用于治療糖尿病的模式的組合的制作方法
【專利摘要】一種治療、預(yù)防或延遲1型糖尿病進展的方法，所述方法是通過施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原來實現(xiàn)，所述融合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。所述方法包括例如施用細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)聯(lián)抗原4(CTLA4)分子和1型糖尿病自身抗原。本發(fā)明還提供藥物組合物。
【專利說明】用于治療糖尿病的模式的組合 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明總體上涉及自身免疫疾病領(lǐng)域，并且尤其涉及使用CTLA4融合蛋白和1型 糖尿病自身抗原的組合來治療、預(yù)防或延遲1型糖尿病進展。

【背景技術(shù)】
[0002] 最常見形式的1型糖尿?。═1DM)是免疫介導(dǎo)的疾病，其中胰島素分泌0細胞遭 自身免疫應(yīng)答破壞。存在與疾病發(fā)作相關(guān)聯(lián)的許多遺傳和環(huán)境因素，所述疾病涉及含有特 異性靶向胰島素分泌0細胞的免疫細胞的胰島的逐漸炎性浸潤。這種病變在未確定的一 段時間（數(shù)月至數(shù)年）內(nèi)發(fā)展。雖然胰島素的發(fā)現(xiàn)允許治療T1DM，但是當前沒有治愈方法。 最常見形式的1型糖尿病是免疫介導(dǎo)的，其中胰島素產(chǎn)生0細胞遭破壞。然而，在診斷時， 大多數(shù)患者仍然具有可觀量的胰島素產(chǎn)生。殘留0細胞功能的保存是非常需要的，因為它 可減少疾病的短期和長期并發(fā)癥。
[0003] 已經(jīng)進行了數(shù)次臨床試驗來試圖用免疫調(diào)節(jié)劑或基于抗原的治療阻止1型糖尿 病的自身免疫性。最值得注意的是，抗CD3、抗CD20和GAD-65抗原疫苗的試驗已在保存3 細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。T細胞在與1型糖尿病相關(guān)聯(lián)的 自身免疫性方面發(fā)揮核心作用。
[0004] 不完全弗氏佐劑（IFA)中如胰島素B鏈的自身抗原的再引入也已預(yù)期可治療或 延遲1型糖尿病的進展。這已經(jīng)在糖尿病的動物模型（N0D小鼠）中有所研究（Muir等人 (1995)JClinInvest95:628-634 ;0rban等人（1999)Diabetes48 增刊 1:A216-A217; Ramiya等人（1996)JAutoimmun9:349-356);美國專利公布 2006/0183670 和美國專利 公布2009/0142308,并且在人中有所研究。Orban等人，JAutoimmun. (2010年6月）； 34(4) : 408-15。
[0005] 然而，需要1型糖尿病的另外的新療法，它們能夠停止或減慢自身免疫P細胞破 壞，因而預(yù)防患上1型糖尿病，或至少延長疾病發(fā)作達盡可能長的一段時間。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 根據(jù)本發(fā)明的某些實施方案涉及治療受試者的糖尿病的方法，所述方法包括向受 試者施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原，所述融合蛋白組合物 包含：T細胞共刺激拮抗劑，例如CTLA4的細胞外結(jié)構(gòu)域、細胞外結(jié)構(gòu)域的有效片段或細胞 外結(jié)構(gòu)域的免疫活性變體；和免疫球蛋白分子的一部分，所述1型糖尿病自身抗原例如前 胰島素原、GAD65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂或其免疫活性片 段或其變體。在一些實施方案中，前胰島素原片段是胰島素B鏈或其免疫活性片段或其變 體，如SEQIDNO: 1的氨基酸33-47 (即，B鏈29 - 23)
[0007] 在一些實施方案中，受試者患有殘留有0細胞功能的1型糖尿病。在一些實施方 案中，T細胞共刺激拮抗劑結(jié)合B細胞和/或抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7(CD80/86)抗 原。在其它實施方案中，B7抗原在B細胞和APC上表達。
[0008] 在一些實施方案中，所述方法有效預(yù)防糖尿病的發(fā)作。在其它實施方案中，所述方 法有效延遲糖尿病的發(fā)作至少例如3個月、6個月、9個月、1年、1. 5年、2年、3年或更長。 在一些實施方案中，所述方法進一步包括確定隨著時間推移在從受試者獲取的血液樣品中 C肽的水平，所述水平是作為治療有效性的指示物。
[0009] 在本發(fā)明的其它實施方案中，提供藥物組合物，其包含：(a)細胞毒性T淋巴細胞 相關(guān)聯(lián)抗原4 (CTLA4)融合蛋白，（b)選自由以下組成的組的自身抗原：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂或其免疫活性片段或其變體，以 及（c)藥學(xué)上可接受的載體。
[0010] 在一些實施方案中，藥物組合物在油基載體提供，如在IFA或MontnideISA中提 供。在一些實施方案中，藥物組合物包含約250mg至約2000mg的融合蛋白和約0. 5mg至約 l〇mg的1型糖尿病自身抗原。
[0011] 本發(fā)明闡明并描述了如將會顯而易知的實施方案的這些和其它特征。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012] 下文參考例如后附的附圖來提供各種實施方案的詳述。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解 的是，以下所描述的附圖僅是出于說明的目的。附圖不意圖以任何方式限制 申請人:教導(dǎo)的 范圍。
[0013] 圖1是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-hAUC平均值的群體平均值。估計 值來自針對年齡、性別、c肽的基線值和治療分配來調(diào)整的ANC0VA模型。Y軸是在log(y+l) 標度上。誤差條展示95%Cl。AUC=曲線下面積。
[0014] 圖2是每個治療組的隨著時間推移的刺激C肽2-hAUC平均值的預(yù)測群體平均值。 估計值來自混合效果模型的分析，所述模型針對年齡、性別、C肽的基線值和治療分配來調(diào) 整，并且包括在l〇g(y+l)標度上作為直線的時間的固定效果。AUC=曲線下面積。
[0015] 圖3是每個治療組的隨著時間推移的2-h峰C肽保持等于或高于0 ? 2nmol/L的 參與者的比例。
[0016] 圖4A和圖4B是每個治療組的隨著時間推移的（A)HbAlc和⑶胰島素使用的群 體平均值。估計值來自針對年齡、性別、HbAlc的基線值和治療分配來調(diào)整的ANC0VA模型。 胰島素使用是按3個月時間間隔以每kg體重來使用。誤差條展示95%Cl。HbAlc是糖基 化血紅蛋白Ale。
[0017] 圖5是在預(yù)先指定的基線因子類別內(nèi)對于2年刺激C肽AUC平均值的治療效果的 比率（阿巴西普相比于安慰劑）。估計值來自針對年齡、性別、C肽的基線值、所指示的分類 因子、治療分配和治療相互作用項來調(diào)整的C肽的ANC0VA建模對數(shù)。治療效果的同質(zhì)性測 試對于DR3等位基因狀態(tài)（p= 0 *025)和種族（p= 0 *0003)是顯著的。AUC=曲線下面 積。HbAlc=糖基化血紅蛋白Ale。
[0018] 應(yīng)了解，附圖只是示例性的并且對附圖的所有參考只出于說明目的，并且不希望 以任何方式限制以下本文描述的實施方案的范圍。

【具體實施方式】
[0019] 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在IFA中CTLA4分子和胰島素B鏈的組合可用于治療、預(yù)防或延遲受試 者的1型糖尿病的進展。
