基因治療載體的廣泛的基因遞送的制作方法
【專利說明】基因治療載體的廣泛的基因遞送
[0001]本發(fā)明涉及用于在哺乳動物中遞送和表達治療基因的改進的組合物和方法。更具體地，本發(fā)明源自于如下出乎意料的發(fā)現(xiàn):當將治療基因并入到特定的一類病毒載體中并且施用到哺乳動物的腦脊液(CSF)和血液兩者中時，在哺乳動物中獲得了顯著的、大量的且廣泛的治療基因遞送和表達。如在脊髓性肌萎縮(SMA)模型中所示，與施用到一個單一位點相比，這樣的聯(lián)合施用在哺乳動物中導致令人驚訝和顯著的治療益處，這使得能夠使用降低劑量的載體。令人驚訝地，向CSF和血液的聯(lián)合遞送顯示出比單獨應用到CSF中或單獨靜脈內應用的相同總劑量更高的功效，由此表明了超累加性(supra-additive)效應。與單獨CSF遞送或單獨全身遞送相比，這一超累加性效應繼而允許降低必需的總劑量，雖然事實上被施用到CSF中的載體也將分布到整個身體，并且被全身遞送的載體也將被遞送到中樞神經(jīng)系統(tǒng)。本發(fā)明可用于任何哺乳動物(包括人類對象)，并特別適合于治療其中需要治療基因的廣泛表達的多系統(tǒng)疾病例如運動神經(jīng)元(MN)或溶酶體疾病。
[0002]藍直
[0003]運動神經(jīng)元(MN)疾病例如脊髓性肌萎縮(SMA)、肌萎縮性側索硬化癥(ALS)或肯尼迪病是由脊髓、腦干和/或運動皮質中麗的選擇性退化所表征的神經(jīng)退行性疾病(Monani 2005 ；Pasinelli 和 Brown2006) ； (Maclean，Warne 等 1996)。對于這些疾病沒有療法，主要是因為經(jīng)由全身注射進行的向MN的藥物遞送被“血腦屏障”(BBB)的存在所阻礙。這一解剖學和生理學屏障由中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)毛細血管的內皮細胞之間的緊密連接所形成，并防止分子在循環(huán)系統(tǒng)和CNS之間輕松通過(Scherrmann 2002)。使用被直接注射到CNS實質中的重組蛋白進行的MN的可選供應也是困難的，因為所述蛋白向神經(jīng)實質的低擴散、對重復注射或植入滲透泵的需要、以及手術操作的侵入性阻礙了潛在的臨床應用。
[0004]傳統(tǒng)藥理學的失敗已經(jīng)導致科學團體開發(fā)基于特別是使用病毒載體的基因轉移技術的新的治療策略。
[0005]在這方面，首先提出的MN疾病的基因轉移策略基于將載體鞘內遞送或直接注射到脊髓實質中(Davidson，PNAS 2000) (Azzouz, Hottinger等2000)。然而，這些方法沒能產(chǎn)生有效的廣泛CNS轉導。
[0006]將病毒載體注射到腦室中也用于如下目的:轉導脈絡叢和室管膜的上皮細胞，以及引起治療性蛋白在腦脊液(CSF)中的分泌(Passini和Wolfe 2001)。然而，重組蛋白向神經(jīng)組織的擴散是不充分的，并且不可能觀察到病毒的擴散。
[0007]通過肌內(1.m.)注射，利用病毒載體向麗的逆向軸突輸送，進一步開發(fā)了可選的非侵入性策略。源自于腺病毒、腺相關病毒(AAV)或用狂犬病G糖蛋白假型化的馬貧血病毒(EIAV)的一些病毒載體確實可以在1.m.注射后沿著MN軸突進行逆向輸送。這些病毒中的一些被成功地用于在實驗動物中轉導較低的MN(Finiels等，1995 ;Kaspar等，2003 ；Azzouz等，2004)。然而，特別是因為需要大量的注射位點和病毒粒子以靶向影響患者的大多數(shù)運動單元的處于病理狀態(tài)的MN，所以該方法的臨床價值仍是有疑問的。
[0008]在W02009/043936和Duque等(Mol Ther 2009)中，發(fā)明人已經(jīng)令人驚訝地發(fā)現(xiàn)某些病毒例如AAV9的外周注射能夠引起體內CNS細胞的顯著轉導，這首次表明，可以在單一的外周(例如，靜脈內[1.V.]、腹膜內[1.P.]、或肌內[1.rn.])注射后將目的基因轉移到新生和成年哺乳動物的MN中。
[0009]通過繼續(xù)他們的研宄，本發(fā)明人現(xiàn)已令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，當將基因克隆到特定的一類病毒載體中時并且當通過CSF/血液聯(lián)合施用方案來施用所述載體時，能夠顯著提高在體內的基因轉移和表達的功效。與施用到一個單一位點相比，這種方法確實導致令人驚訝和顯著的體內治療益處(存活、體重增加)。聯(lián)合施用看起來是超累加性的:該聯(lián)合比遞送到CSF或全身的相同劑量更加有效。這一超累加性效應繼而使得能夠使用總劑量降低的病毒以實現(xiàn)所需效果。因此，本發(fā)明提供了用于在體內表達治療基因的改進方法，并可用于任何哺乳動物，包括人類對象。其特別適合于治療多系統(tǒng)疾病，例如MN或溶酶體疾病。

