μ m 和1. 2 μ m濾器過(guò)濾，獲得病毒粗提液。
[0051] 參照文獻(xiàn)（Hum Gene Ther. 2001 Jan 1，12(1) :71-6)，層析柱加入 20ml 肝素-瓊脂 糖后，用50ml 1XPBS平衡，將病毒粗提液過(guò)柱，用25ml 0. 15MNaCl(49ml lXPBS+lml 5M NaCl)洗柱兩次，再用15ml 0. 4M NaCl(46ml lXPBS+4ml 5M NaCl)洗脫病毒，將病毒液用 濃縮柱濃縮收集，置_80°C下備用。使用qPCR法檢測(cè)rAAV-GLP-1重組病毒的滴度（qPCR方 法請(qǐng)參考文獻(xiàn)：沈波，孟哲峰，彭穎，呂建新；熒光定量PCR用于重組桿狀病毒鑒定及病毒滴 度檢測(cè)的研究》中國(guó)免疫學(xué)雜志，Chinese Journal of Immunology, 2005年11期），所得 重組病毒的滴度為4X 1013。
[0052] 效果實(shí)施例1rAAV-GLP-l重組病毒對(duì)2型糖尿病模型小鼠（db/db小鼠）的治療 作用
[0053] 飼養(yǎng)18只雄性db/db小鼠（購(gòu)買(mǎi)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)）與6只雄性c57小 鼠（購(gòu)買(mǎi)自南京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物平臺(tái)），db/db小鼠按體重隨機(jī)分為3組，每組6只，c57小鼠 單獨(dú)一組，其中B組小鼠和C組小鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)第一天經(jīng)尾靜脈注射分別注射實(shí)施例4 制備所得rAAV-MCS病毒和rAAV-GLP-Ι病毒，小鼠的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中病毒僅于小鼠第一次接受 治療時(shí)注射一次，期間不進(jìn)行注射，并進(jìn)行為期3個(gè)月的療效觀察），分組情況為：
[0054] A組：db/db小鼠未治療組；
[0055] B組：db/db小鼠空載體病毒組（db/db小鼠），將rAAV-MCS病毒按病毒滴度 lX10nv. g/只經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)；
[0056] C組：pAAV-GLP-Ι病毒治療組（db/db小鼠），將rAAV-GLP-Ι病毒按病毒滴度 lX10nv. g/只經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)；
[0057] Η組：正常對(duì)照組（c57小鼠）。
[0058] 實(shí)驗(yàn)方法如下所述：治療開(kāi)始之前，將上述4組小鼠分籠飼養(yǎng)，分別測(cè)量小鼠的血 清胰島素水平（ELISA法，ELISA試劑盒購(gòu)買(mǎi)自Mercodia公司，商品號(hào)為22099)，正常飼養(yǎng) 小鼠一周后，將小鼠禁食。禁食12小時(shí)后檢測(cè)各組小鼠的血糖濃度（血糖濃度檢測(cè)試紙購(gòu) 買(mǎi)自Roche公司，商品號(hào)為05987270)，胰島素濃度，體重。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其對(duì)應(yīng)Abs450 值（液體樣品檢測(cè)450nm波長(zhǎng)入射光的吸光值）繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后計(jì)算出樣品中胰島 素濃度（μ g/L)。之后根據(jù)小鼠胰島素1 μ g = 14mU，將胰島素濃度換算成mU/L，然后按照 HOMA-IR = [FINS(mU/L) XFBG(mmol/L)]/22. 5 計(jì)算出胰島素抵抗指數(shù)。
[0059] 將檢測(cè)所得結(jié)果用"轉(zhuǎn)換后數(shù)據(jù)=lglO (原始數(shù)據(jù)）"進(jìn)行技術(shù)，將原始空腹血糖、 體重、胰島素抵抗指數(shù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果顯示，db/db小鼠胰島 素抵抗指數(shù)為16. 22~81. 77,正常C57小鼠胰島素抵抗指數(shù)為0. 96~2. 26,與正常C57 小鼠相比，db/db小鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著升高，符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)。所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果 表明，db/db小鼠表現(xiàn)出典型的2型糖尿病的臨床特征，該小鼠可以作為2型糖尿病的疾病 模型。