[0020] 殘留3細胞功能（如通過峰C肽彡0*2nmol/L所測量）的保存是非常需要的， 因為它可減少疾病的短期和長期并發(fā)癥。已經(jīng)進行了數(shù)次臨床試驗來試圖用免疫調(diào)節(jié)劑或 基于抗原的治療阻止1型糖尿病中的自身免疫性。最顯著地，抗⑶3、抗⑶20和GAD-65抗 原疫苗的試驗已在保存0細胞功能方面展示一些功效，如由刺激C肽分泌得以證明。C肽 是在體內(nèi)與胰島素一起產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在健康胰腺中，前胰島素原與A鏈、C肽、B鏈和信號 序列一起分泌。將信號序列截止，留下胰島素原。然后C肽被切斷，留下A鏈和B鏈以形成 胰島素。由于C肽和胰島素以等摩爾量存在，因此它是胰島素產(chǎn)生和胰腺0細胞健康的非 ?？煽繕擞浳?。
[0021] T細胞在與1型糖尿病相關(guān)聯(lián)的自身免疫性中發(fā)揮核心作用。為了變得完全活化 并且具有自身攻擊性，據(jù)信T細胞需要至少兩個關(guān)鍵信號。（Marelli-BergFM，0kkenhaug K，MirendaV.ATrendsImmunol2007;28:267-73。）第一信號是抗原呈遞細胞上的MHC分 子的凹槽中的抗原與T細胞受體（TCR)之間的相互作用。最重要的第二信號是抗原呈遞細 胞（APC)上的⑶80和⑶86與T細胞上的⑶28之間的相互作用。這種共刺激第二信號是細 胞的完全活化所需要的，并且沒有它T細胞不會變得具有功能性。因此，已提出將共刺激阻 斷作為自身免疫性和移植的治療手段。（BluestoneJA，StClairEW，TurkaLA.Immunity 2006;24:233-38。）
[0022] 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)聯(lián)抗原4 (CTLA4)，也稱為⑶152,是涉及免疫系統(tǒng)的調(diào)控 的蛋白質(zhì)。天然存在的CTLA4描述于美國專利號5, 434, 131、5, 844, 095和5, 851，795中。 天然CTLA4蛋白質(zhì)由CTLA4基因編碼。CTLA4是細胞表面蛋白，其具有N端細胞外結(jié)構(gòu)域、 跨膜結(jié)構(gòu)域和C端胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。細胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合至且/或干擾靶抗原，如CD80和CD86， 充當性質(zhì)T細胞刺激的天然破壞。在一些實施方案中，CTLA4分子的細胞外結(jié)構(gòu)域開始于 位置+1處的甲硫氨酸并且結(jié)束于位置+124處的天冬氨酸；在其它實施方案中，細胞外結(jié)構(gòu) 域開始于位置-1處的丙氨酸并且結(jié)束于位置+124處的天冬氨酸。
[0023]CTLA4分子是包括細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)聯(lián)抗原4(CTLA4)細胞外結(jié)構(gòu)域的分 子。在一些實施方案中，CTLA4的細胞外結(jié)構(gòu)域包括CTLA4蛋白質(zhì)的一部分，所述部分識別 并結(jié)合至至少一種B7(⑶80/86)抗原，如B細胞和抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7抗原。 B細胞和APC可被活化。細胞外結(jié)構(gòu)域還可包括CTLA4的結(jié)合B7抗原的片段或衍生物。 CTLA4細胞外結(jié)構(gòu)域還可識別并結(jié)合⑶80和/或⑶86。細胞外結(jié)構(gòu)域還可包括CTLA4的 結(jié)合CD80和/或CD86的片段或衍生物。
[0024]CTLA4分子可為融合蛋白，其中融合蛋白定義為使用本領(lǐng)域中熟知的方法連接在 一起的一個或多個氨基酸序列。連接的氨基酸序列從而形成一種融合蛋白。在一些實施方 案中，CTLA4分子含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的Fc部分。在一些實施方 案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0025] 在一些實施方案中，CTLA4分子是含有免疫球蛋白的至少一部分，如免疫球蛋白的 Fc部分的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，CTLA4分子是分離和純化的CTLA4分子。
[0026] 在一些優(yōu)選實施方案中，CTLA4分子是阿巴西普。阿巴西普是可溶性融合蛋白，其 由連接至人免疫球蛋白G1 (IgGl)的修飾Fc(鉸鏈、CH2和CH3結(jié)構(gòu)域）部分的人CTLA-4的 細胞外結(jié)構(gòu)域組成。阿巴西普通過重組DNA技術(shù)在哺乳動物細胞表達系統(tǒng)中產(chǎn)生。阿巴西 普的表觀分子量是92千道爾頓。
[0027] 阿巴西普被開發(fā)用于成人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎，并且被指出可用 于減少病征和癥狀、誘導(dǎo)主要臨床反應(yīng)、抑制結(jié)構(gòu)破壞的進展，并且改善患有中度至重度活 動性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的成人患者的身體功能。
[0028] 阿巴西普由Bristol-MyersSquibb開發(fā)并且公開于例如美國專利5, 851，795、美 國專利7, 455, 835和美國專利公布20011/311529中。阿巴西普的商品名為Orencia，它可用 作單一療法，或與不同于腫瘤壞死因子（TNF)拮抗劑的疾病緩解抗風(fēng)濕性藥物（DMARD)同 時使用。阿巴西普還被指示可用于減少患有中度至重度活動性多關(guān)節(jié)幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎的 6歲和年齡更大的兒科患者的病征和癥狀。阿巴西普可用作單一療法或與甲氨蝶呤（MTX) 同時使用。由于阿巴西普是選擇性共刺激調(diào)節(jié)劑并且抑制T細胞的共刺激，它不應(yīng)與TNF 拮抗劑同時施用。
[0029] 阿巴西普選擇性結(jié)合至⑶80和⑶86,從而阻斷與⑶28的相互作用并且干擾T細 胞活化。它抑制初始T細胞活化，因而具有選擇性抑制特定抗原的T細胞應(yīng)答的潛力而非 廣泛免疫抑制。效應(yīng)記憶T細胞應(yīng)答較少取決于CD28共刺激并且據(jù)推測較少通過共刺激 阻斷來抑制。（LoDJ,WeaverTA，StemporaL,等人AmJTransplant2011 ;11:22_ 33。）
[0030] 動物和人類中的研究已經(jīng)展示共刺激第二信號的干擾有利地影響自身免疫性。使 用阿巴西普的共刺激阻斷已被證明在牛皮癬（AbramsJR,LebwohlMG,GuzzoCA,等人J ClinInvest1999;103:1243 - 52)和牛皮癬性關(guān)節(jié)炎（MeaseP,GenoveseMC,Gladstein G,等人ArthritisRheum2011;63:939 - 48)中具有臨床有效性，并且被批準用于治療包 括幼年類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，GenantHK，PeterfyCG，WesthovensR,等人 AnnRheumDis2008;67:1084 - 89)。（RupertoN,LovellDJ，QuartierP,等人Lancet 2008;372:383 - 91。）另外，共刺激阻斷可有效控制同種異體移植物排斥。（Vincenti F，LarsenC，Dur;rbachA.NEnglJMed2〇〇5;353:77〇_ 81。）此外，Lenschow和同事 (LenschowDJ，HoSC，SattarH,等人JExpMed1995;181:1145_55)證明使用抗137-2單 克隆抗體和CTLA4 -免疫球蛋白融合蛋白兩者的共刺激阻斷可在10周齡之前施用時預(yù)防 N0D小鼠模型的糖尿病。