【發(fā)明內容】

[0010]本發(fā)明涉及使用可轉移的病毒載體在體內遞送治療產(chǎn)品的新方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過向哺乳動物對象的CSF和血液聯(lián)合施用可轉移的病毒載體以在所述對象的神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中遞送和表達治療基因的組合物和方法。
[0011]本發(fā)明的目的更具體地涉及在哺乳動物中表達治療基因的方法，所述方法包括在所述哺乳動物的CSF和血液中聯(lián)合施用包含所述基因的可轉移的病毒載體，優(yōu)選為可轉移的 AAV 載體(tAAV)。
[0012]本發(fā)明的另一目的涉及治療哺乳動物中的多系統(tǒng)疾病的方法，所述治療通過施用有效地治療所述疾病的治療基因來實現(xiàn)，其中所述治療基因被包含在可轉移的病毒載體、優(yōu)選tAAV載體中，并且其中所述方法包括向所述哺乳動物的CSF和血液聯(lián)合施用所述載體。
[0013]本發(fā)明的另一目的在于在需要的對象中治療CNS疾病例如MN疾病的方法，所述方法包括向所述對象施用治療基因，其中所述治療基因被包含在可轉移的病毒載體、優(yōu)選tAAV載體中，并且其中所述方法包括向所述哺乳動物的CSF和血液聯(lián)合施用所述載體，從而導致對所述對象進行治療。
[0014]本發(fā)明的另一目的在于通過向患有MN疾病的對象施用治療基因而在所述對象中增加存活或重量的方法，其中所述治療基因被包含在可轉移的病毒載體、優(yōu)選tAAV載體中，并且其中所述方法包括向所述哺乳動物的CSF和血液聯(lián)合施用所述載體，從而導致所述對象的存活或體重的增加。
[0015]本發(fā)明的另一目的是包含治療基因的可轉移的病毒載體，所述治療基因用于通過向哺乳動物對象的CSF和血液聯(lián)合施用所述載體來治療所述對象中的多系統(tǒng)疾病。
[0016]本發(fā)明的另一目的是包含治療基因的可轉移的病毒載體，所述治療基因用于通過向需要的對象的CSF和血液聯(lián)合施用所述載體來治療哺乳動物對象中的CNS疾病。
[0017]根據(jù)優(yōu)選實施方式，可轉移的病毒載體是tAAV，例如AAV9或AAVlO載體。
[0018]向哺乳動物的CSF施用病毒載體優(yōu)選通過腦室內(1.c.V.或ICV)注射、鞘內注射、或腦池內注射來進行，并且向血液的施用優(yōu)選通過腸胃外遞送(例如1.v.(或IV)注射、1.m.注射、動脈內注射、1.p.注射、皮下注射、皮內注射、經(jīng)鼻遞送、經(jīng)皮遞送(例如貼劑)、或者通過經(jīng)腸遞送(口服或直腸)來進行。
[0019]如本申請中所示，聯(lián)合施用更優(yōu)選地為同時施用，雖然可進行順序施用。
[0020]本發(fā)明的另一目的是包含兩個單位劑量的可轉移的病毒載體的組合物或試劑盒，其中一個單位劑量適用于全身注射，一個單位劑量適合于注射到CSF中。
[0021]本發(fā)明的另一特定目的在于在需要的哺乳動物中治療SMA的方法，所述方法包括向所述哺乳動物的CSF和血液聯(lián)合施用包含治療基因的可轉移的病毒載體、優(yōu)選tAAV載體，所述聯(lián)合施用導致治療基因在神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織或器官中表達并允許對SMA進行治療。
[0022]更優(yōu)選地，用于治療SMA的治療基因是SMN基因(即，編碼SMN蛋白的任何DNA或RNA)或能夠調整可選的剪接、激活啟動子、或提高SMN蛋白的穩(wěn)定性并由此引起SMN水平增加的任何序列(例如編碼反義寡核苷酸的序列)。
[0023]本發(fā)明的另一目的在于用于降低被施用到需要基因療法治療的對象的治療基因的劑量而不降低臨床益處的方法，所述方法包括使用可轉移的病毒載體將所述基因施用到對象的CSF和血液中。
[0024]本發(fā)明可用于任何哺乳動物，優(yōu)選為人類對象。
【附圖說明】
[0025]S 1.1CV 和 IV scAAV9-PGK-SMNopti 注射的 SMN Δ 7 小鼠的 Kaplan-Meier 存活曲線
[0026]ICV (η = 10)和IV (η = 10)注射小鼠(在PO時)兩者存活超過未注射小鼠的最大壽命(18天，η = 14) ο未ICV注射小鼠在60天的日齡之前死亡，而僅54%的IV注射小鼠在該日齡時是活著的。ICV注射小鼠的存活中值顯著高于IV注射小鼠的存活中值(163天對73天)。