[0060] 對(duì)每組小鼠分別進(jìn)行治療，治療方法如上文所述：A組小鼠為注射空載體病毒組 對(duì)照組，將rAAV-MCS病毒按病毒滴度1 X 10nv. g/只經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)，整個(gè)治療期 間病毒的注射次數(shù)為1次。C組小鼠為pAAV-GLP-Ι病毒治療組，將rAAV-GLP-Ι病毒按病毒 滴度IX 10nV. g/只經(jīng)尾靜脈注射入小鼠體內(nèi)；整個(gè)治療期間只注射一次病毒。
[0061] 治療之后，飼養(yǎng)第7天將各組小鼠禁食，禁食12小時(shí)后測(cè)量各組小鼠的血糖濃度、 體重。治療之后每周重復(fù)上述禁食并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)時(shí)間為3個(gè)月。治療3個(gè)月 之后采集小鼠外周血，檢測(cè)小鼠的胰島素水平、血糖濃度，對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；同 時(shí)處死實(shí)驗(yàn)小鼠，采集小鼠的新鮮肝臟組織，利用AxyPrep總RNA小量制備試劑盒（RNA小 量制備試劑盒購(gòu)買(mǎi)自 AXYGEN，BI0SCIENCES)提取 RNA，使用 RNAPrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (該試劑盒購(gòu)買(mǎi)自TAKARA)，逆轉(zhuǎn)錄獲得小鼠的cDNA，分別用內(nèi)參基 因（GAPDH基因）引物（如序列表中SEQ ID N0 :4和SEQ ID N0 :5所示）和GLP-1引物（如 序列表中SEQ ID N0 :2和SEQ ID N0 :3所示）對(duì)所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)插入序列的 表達(dá)。其中所述PCR反應(yīng)體系為：
[0062] Prime STAR HS DNA Po丨ymerase (Mg2 plus)緩沖液 Ι.ΟμΙ dNTP Mixture 4μ1 引物(10μΜ) 各ΙμL 模板（cDNA) <200ng Primer STAR HS DINA Polymerase(2.5V4U) 0 5μ!
[0063] 其中所述PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?br>[0064] (1) 95 °C，10 分鐘，⑵ 95 °C，30 秒，（3) 55 °C，10 秒，⑷ 74 °C，20 秒，其中步驟 (2)_(4)重復(fù)30個(gè)循環(huán)，（5)74°C，10分鐘，（6)_4°C保藏。經(jīng)檢測(cè)，治療后各組小鼠的血糖 濃度、體重以及胰島素抵抗指數(shù)的檢測(cè)結(jié)果如圖4和圖5所示：圖4為各組小鼠血糖均值隨 時(shí)間的變化結(jié)果圖。從圖4結(jié)果可以看出：A、B、C、Η組小鼠經(jīng)過(guò)不同的處理后，隨時(shí)間推 移，和Α組相比，因?yàn)棣ЫM是正常小鼠，空腹血糖值一直明顯低于Α組；其中Α、Β、Η組小鼠 的空腹血糖值與治療前無(wú)明顯變化；而C組小鼠的空腹血糖值顯著下降（有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）， 所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果充分說(shuō)明，pAAV-GLP-Ι病毒治療組的db/db小鼠空腹血糖值顯著降低，該組 小鼠的2型糖尿病征狀得到了有效的緩解。
[0065] 圖5為各組小鼠體重均值隨時(shí)間的變化結(jié)果圖，其結(jié)果表明：A、B、C、H組小鼠經(jīng)過(guò) 不同的處理后，小鼠體重呈現(xiàn)了不同的變化趨勢(shì)，隨時(shí)間推移，和A組小鼠相比，因?yàn)棣ЫM是 正常小鼠，其體重一直明顯低于Α組；Α、Β、Η組無(wú)明顯變化；而C組（pAAV-GLP-Ι病毒治療 組）小鼠的體重有顯著降低（有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），因此根據(jù)圖5表示結(jié)果，本發(fā)明所述AAV載 體能夠有效治療2型糖尿病。