[0031] 現(xiàn)在已經(jīng)展示使用如CTLA-4組合物并且尤其阿巴西普的T細胞共刺激拮抗劑 的共刺激調(diào)節(jié)可通過阻斷自身攻擊性T細胞的產(chǎn)生來在新近診斷患有1型糖尿病的患者 中阻止或減緩自身免疫性0細胞破壞，導(dǎo)致保持C肽分泌（Orban等人，Lancet2011 ; 378(9789):412-9。）
[0032] 存在許多被認為在人1型糖尿病中是至關(guān)重要的自身抗原。一些數(shù)據(jù)表明胰 島素是在疾病的發(fā)病機理中起作用的主要抗原（Muir等人（1993)DiabetesMetab.Rev 9:279-287)。胰島素是一種0細胞特異性主要蛋白質(zhì)，它在單獨使用時適度地具有免疫 原性，并且在先導(dǎo)人試驗中展示具有延遲糖尿病發(fā)展的效應(yīng)（Keller等人（1993)Lancet 341:927-928)。然而，它必須長時間地每日注射以誘導(dǎo)所需效應(yīng)。當胰島素在人中使用時， 總是存在關(guān)于低血糖和它的后果的主要問題。
[0033] 缺乏低血糖效應(yīng)的胰島素或前胰島素原的免疫原性片段或變體是對人使用的安 全選擇。舉例來說，胰島素B鏈（或其沒有代謝作用的免疫原性片段和變體）可在人的1 型糖尿病臨床發(fā)作之后，用作預(yù)防或延遲功能性、殘留0細胞團塊進一步損失的免疫調(diào)節(jié) 齊U，而沒有低血糖作用。在人受試者中再引入自身抗原，例如，胰島素B鏈可起作用以改變 至觸發(fā)保護性免疫響應(yīng)的自身免疫過程。Thl/Th2平衡可變化以利于保護性Th2類型細胞 反應(yīng)，并產(chǎn)生調(diào)控性免疫細胞Tregs。
[0034] 針對胰島素、谷氨酸脫羧酶（GAD)和其它胰島細胞自身抗原，例如，ICA512/1-2 蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶ICA12、ICA69的自身抗體常常發(fā)現(xiàn)于新診斷糖尿病患者中。因此，適 用于本發(fā)明方法的1型糖尿病自身抗原包含，例如，前胰島素原或其免疫活性片段（例如， 前胰島素原片段、胰島素B鏈、A鏈、C肽或其免疫活性片段），和其它胰島細胞自身抗原 (ICA)，例如，GAD65、胰島酪氨酸磷酸酶ICA512/IA-2、ICA12、ICA69或其免疫活性片段。其 它1型糖尿病自身抗原包括HSP60、羧肽酶H、外周蛋白、神經(jīng)節(jié)苷脂（例如，GM1-2、GM3)或 其免疫活性片段。本文描述的任何1型糖尿病自身抗原，或其免疫活性片段、類似物或衍生 物適用于本發(fā)明方法和組合物。
[0035] 胰島素mRN被翻譯為稱為前胰島素原的110氨基酸單鏈前體，并且在插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 期間移除它的信號肽產(chǎn)生胰島素原。胰島素原由三個結(jié)構(gòu)域組成：氨基末端B鏈、羧基末端 A鏈和在中間被稱為C肽的連接肽。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，胰島素原暴露多個特定內(nèi)肽酶，其切除C 肽，從而產(chǎn)生由A鏈和B鏈組成的成熟形式的胰島素。胰島素和自由C肽在高爾基體中包 裝成在細胞質(zhì)中積聚的分泌顆粒。前胰島素原肽序列發(fā)現(xiàn)于SEQIDN0 :1中。
[0036] 胰島素鏈包含SEQIDNO: 1的氨基酸90-110。B鏈包含SEQIDNO: 1的氨基酸 25-54。連接序列（SEQIDN0 :1的氨基酸55-89)包含任一末端的一對堿性氨基酸。在這 些雙堿基序列處的胰島素原的蛋白裂解釋放胰島素分子和游離C肽，其包括SEQIDN0:1 的氨基酸57-87。人前胰島素原或其免疫活性片段，例如，B鏈或免疫原性片段其，例如，SEQ IDNO: 1的氨基酸33-47 (對應(yīng)于B鏈的殘基9-23)或信號肽序列或前胰島素原的其它序列 在本文所述的方法和組合物中適用作自身抗原。
[0037]Gd65是涉及導(dǎo)致胰島素依賴性糖尿病的自身免疫響應(yīng)的主要3細胞抗原 (Christgau等人（1991)JBiol.Chem. 266 (31): 21257-64)。GAD65 的自身抗體的存在被用 作1型糖尿病的診斷法。Gad65是SEQIDN0:2的585氨基酸蛋白質(zhì)。反映施用效果的自 體抗體滴度和GAD65AB同種型的變化可用于表征糖尿病或糖尿病前期患者的自身免疫過 程的消退。另外，與自身抗原施用的效果關(guān)聯(lián)的刺激細胞因子特征（有利于Th2-細胞）存 在變化，其稍后可用作1型糖尿病的自身免疫性消退的體液標記物。
[0038]IA-2/ICA512,蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶家族的成員，是1型糖尿病的另一個主要自 身抗原（Lan等人DNACellBiol13:505-514,1994)。70%糖尿病患者具有IA-2的自 身抗體，其在患上臨床疾病之前數(shù)年出現(xiàn)。IA-2分子（SEQIDN0:3,如下）是979個 氨基酸長度并且由細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和細胞外結(jié)構(gòu)域組成（Rabin等人（1994) J.Immunol. 152(6)，3183-3188)。自身抗體通常針對細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，例如，SEQIDN0:3的氨 基酸 600-979 及其片段（Zhang等人（1997)Diabetes46:40-43;Xie等人（1997)JImmunol 159:3662-3667)。IA-2 的氨基酸序列展示于SEQIDNO:3。
[0039]ICA12(Kasimiotis等人（2000)Diabetes49(4):555-61;Genbank登陸號 AAD16237;SEQIDN0:4)是與糖尿病相關(guān)聯(lián)的許多胰島細胞自身抗原之一。ICA12的序列 提供為SEQIDN0 :4。
[0040]ICA69是與1型糖尿病相關(guān)聯(lián)的另一個自身抗原（Pietropaolo等人JClinInvest 1993 ;92:359-371)。ICA69 的氨基酸序列提供為SEQIDNO:5。
[0041]Glim38是38kDa胰島細胞膜自身抗原，其尤其與來自糖尿病前期個體和新診斷1 型糖尿病患者的子集的血清一起免疫沉淀。Glim38是兩親性膜糖蛋白，尤其表達于胰島 和神經(jīng)元細胞系中，因而共有GAD65和IA2的神經(jīng)內(nèi)分泌表達模式（Aanstoot等人JClin Invest.June15, 1996 ;97 (12):2772-2783)。
[0042]HSP60,例如，HSP60的免疫活性片段，例如，p277(參見Elias等人，EurJImmunol 199525(10) :2851-7)，也可在本文所述的方法和組合物中用作自身抗原。HSP60的其它適 用表位描述于例如美國專利號6, 110, 746中。
[0043] 羧肽酶H例如在前1型糖尿病患者中被識別為自身抗原（Castano等人（1991) JClinEndocrinolMetab. 73 (6) : 1197-201;Alcalde等人JAutoimmun. 1996 年 8 月； 9 (4) : 525-8.)。因此，羧肽酶H或其免疫反應(yīng)性片段（例如，在Castano同上文中描述的羧 肽酶-H的136氨基酸片段）可用于本文所述的方法和組合物中。
[0044] 外周蛋白是在nod小鼠中識別的58KDa糖尿病自身抗原（Boitard等人（1992) ProcNatl.Acad.Sci.USA89(1): 172-6。人外周蛋白序列展示為SEQIDN0:6。