[0027]S 2.1CV 和 IV 注射的 scAAV9-PGK-SMNopti SMN Δ 7 小鼠的體重曲線
[0028]與IV注射的SMNΔ 7小鼠(η = 13)的體重損失表型相比，ICV注射的SMNΔ 7小鼠(η = 10)的體重損失表型得到改善。與未注射的SMNA 7小鼠的體重損失表型相比，IV和ICV注射小鼠兩者的體重損失表型均得到改善；對于ICV注射小鼠來說，其改善優(yōu)于IV注射小鼠的改善(在30天的日齡時，相對于雜合小鼠的?33g和未治療的小鼠的?3g，1.V.和1.c.V.注射小鼠分別為?17g和?25g)。Ht:對照雜合小鼠；N1:未注射的SMN Λ 7小鼠。
[0029]圖3.在PO時ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMNA 7小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中SMN的表達
[0030]對腦和脊髓中SMN的表達的㈧蛋白質免疫印跡和⑶免疫熒光分析顯示，SMN水平在ICV注射的SMNA 7小鼠(η = 3)中比在未注射的SMNA 7小鼠(η = 2)和野生型小鼠(η = 2)中高。
[0031 ] 圖4.在PO時ICV scAAV9-PGK-SMN注射后，SMN Δ 7小鼠的外周器官中SMN的表達
[0032]在ICV注射的新生SMN Δ 7小鼠(η = 3)的心臟、腎臟、和肝臟中檢測SMN的表達。
[0033]圖 5.scAAV9-PGK-SMNopti ICV, IV、和 ICV/IV 共注射的 SMNA 7 小鼠的 KaplanMeier存活曲線
[0034]與單獨IV (η = 10)或ICV (η = 14)注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠(η =14)中存在疾病遲發(fā)的趨勢。100%的ICV/IV共注射小鼠在50天的日齡時仍然是活著的。
[0035]圖6.與單獨IV (η = 10)或ICV (η = 14)注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠(η = 14)中體重損失表型得到改善
[0036]在15周時，ICV/IV共注射、ICV、和IV小鼠的平均體重分別達到24g、21g、和16g(雜合小鼠的體重為26.5g)。在15周時，ANOVA分析沒有顯示出雜合小鼠和IV/ICV共注射小鼠(與ICV或IV注射小鼠相對比)之間在體重上的任何統(tǒng)計學差異。
[0037]圖 7.scAAV9-PGK-SMNopti ICV, IV、和 ICV/IV 共注射的 hSMN2 小鼠的 KaplanMeier存活曲線
[0038]ICV/IV共注射小鼠的平均存活(~ 27天)優(yōu)于IV ( ~ 9天)或ICV ( ~ 8天)注射小鼠的平均存活，其中一只ICV/IV共注射小鼠存活長達170天。
[0039]對于scAAVlO-SMNopti注射小鼠發(fā)現(xiàn)了相似的差異，其中一只日齡為200天的小鼠在此提交時間時仍然存活。
[0040]圖8.在 PO 時用 scAAV9-PGK-SMNopti ICV、IV 或 ICV/IV 共注射的嚴重 hSMN2 小鼠(KO)的體重表型的比較
[0041 ] 與IV或ICV注射的SMN Δ 7小鼠的體重損失表型相比，ICV/IV共注射的KO小鼠的體重損失表型得到改善(Hz:對照雜合小鼠；K0:未注射的嚴重SMA小鼠；WT:野生型小鼠)。重要的是，一只ICV/IV注射小鼠存活長達170天的日齡。
[0042]圖 9.scAAV9-PGK-SMN ICV, IV、或 IV/ICV 共注射的 SMN Δ 7 小鼠的 CNS 中 SMN 表達的比較
[0043](A)對在PO時根據(jù)不同的遞送途徑(每種遞送途徑η = 2)用scAAV9-PGK_SMN注射后15天的小鼠腦和脊髓組織以及在未注射的SMNA7和野生型對照中進行的蛋白質免疫印跡分析。與單獨ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN水平降低。ICV注射的SMNA7小鼠中腦和脊髓的SMN表達。(B)來自于在PO時根據(jù)不同的遞送途徑用scAAV9-PGK-SMN注射并在注射后15天進行SMN免疫熒光處理的小鼠的脊髓橫向切片的代表性切片。同樣地，與單獨ICV注射的小鼠相比，在ICV/IV共注射小鼠中SMN-陽性細胞的數(shù)量和染色強度降低。
[004