[0066] 治療后各組小鼠肝臟組織的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果如下所示：根據(jù)上文所述RT-PCR的 方法和引物，獲得治療后A、B、C、Η組小鼠肝臟的RT-PCR結(jié)果，從每個(gè)實(shí)驗(yàn)組中各取3個(gè)樣 本進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，其結(jié)果如圖2和圖3所示。其中圖2為RT-PCR方法檢測(cè)GAPDH基因 結(jié)果圖，圖3為RT-PCR檢測(cè)方法GLP-1片段結(jié)果圖。所得結(jié)果表明，GAPDH在各組都有條 帶，而GLP-1片段只在C組（AAV載體治療組）有條帶。GAPDH內(nèi)參基因在各組均有表達(dá)說(shuō) 明提取的樣本cDNA質(zhì)量可靠，GLP-1片段僅在C組有條帶說(shuō)明rAAV-GLP-Ι能攜帶其目的基 因在治療組的小鼠肝臟中表達(dá)外源基因 GLP-1。檢測(cè)結(jié)果表明：宿主感染后AAV病毒后，AAV 病毒不再自我復(fù)制，且自體穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白，目的蛋白的表達(dá)與表達(dá)量可以通過(guò)qPCR檢 測(cè)其逆轉(zhuǎn)錄cDNA的表達(dá)水平確定。
[0067] 應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種 改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種治療2型糖尿病的AAV載體，其特征在于，所述AAV載體是在pAAV-MCS載體的 多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)間插入GLP-1基因即得，其中所述GLP-1基因的序列如序列表中SEQ ID NO: 1 所示。2. 如權(quán)利要求1所述的AAV載體，其特征在于，所述多克隆位點(diǎn)的酶切位點(diǎn)為限制性?xún)?nèi) 切酶BamH I與Xbal的酶切位點(diǎn)。3. -種包含如權(quán)利要求1所述治療2型糖尿病的AAV載體的轉(zhuǎn)化體。4. 如權(quán)利要求3所述的轉(zhuǎn)化體，其特征在于，所述轉(zhuǎn)化體為HEK293細(xì)胞。5. -種包含治療2型糖尿病的AAV載體的病毒顆粒的制備方法，其特征在于，所述制備 方法包括以下步驟： (1) 培養(yǎng)宿主細(xì)胞，待細(xì)胞生長(zhǎng)至85%~90%融合，加入轉(zhuǎn)染試劑，加入權(quán)利要求1所 述AAV載體，pAAV2-RC載體和pHelper載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，37°C培養(yǎng)20~25小時(shí)后換新 鮮培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)60~74小時(shí)后將所得培養(yǎng)液，800~1200rpm離心8~12分鐘收集細(xì) 胞； (2) 將步驟（1)收集的細(xì)胞反復(fù)凍融裂解，加入Dnase I和Rnase A，2500~3000rpm 離心10~30分鐘收集上清液，將所得上清液加入脫氧膽酸，37°C水浴加熱28~32min，離 心20~40分鐘收集上清液； (3) 將步驟（2)所得上清液過(guò)層析柱進(jìn)行分離，利用鹽溶液洗脫層析柱，收集包含病毒 的洗脫液即得。6. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)所述宿主細(xì)胞為HEK293細(xì)胞， 所述轉(zhuǎn)染試劑為聚乙烯亞胺試劑，所述培養(yǎng)時(shí)間為72小時(shí)，所述離心的速度為lOOOrpm，所 述離心的時(shí)間為10分鐘，所述AAV載體，pAAV2-RC載體和pHelper載體的加入量為等質(zhì)量 比。7. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（2)所述離心的速度為3000rpm， 所述離心的時(shí)間為30分鐘。8. 如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)所述鹽溶液為0. 15M NaCl溶 液和0. 4M NaCl溶液。9. 一種如權(quán)利要求1或2所述AAV載體用于制備抗2型糖尿病藥物中的用途。10. -種藥物組合物，其特征在于，該藥物組合物包括如權(quán)利要求1或2所述的AAV載 體為活性成分和至少一種藥用載體。
【文檔編號(hào)】A61K38/26GK105985983SQ201510085320
【公開(kāi)日】2016年10月5日
【申請(qǐng)日】2015年2月16日
【發(fā)明人】楊樺, 林云濤, 譚孟群, 程笠人
【申請(qǐng)人】深圳市湘雅生物醫(yī)藥研究院