[0045] 神經(jīng)節(jié)苷脂也可為本文所述的方法和組合物中的適用自身抗原。神經(jīng)節(jié)苷脂是含 有唾液酸的糖脂，其由疏水性部分、神經(jīng)酰胺和親水性部分，即寡糖鏈形成。神經(jīng)節(jié)苷脂尤 其表達于胰島的分泌顆粒的細胞溶質(zhì)膜中。神經(jīng)節(jié)苷脂的自身抗體描述于1型糖尿病中， 例如，GM1-2神經(jīng)節(jié)苷脂是糖尿病自身免疫性中的胰島自身抗原并且由人原生0細胞表 達（Dotta等人Diabetes.S印tember1996 ;45 (9) : 1193-6)。神經(jīng)節(jié)苷脂GT3、⑶3 和GM-1 也是與自身免疫糖尿病相關(guān)聯(lián)的自身抗體的祀標（綜述于Dionisi等人Ann1stSuper Sanita1997;33(3):433-5)。神經(jīng)節(jié)苷脂GM3參與胰島素抵抗的病理狀態(tài)（Tagami等人J BiolChemNov. 13, 2001 ;在印刷前在線發(fā)布）。
[0046] 胰島素B鏈是優(yōu)選糖尿病自身抗原。人疫苗使用的人胰島素B鏈可通過標準固相 肽合成來制成。本文描述有效溶解胰島素0鏈的程序。在一些實施方案中，自身抗原是人 胰島素B鏈（SEQIDNO: 1的氨基酸25-54)或其免疫活性片段或其變體。在一些實施方案 中，B鏈或其片段未重組。舉例來說，B鏈或其免疫原性片段或其變體是合成肽，例如，B鏈通 過固相合成制成。在一些優(yōu)選實施方案中，B鏈溶解于尿素中。在一些實施方案中，人胰島 素B鏈變性，例如，溶解于尿素和DTT中。在一個優(yōu)選實施方案中，人胰島素B鏈在30-70 % 之間，優(yōu)選地40-60 %之間，更優(yōu)選地45-55 %重量比例（w/w)之間。
[0047] 因此，本文提供通過施用CTLA4和1型糖尿病自身抗原來治療、預(yù)防或延緩糖尿病 進展的方法。兩個組分可同時、順序地或以單獨時程施用（例如，一個在早晨和另一個在傍 晚或以相對于彼此的其它不同時程）。
[0048]T1DM的發(fā)作可通過如本文描述的方法來延遲，以使得受試者不需要胰島素歷時更 長時間。替代地或另外地，本發(fā)明方法可在已患糖尿病受試者中延長"蜜月期"。蜜月期是 其中胰島素由胰腺分泌，從而引起高血糖水平減退，并且由于胰島素注射和治療的反應(yīng)而 產(chǎn)生正?；蚪咏Ｆ咸烟撬降臅r期。
[0049] 可在受試者中通過首先選擇易患糖尿病的受試者并施用如本文描述的CTLA4分 子和1型糖尿病自身抗原來預(yù)防T1DM。易患糖尿病的受試者可通過GAD65自身抗體（GAA)、 ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的一個或多個的表達來選 擇。這些自身抗體中的每一種與進展至自身免疫性1型糖尿病的風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。GAD65自 身抗體（GAA)、ICA512自身抗體（ICA512AA)或抗胰島素自身抗體（IAA)中的兩個或更多 個的表達與進展至自身免疫性1型糖尿病的高風(fēng)險相關(guān)聯(lián)。（LipingYu等人，Diabetes August2001vol. 50no. 8 1735-1740;VergeCF等人，Diabetes45:926 - 933, 199;Verge CF.等人，Diabetes47:1857 - 1866, 1998;和BingleyPJ,等人，Diabetes43:1304 -1310, 1994)。
[0050] T1DM也可通過如本文所述的方法來治療。治療可針對具有殘留0細胞功能的受 試者以及不再具有任何3細胞功能的受試者。治療還被可建議來用于經(jīng)由移植或注射或 其它0細胞替換手段（如胚胎或其它干細胞療法或其它替換手段）提供外源性0細胞的 受試者。
[0051]CTLA4分子和如本文描述的T1DM自身抗原的組合可作為一種或多種藥物組合物 的一部分來施用。本發(fā)明方法可預(yù)防糖尿病，或預(yù)防或延遲殘留0細胞團塊的損失，提供 減少短期并發(fā)癥的更長緩解期并且在生命后期延緩糖尿病相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)作。
[0052]CTLA4分子和T1DM自身抗原可組合成單一藥物組合物?；蛘撸珻TLA4分子在一個 藥物組合物中提供并且T1DM自身抗原在單獨藥物組合物中提供。在這個替代方案中，兩個 藥物組合物可具有相同或不同施用模式和施用時程。
[0053] 如本發(fā)明提供的藥物組合物可包括藥學(xué)上可接受的載體。術(shù)語"藥學(xué)上可 接受的載體"根據(jù)所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒介物、分 散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑等。 Remington'sPharmaceutical-Sciences,第 16 版,E.ff.Martin(MackPublishing Co. ,Easton,Pa. , 1980)公開用于配制藥物組合物的各種載體和其已知制備技術(shù)。除了如通 過產(chǎn)生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互作 用而與物質(zhì)或其衍生物不相容的任何常規(guī)載體介質(zhì)以外，所述載體的使用被涵蓋在本發(fā)明 的范圍內(nèi)?？沙洚斔帉W(xué)上可接受的載體的材料的一些實例是糖諸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀 粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基纖維素和乙酸 纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油，如花生油、棉籽 油、紅花油、芝麻油、橄欖油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙 酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林格氏溶液；乙 醇，和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它無毒相容潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，以及著色 齊U、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根據(jù)配方配制人員的 判斷而存在于組合物中。
[0054] 包括藥學(xué)上可接受的載體的本文描述的化合物可使用多種途徑或施用模式來遞 送至患者。適合施用途徑包括但不限于吸入、經(jīng)皮、口服、直腸、經(jīng)粘膜、腸道和腸胃外施用， 包括肌肉內(nèi)、皮下和靜脈內(nèi)注射。
[0055] 如本文描述的組合物可與佐劑一起施用。術(shù)語"佐劑"可為單獨施用時缺乏顯著 活性但是可增強另一種治療劑的活性的化合物。在一些實施方案中，佐劑選自由以下組成 的組：緩沖劑、抗微生物防腐劑、表面活性劑、抗氧化劑、滋養(yǎng)調(diào)節(jié)劑、抗菌劑、增稠劑和粘度 改良劑。在一些實施方案中，佐劑是IFA，或其它油基佐劑以30-70%之間，優(yōu)選地40-60% 之間，更優(yōu)選地45-55%之間的重量比例（w/w)存在。在一些實施方案中，人胰島素B鏈和 IFA或其它油基佐劑以約50/50重量比率存在。在一些實施方案中，藥物組合物不含污染 物，例如，熱原。
[0056] 在一些實施方案中，將自身抗原凍干。在另一方面，本發(fā)明提供含有通過以下方法 制成的T1DM自身抗原的藥物組合物：將T1DM自身抗原與油基載體，例如，油基佐劑，例如， IFA，或其它油基佐劑，例如，MontanideISA(例如，MontanideISA51)組合，并且將胰島素 B鏈和油基佐劑乳化。在一些實施方案中，T1DM自身抗原是人胰島素B鏈或前胰島素原或 其免疫活性片段或其變體，其與油基載體組合，其中將胰島素B鏈和油基佐劑乳化。在一個 優(yōu)選實施方案中，人胰島素0鏈和油基佐劑以30/70至70/30之間的重量比率（w/w)組合， 優(yōu)選地40/60至60/40之間，優(yōu)選地45/55至55/45之間，更優(yōu)選地約50/50w/w比率。在 一個優(yōu)選實施方案中，乳化用高壓力注射器執(zhí)行。在優(yōu)選實施方案中，油基載體或佐劑和優(yōu) 選地組合物不包括細菌組分，例如，分枝桿菌組分。
[0057] 在一些實施方案中，T1DM自身抗原是B鏈或前胰島素原或其免疫原性活性片段或 其變體，并且溶解于約3M至8M尿素，優(yōu)選地約3. 5M至7M尿素，或約4M至6M尿素。在一 個優(yōu)選實施方案中，B鏈或其免疫原性活性片段或其變體溶解于約3M至5M尿素，優(yōu)選地約 3. 5M至4. 5M尿素，最優(yōu)選地約4M尿素。在一個優(yōu)選實施方案中，0鏈或其免疫原性活性 片段或其變體溶解于5-8M尿素，優(yōu)選地約6M至7M尿素。優(yōu)選地，B鏈在還原劑存在下溶 解，例如，DTT或等效還原劑，例如，在溶解步驟期間添加lmg至5mgDTT。
[0058] 在一些實施方案中，包含1型糖尿病自身抗原和/或CTLA4分子的組合物也包括 油基載體。
[0059] 油基載體是包括至少10重量％的適合于結(jié)合治療劑來施用至人的天然或合成油 的組合物，這是一個優(yōu)選實施方案。在優(yōu)選實施方案中，載體包括至少20、30、50、70、80、90、 95、98或99重量％的油。在一些實施方案中，油基載體可包括小于70、60、50、40、30或20 重量％的油。在優(yōu)選實施方案中，油在10重量％至95重量％范圍內(nèi)，優(yōu)選地20重量％至 90重量％或30重量％至70重量％的油。油應(yīng)被選擇來使得在施用至受試者時，它提供分 散于其中的物質(zhì)的持續(xù)釋放。適合油包括礦物油（例如，Drakeol6VR輕質(zhì)礦物油）、植物 油、角S烯或液體石錯。在一些實施方案中，油基載體可含有一種以上類型油。在一些實施 方案中，油基載體可包括免疫刺激劑，例如，免疫刺激葡聚糖，但是優(yōu)選得多的是油基載體 不包括免疫刺激劑，例如，免疫刺激葡聚糖、細菌組分，例如，分枝桿菌組分。在一個優(yōu)選實 施方案中，油基載體不包括明礬組分。
[0060] 雖然不希望受理論約束，據(jù)信油基載體通過觸發(fā)與炎癥和保護性免疫應(yīng)答能力相 關(guān)的免疫活性細胞來起作用。油基載體也可充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝 置。當注入受試者時，油基載體和抗原組合物可在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原 降解。抗原可從此積存物釋放緩慢至系統(tǒng)，并且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表 面面積并吸引炎性細胞。巨噬細胞可消化大多數(shù)并入的材料并且在其表面上呈遞經(jīng)過加工 的抗原?？乖蓮拇朔e存物釋放緩慢至系統(tǒng)中并且提供長效的抗原供應(yīng)來充當共刺激調(diào)節(jié) 劑。
[0061] 油基載體任選地包括乳化劑或表面活性劑組分。乳化劑或表面活性劑（和乳化劑 或表面活性劑的量）經(jīng)過選擇以使得它促進物質(zhì)（例如，抗原制劑）與油的混合或分散。油 基載體可包括0. 1重量％至50重量％，優(yōu)選地1重量％至30重量％，更優(yōu)選地5重量％至 20重量％的表面活性劑或乳化劑。乳化劑或表面活性劑的實例包括ArlacelA、二縮甘露 醇油酸酯（例如，Montamide80-二縮甘露醇單油酸酯）、無水甘露糖醇/油酸酯、聚氧乙烯 或聚氧丙烯。
[0062] 不完全弗氏佐劑（IFA)是人中的自身抗原的優(yōu)選遞送媒介物。本發(fā)明方法可預(yù)防 糖尿病，或預(yù)防或延遲殘留3細胞團塊的損失，提供更長緩解期并且在生命后期延緩糖尿 病相關(guān)、通常漸進性并發(fā)癥的發(fā)作。
[0063] 油基載體或佐劑通常由與水混合的兩種組分：（1)油和（2)乳化劑或表面活性劑 所組成。適合油和乳化劑在本領(lǐng)域中為已知的。舉例來說，油可為礦物油、植物油、角鯊烯 或液體石蠟。乳化劑或表面活性劑可為，例如，ArlacelA、二縮甘露醇油酸酯、無水甘露糖 醇/油酸酯、聚氧乙烯或聚氧丙烯。示例性油基佐劑包括常規(guī)IFA、MontamideISA佐劑或 亨特氏TiterMax佐劑。在優(yōu)選實施方案中，佐劑包括20重量％至95重量％，優(yōu)選地30 重量％至90重量％，更優(yōu)選地40重量％至70重量％的油相，和0. 1重量％至50重量％, 優(yōu)選地1重量％至30重量％，更優(yōu)選地5重量％至20重量％的表面活性劑或乳化劑。各 種類型的油基佐劑描述于例如美國專利號5, 814, 321、美國專利號6, 299, 884、美國專利號 6, 235, 282和美國專利號5, 976, 538中。
[0064]IFA通常是非代謝油（例如，礦物油）、水和表面活性劑（例如，ArlacelA)的 混合物。不同于完全弗氏佐劑（CFA)，IFA不含有細菌組分，例如，分枝桿菌。在人中使 用IFA的第一次大規(guī)模接種疫苗發(fā)生于美國軍事人員（Davenport(1968)AnnAllergy 26:288-292;Beebe等人，（1972)AmJEpidemiol95:337-346;Salk&Salk(1977)Science 195:834-847)。關(guān)于惡性腫瘤、過敏疾病和膠原病的結(jié)果基本上是陰性的，但是有證據(jù)表明 一些人在接種位點具有囊胞樣反應(yīng)。后期研究確認這些副作用是歸因于不正確的施用，即 它被錯誤地進行皮下而非肌肉內(nèi)給藥。根據(jù)這些實驗，IFA被一些人視為不適合于人使用， 但是它仍然廣泛用于動物研究。最近幾年中，新形式的IFA證明對于HIV免疫療法或治療接 種疫苗的人的使用是安全的（Turner等人（1994)AIDS8:1429-1435 ;Trauger等人（1995) JAcquirImmuneDeficSyndrHumRetrovirol10Supp2:S74-82;Trauger等人（1994)J InfectDis169:1256-1264)。
[0065]MontanideISA佐劑（Seppic,Paris,France)是一組基于油/表面活性劑的佐劑， 其中不同表面活性劑與非代謝礦物油、代謝油或兩者的混合物組合。這些佐劑被制備來用 作與Ag水溶液的乳液。MontanideISA50(ISA=不完全S印pic佐劑）的表面活性劑是二 縮甘露醇油酸酯，即弗氏佐劑中的表面活性劑的主要部分。Montanide組的表面活性劑經(jīng) 歷嚴格的質(zhì)量控制以防止可導(dǎo)致過度炎癥的任何物質(zhì)的污染，如已在用于弗氏佐劑中的一 些ArlacelA批料中發(fā)現(xiàn)所述污染。各種MontanideISA組的佐劑用作油包水乳液、水包 油乳液或水包油包水乳液。由于表面活性劑和油組合的變化，不同佐劑適應(yīng)不同水相/油 相比率。
[0066] 亨特氏TiterMax(CytRxCorp.，Norcross,Ga.)是以類似于用于常規(guī)弗氏佐劑 的方式制備為油包水乳液的基于油/表面活性劑的佐劑。然而，它使用代謝油（角鯊烯） 和具有良好蛋白質(zhì)抗原結(jié)合能力以及輔助活性的非離子表面活性劑。輔助活性可部分地 涉及表面活性劑的活化補體并且結(jié)合補體組分的能力，因為此有助于將Ag靶向輸送至脾 和淋巴節(jié)中的濾泡樹突狀細胞。用于可購得佐劑中的表面活性劑是由Hunter(Hunter等 人，1991Vaccine 9:250-256)開發(fā)的聚氧乙烯與聚氧丙烯的許多合成非離子嵌段共聚物 中的一種。利用共聚物包衣的微粒來使乳液穩(wěn)定允許形成具有小于20%油的穩(wěn)定乳液，這 是最小化所注射的總佐劑的重要因素。
[0067]佐劑可與抗原一起使用以引出細胞介導(dǎo)免疫力和產(chǎn)生抗體保護性同種型（在小 鼠中為IgG2a并且在靈長類中為IgGl)。不同類型的佐劑共有類似副作用，如注射位點的反 應(yīng)和致熱性。明礬是一種用于人疫苗的常用佐劑，它也在注射位點產(chǎn)生可觀的肉芽腫反應(yīng) (Allison&Byars(1991)MolImmunol28:279-284)。不完全弗氏佐劑的作用模式可涉及 非特異性以及特異性免疫應(yīng)答。IFA似乎通過觸發(fā)與炎癥以及保護能力相關(guān)的免疫活性細 胞來起作用。IFA也充當抗原媒介物和緩慢釋放或長期抗原呈遞裝置。將IFA和抗原化合 物注入患者，它在注射位點形成抗原積存物，從而防止抗原降解?？乖瓘拇朔e存物釋放緩慢 至系統(tǒng)，并且提供長效的抗原呈遞以及擴大的總接觸表面面積并吸引炎性細胞。巨噬細胞 消化大多數(shù)并入的材料并且在其表面上呈遞經(jīng)過加工的抗原。
[0068] 已發(fā)現(xiàn)IFA對于抗原免疫原性的特異性增強效果產(chǎn)生增加的體液免疫（優(yōu)選保護 性抗體產(chǎn)生；在人中為IgGl并且在小鼠中為IgG2a)并且引起特異性細胞介導(dǎo)免疫（優(yōu)選 Th2類型和Tregs)。具體來說，作為一個實例，IFA中的人重組胰島素B鏈在N0D小鼠胰島 中產(chǎn)生Th2細胞因子模式（Ramiya等人（1996)JAutoimmun9:349-356)。IFA在動物模型 中對經(jīng)過糖尿病預(yù)防試驗的佐劑是獨特的。Ramiya和同事（同上文）得出的結(jié)論是：明礬 和DPT兩者作為佐劑具有與所使用的抗原不相關(guān)的"非特異性"保護效果，而IFA是具有用 于動物中糖尿病預(yù)防的抗原特異性保護效果的唯一佐劑。
[0069]IFA，優(yōu)選被批準用于人的IFA，例如，Montanide(例如，MontanideISA51,Seppic Inc. ,France)或等效組合物，是用于本文描述的方法和疫苗的優(yōu)選佐劑。MontanideISA51 在我們的動物研究和我們的人研究中沒有展示全身或顯著局部副作用。
[0070]對于口服施用，化合物可容易通過將活性化合物與本領(lǐng)域中熟知的藥學(xué)上可接受 的載體組合來配制。這類載體使得本發(fā)明的化合物可配制為片劑、丸劑、糖錠劑、膠囊、液 體、凝膠、糖漿、漿液、混懸液等，以供所治療的患者口服攝入。用于口服的藥物制劑可通過 以下獲得：添加固體賦形劑，任選地研磨所得混合物，并且（如果需要的話）在添加適合的 助劑之后，加工顆粒混合物以獲得片劑或糖錠劑核心。適合的賦形劑尤其是填充劑，如糖， 包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素制劑，例如像玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯 淀粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯 烷酮（PVP)。如果需要，可以添加崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如 海藻酸鈉。
[0071]化合物可被配制用于通過注射進行腸胃外施用，例如，通過彈丸式注射或持續(xù)輸 注施用。注射（靜脈內(nèi)或皮下）是施用本發(fā)明組合物的優(yōu)選方法。用于注射的制劑可與添 加的防腐劑一起以單位劑型提供例如在安瓿中或在多劑量容器中。組合物可采用油性或水 性媒介物中的混懸液、溶液或乳液的這類形式，并且可含有配制劑，如可添加混懸、穩(wěn)定和/ 或分散劑，如交聯(lián)聚乙烯基吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。
[0072]在一些實施方案中，如本文描述的組合可通過皮下或肌肉內(nèi)注射來腸胃外施用。 在一些實施方案中，優(yōu)選施用模式是肌肉內(nèi)。舉例來說，如本文描述的1型糖尿病自身抗原 可以肌肉內(nèi)注射形式給與，優(yōu)選地深肌肉內(nèi)注射，以較小體積，例如，lml來給予。自身抗原 可施用一次，或一次以上。它可例如在1型糖尿病發(fā)作之前或之后給予。
[0073] 劑量還可取決于施用途徑并且根據(jù)宿主大小而變化。舉例來說，2mg人胰島素B鏈 溶液可施用至成人。根據(jù)本發(fā)明的免疫原性組合物中的活性成分蛋白質(zhì)的濃度通常約1至 95%。
[0074] 疫苗也可含有佐劑，例如，油基佐劑，例如，IFA。優(yōu)選地，疫苗含有適合于并且批準 用于人的IFA，例如，MontanideISA51或等效組合物。
[0075] 疫苗在適合于人施用的條件下制備。優(yōu)選地，疫苗注射在施用之前立即在無菌條 件下制備為乳液，通過使用高壓力無菌注射器制備為胰島素B鏈/IFA的50/50 (w/w)乳液。
[0076] 本文描述的方法和疫苗可用于預(yù)防自身免疫疾病，例如，糖尿病的發(fā)作。所述方法 和疫苗也可用于阻止組織，例如，胰腺0細胞的自身免疫破壞。所述方法和疫苗甚至適用 于在晚期階段阻止自身免疫破壞。舉例來說，在1型糖尿病臨床發(fā)作時，顯著數(shù)目的胰島素 產(chǎn)生0細胞遭破壞，但是約15%大概多達40%仍然能夠產(chǎn)生胰島素。如果自身免疫過程 可甚至在此晚期階段得到抑制，這些細胞可得以保留。0細胞具有一些有限復(fù)制能力并且 前體可形成新的0細胞。
[0077] 用于腸胃外施用的藥物制劑包括呈水溶性形式的活性化合物的水溶液。此外，活 性化合物的混懸液可以制備為適當?shù)挠托宰⑸浠鞈乙?。適合親脂性溶劑或媒介物包括脂肪 油（如芝麻油）或合成脂肪酸酯（如油酸乙酯或三酸甘油酯）或脂質(zhì)體。水性注射混懸液 可含有增加混懸液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖。任選地，所述混懸 液也可以含有適合的穩(wěn)定劑，或增加化合物溶解度以允許制備高濃度溶液的試劑。對注射 來說，本發(fā)明的藥物組合物可在水溶液，優(yōu)選生理相容緩沖液（諸如漢克斯溶液、林格氏溶 液或生理緩沖鹽水）中配制?；蛘撸钚猿煞挚沙史勰┬问?，以用于在使用前利用適合的媒 介物（例如，無菌無熱原水）構(gòu)建。
[0078] 提供至受試者的CTLA4分子和胰島素0鏈的組合的量取決于受試者體型和體重 以及疾病進展。對于本文描述的化合物，治療有效量可最初在體外測定中確定。由于本發(fā) 明化合物可具有低吸收和低生物利用率，因此治療有效量可根據(jù)例如化合物或其代謝物的 糞便濃度或來自血液的生物標記物來確定。如本領(lǐng)域中熟知的，用于人的治療有效量也可 根據(jù)動物模型來確定。治療有效劑量也可從已知展現(xiàn)類似藥理學(xué)活性的化合物的人數(shù)據(jù)來 確定。施加劑量可基于與已知化合物比較施用化合物的相對效力來調(diào)節(jié)。
[0079] 腸胃外施用本文描述的化合物的患者劑量通常在約lmg/天至約10,OOOmg/天范 圍內(nèi)，更通常約l〇mg/天至約1，OOOmg/天或約250mg/天至約2,OOOmg/天，并且最通常約 50mg/天至約500mg/天或約0? 5mg/天至約10mg/天。就患者體重而言，典型劑量在約0? 01 至約150mg/kg/天范圍內(nèi)，更通常約0? 1至約15mg/kg/天，并且最通常約1至約10mg/kg/ 天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
[0080]CTLA4分子和胰島素B鏈可以單一劑量施用或其可單獨地施用，其中單獨施用 涵蓋在接近相同時間施用或在不同時間施用，如一個在早晨并且另一個在傍晚，或一個每 天兩次并且另一個每天一次。兩個藥物可同時或以不同順序給與，即在不同時間點，首先 CTLA4-Ig，隨后IFA中的胰島素B鏈或胰島素B鏈然后CTLA4-Ig。
[0081]CTLA4分子可以單一每日劑量施用或它可每天多次施用。或者，它可每天小于一次 施用。給藥可在一段時間內(nèi)，如每月或每28天一次。在一些實施方案中，可在開始治療時 給與其它劑量（例如，彈丸式給藥）。在一些實施方案中，劑量含有大約1、3、5、10、20、30、 50、100mg/kg的融合蛋白。在一些實施方案中，劑量含有大約1、3、5、10、20、30、40、50、100、 500mg/kg的糖尿病自身抗原。
[0082]本文使用的術(shù)語的定義意圖并入在化學(xué)和藥物領(lǐng)域中關(guān)于每個術(shù)語公認的當前 技術(shù)現(xiàn)狀定義。在適當情況下，提供例證。定義適用于在整個本說明書中使用的術(shù)語，除非 在具體情況中單獨地或作為較大組的一部分另外加以限制。
[0083]如本文使用，術(shù)語"施用"意圖包括直接和間接地將化合物遞送至它的預(yù)期作用位 點的所有手段。
[0084]如本文使用，"自身抗原"是盡管是正常細胞或組織成分，但是可為受試者的體液 或細胞介導(dǎo)免疫響應(yīng)的靶蛋白。舉例來說，糖尿病1型自身抗原通常是胰腺細胞的正常蛋 白質(zhì)成分。本文描述的自身抗原的"免疫活性片段"是如下自身抗原，其中一個或多個氨基 酸殘基已經(jīng)缺失，并且片段保留與免疫細胞或與自身抗原抗體反應(yīng)或刺激針對自身抗原的 抗體產(chǎn)生的能力。舉例來說，免疫活性片段可為自身抗原多肽，其中殘基已經(jīng)從氨基和/或 羧基末端連續(xù)地缺失，同時基本上保留免疫原性活性。舉例來說，胰島素B鏈（SEQIDNO: 1 的氨基酸25-54)是前胰島素原的免疫活性片段；包括SEQIDNO:1的氨基酸33-47的多 肽是B鏈的免疫活性片段；包括SEQIDN0:3的約600至979氨基酸的多肽包括IA-2的免 疫活性片段。在一個優(yōu)選實施方案中，免疫活性片段是SEQIDN0:1-6中任何一個的片段。 優(yōu)選片段沒有原生自身抗原的一種或多種生物活性，但是保留與自身抗原抗體和免疫細胞 反應(yīng)的能力。例如，優(yōu)選胰島素片段或變體缺少低血糖效應(yīng)。優(yōu)選地，本文描述的自身抗原 的免疫活性片段具有4與400個之間的氨基酸殘基長度，更優(yōu)選地10與300個之間的氨基 酸殘基長度，更優(yōu)選地30與200個之間的氨基酸殘基長度。
[0085]如本文在延遲糖尿病進展的情形中使用的短語"延遲進展"意指在1型糖尿病的 臨床發(fā)作之后功能性殘留0細胞團塊的損失被延遲。T1DM的延遲進展可例如通過測量C 肽產(chǎn)生來測量。
[0086] 本文描述的自身抗原的"免疫活性變體"是如下自身抗原，其通過添加、修飾或取 代天然發(fā)生的自身抗原中的一個或多個氨基酸殘基來修飾并且保留與自身抗原抗體反應(yīng) 或刺激針對自身抗原的抗體產(chǎn)生的能力。本文描述的變體包括等位基因和多形變體，以及 保持結(jié)合自身抗原抗體或產(chǎn)生針對人體內(nèi)的自身抗原的免疫響應(yīng)的能力的突變蛋白和融 合蛋白。舉例來說，自身抗原的多達20%，優(yōu)選地多達10%的氨基酸殘基可置換為替代氨 基酸，只要變體保留結(jié)合自身抗原或產(chǎn)生針對例如人體內(nèi)的自身抗原的免疫響應(yīng)的能力。 變體也可包括本文描述的自身抗原或其片段，其中已經(jīng)插入或添加一個或多個氨基酸，例 如，偶合或融合至載體肽的自身抗原。還包含含有修飾的變體，如并入非天然氨基酸殘基， 或磷酸化、磺化或生物素化氨基酸殘基。氨基酸殘基的修飾還可包括羧基末端或含有羧基 側(cè)鏈的殘基的脂族酯或酰胺、含有羥基的殘基的〇-?；苌?，和氨基末端氨基酸或含有 氨基的殘基例如賴氨酸或精氨酸的N-酰基衍生物。其它修飾包括添加其它部分，尤其可增 加自身抗原的免疫原性的部分。優(yōu)選變體沒有原生自身抗原的一種或多種生物活性，但是 保留與自身抗原抗體或免疫細胞反應(yīng)的能力。例如，優(yōu)選胰島素變體沒有低血糖效應(yīng)。 [0087]短語"藥學(xué)上可接受的"是指在施用至如哺乳動物（例如，人）的動物時生理上 可耐受并且通常不產(chǎn)生過敏或類似不利反應(yīng)（如胃不適、眩暈等）的添加劑或組合物。術(shù) 語"藥學(xué)上可接受的載體"根據(jù)所需具體劑型包括任何和所有溶劑、稀釋劑或其它液體媒 介物、分散或混懸助劑、表面活性劑、等滲劑、增稠或乳化劑、防腐劑、固體粘合劑、潤滑劑 等。Remington's,TheScienceandPracticeofPharmacy, (Gennaro,A.R.編，第 19 版，1995,MackPub.Co.)公開用于配制藥物組合物的各種載體和其已知制備技術(shù)。除了如 通過產(chǎn)生任何不希望的生物作用或另外以有害的方式與藥物組合物的任何其它組分相互 作用而與物質(zhì)或其衍生物不相容的任何常規(guī)載體介質(zhì)以外，所述載體的使用被涵蓋在本發(fā) 明的范圍內(nèi)?？沙洚斔帉W(xué)上可接受的載體的材料的一些實例包括但不限于糖如乳糖、葡萄 糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素和其衍生物，如羧甲基纖維素鈉、乙基 纖維素和乙酸纖維素；粉狀黃蓍膠；麥芽；膠質(zhì)；滑石粉。賦形劑，如椰子油和栓劑蠟；油，如 花生油，棉籽油；紅花油，芝麻油；橄欖油；玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；酯，如油酸乙 酯和月桂酸乙酯；瓊脂；緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁；海藻酸；無熱原水；等滲鹽水；林 格氏溶液；乙醇，和磷酸鹽緩沖溶液，以及其它非毒性相容的潤滑劑，如月桂基硫酸鈉和硬 脂酸鎂，以及著色劑、釋放劑、包衣劑、甜味劑、調(diào)味劑和芳香劑、防腐劑和抗氧化劑也可根 據(jù)配制人員的判斷而存在于組合物中。
[0088] 術(shù)語"藥物組合物"是指具有如載體和/或賦形劑的其它試劑的本文描述的組合 物或其藥學(xué)上可接受的鹽。優(yōu)選地，藥物組合物具有以至少95 %純度，或98 %純度，或99% 純度，或更大純度存在的活性劑。
[0089]如本文使用，術(shù)語"受試者"是患有糖尿病、前糖尿病或易患糖尿病體質(zhì)的人或其 它動物。因此，在一些實施方案中，受試者需要如本文提供的治療性治療。優(yōu)選患者是哺乳 動物。患者的實例包括但不限于人、馬、猴、犬、貓、小鼠、大鼠、奶牛、豬、山羊和綿羊。在一 些實施方案中，"受試者"通常是患有糖尿病的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是在 最近200、100或50天內(nèi)被診斷患有T1DM的人患者。在一些實施方案中，"受試者"是最近 被診斷患有糖尿病但是仍然具有殘留0細胞功能的人患者。在一些此類實施方案中，殘留 3細胞功能是可檢測的，或至少10%、20%、30%、40%、50%、60%或更多的3細胞處于完 全運作胰腺中。
[0090] 術(shù)語"治療有效量"是指在劑量下和在所需時間周期在細胞培養(yǎng)物、組織系統(tǒng)、動 物或人中有效實現(xiàn)所需生物或醫(yī)藥反應(yīng)（例如，所需治療結(jié)果）的量。組合物的有效量可 以根據(jù)多種因素而不同，如個體的疾病病況、年齡、性別以及體重和CTLA4分子和/或糖尿 病自身抗原在個體體內(nèi)引出所需反應(yīng)的能力。治療有效量也是其中治療有利效果超過組合 物的任何毒性或有害影響的量。在一些實施方案中，反應(yīng)包括減輕和/或延遲所治療的疾 病、病狀或病癥的一個或多個癥狀的發(fā)作。
[0091] 如本文使用的術(shù)語"治療"定義為將治療劑應(yīng)用或施用至受試者，或?qū)⒅委焺?yīng)用 或施用至患有糖尿病、疾病癥狀或易患病體質(zhì)的受試者的分離組織或細胞系。治療意圖包 括預(yù)防發(fā)作、減緩進展、逆轉(zhuǎn)或另外改善、改善或影響疾病、疾病癥狀或易患病體質(zhì)。舉例來 說，用本文描述的組合物治療受試者，例如，人受試者可在1型糖尿病的臨床發(fā)作之前、期 間或之后減慢、改善或停止受試者的正在進行的自身免疫性，例如，針對胰腺0細胞的反 應(yīng)。
[0092] 術(shù)語"約"或"大致"意指如本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所確定的特定值在可接受的誤差 范圍內(nèi)，所述誤差范圍部分取決于所述值如何測量或測定--例如測量系統(tǒng)的限制或特定 用途所需要的精確度。舉例來說，如根據(jù)在本領(lǐng)域中的實踐，"約"可意指1個或2個標準偏 差?；蛘撸?約"可意指給定值的最多20%、優(yōu)選地最多10%并且更優(yōu)選地最多5%的范圍。 當在本申請和權(quán)利要求書中描述特定值時，除非另外規(guī)定，否則應(yīng)假定術(shù)語"約"意指在特 定值的可接受誤差范圍內(nèi)。
[0093] 除非上下文另有明確說明，否則本文中和所附權(quán)利要求中所使用的單數(shù)形式"一 (個/種）"和"所述"包括復(fù)數(shù)的提及物。因此，例如，對"一個分子"的提及包括這類分子 中的一個或多個，"一種樹脂"包括這類不同樹脂中的一種或多種，并且對"一種方法"的提 及包括提及本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的可被修改或取代本文描述的方法的等效步驟和方 法。
[0094] 雖然以上描述提供各種實施方案的實例和特定細節(jié)，但是應(yīng)認識到，所描述實施 方案的一些特征和/或功能允許修改而不脫離所描述實施方案的范圍。以上描述意圖說明 本發(fā)明，但其范圍只通過所附權(quán)利要求的用語來限制。
[0095]實施例
[0096]根據(jù)下列實施例可以進一步理解 申請人:教導(dǎo)的各方面，所述實施例不應(yīng)當被解釋 為以任何方式限制 申請人:教導(dǎo)的范圍。
[0097]實施例1-阿巴西普的施用
[0098]針對本研究對過去100天內(nèi)被診斷患有1型糖尿病的患者（6-45歲）進行平行篩 選。如果患者具有至少一個糖尿病相關(guān)自身抗體（微量測定胰島素抗體[如果胰島素療法 的持續(xù)時間小于7天];谷氨酸脫羧酶-65[GAD-65]抗體；胰島細胞抗原-512[ICA-512]抗 體；或胰島細胞自身抗體），并且具有在診斷糖尿病之后至少21天并在37天隨機化期內(nèi)完 成的混合餐耐量試驗（MMTT)期間被測量到0 ? 2nmol/L或更高的刺激C肽濃度，那么患者 適合參與研究。
[0099]對于乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎或HIV的血清抗體來說，血液樣品被篩選為陽 性的人被排除參與研究。也測試樣品的埃-巴二氏病毒（Epstein-Barrvirus，EBV)。在篩 選時具有活性EBV感染跡象的個體不合格。隨機化之后展示活性EBV感染跡象的參與者不 接受另外的研究藥物直到消退。
[0100] 患者以2:1比率隨機分配，按照參與地點來分級，接受使用雙盲方案的阿巴西普 或安慰劑實驗治療。表1提供參與者的基線人口統(tǒng)計和實驗室特征
[0101] 表 1
[0102]

【權(quán)利要求】
1. 一種治療受試者的糖尿病的方法，其特征在于所述方法包括： 向所述受試者施用有效量的融合蛋白組合物和有效量的1型糖尿病自身抗原，所述融 合蛋白組合物包含T細胞共刺激拮抗劑和免疫球蛋白分子的一部分。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述受試者患有殘留有P細胞功能的1型糖 尿病。
3. 如權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述T細胞共刺激拮抗劑包含 CTLA4的細胞外結(jié)構(gòu)域、所述細胞外結(jié)構(gòu)域的有效片段或所述細胞外結(jié)構(gòu)域的免疫活性變 體。
4. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述T細胞共刺激拮抗劑結(jié)合B 細胞和/或抗原呈遞細胞（APC)上表達的B7(CD80/86)抗原。
5. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述融合蛋白組合物是阿巴西 普。
6. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述自身抗原選自由以下組成的 組：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶H、外周蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂或其免疫 活性片段或其變體。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述自身抗原是前胰島素原組合物或其免疫 活性片段或其變體。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述前胰島素原片段是胰島素 B鏈或其免疫 活性片段或其變體。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述胰島素 B鏈片段包含SEQ ID NO: 1的氨 基酸33-47。
10. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述融合蛋白組合物和所述1 型糖尿病自身抗原一起作為藥物組合物來施用。
11. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述藥物組合物還包含油基載體。
12. 如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述油基載體是IFA或Montanide ISA。
13. 如權(quán)利要求10或權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于所述組合物通過靜脈內(nèi)輸注 來肌肉內(nèi)或皮下施用。
14. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述組合物以在約5mg/kg至約20mg/kg范 圍變化的所述融合蛋白組合物和在約1. 〇mg/ml至約4. Omg/ml范圍變化的所述1型糖尿病 自身抗原的劑量來施用。
15. 如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于所述組合物以在約250mg至約2000mg范圍 變化的所述融合蛋白和在約〇. 5mg至約10mg范圍變化的所述1型糖尿病自身抗原的劑量 來施用。
16. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述方法還包括確定隨著時間 推移在從所述受試者獲取的血液樣品中C肽的水平，所述水平是作為治療有效性的指示 物。
17. 如權(quán)利要求1至9中任一項所述的方法，其特征在于所述融合蛋白和所述自身抗原 順序地施用。
18. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述治療受試者的糖尿病包括 預(yù)防糖尿病的發(fā)作。
19. 如前述權(quán)利要求中任一項所述的方法，其特征在于所述治療受試者的糖尿病包括 延遲所述糖尿病發(fā)作至少六個月。
20. -種藥物組合物，其特征在于包含： 細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)聯(lián)抗原4 (CTLA4)融合蛋白； 選自由以下組成的組的自身抗原：前胰島素原、GAD 65、ICA512/IA-2、HSP60、羧肽酶 H、外周蛋白和神經(jīng)節(jié)苷脂或其免疫活性片段或其變體；以及 藥學(xué)上可接受的載體。
21. 如權(quán)利要求20所述的藥物組合物，其特征在于所述CTLA4融合蛋白是阿巴西普。
22. 如權(quán)利要求20或權(quán)利要求21所述的藥物組合物，其特征在于所述自身抗原是前胰 島素原或其免疫活性片段或其變體。
23. 如權(quán)利要求22所述的藥物組合物，其特征在于所述前胰島素原片段是胰島素 B鏈 或其免疫活性片段或其變體。
24. 如權(quán)利要求23所述的藥物組合物，其特征在于所述胰島素 B鏈片段包含SEQ ID NO: 1的氨基酸33-47。
25. 如權(quán)利要求20至24中任一項所述的藥物組合物，其特征在于所述藥學(xué)上可接受的 載體是油基載體。
26. 如權(quán)利要求25所述的藥物組合物，其特征在于所述油基載體是IFA或Montanide ISA。
27. 如權(quán)利要求20至26中任一項所述的藥物組合物，其特征在于包含約250mg至約 2000mg的所述融合蛋白和約0. 5mg至約10mg的所述1型糖尿病自身抗原。
【文檔編號】A61K38/19GK104507490SQ201380034880
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2013年6月27日 優(yōu)先權(quán)日:2012年6月27日
【發(fā)明者】泰漢摩·歐爾本 申請人:歐爾本生物科技有限責(zé)任公司