針對編碼功能蛋白的變體篩選多核苷酸文庫的制作方法
【專利說明】針對編碼功能蛋白的變體篩選多核巧酸文庫 相關申請的交叉引用
[0001] 本申請要求于2012年9月20日提交的美國臨時申請?zhí)?1/703, 566的權益，將其 通過引用W其全部內(nèi)容而特此結(jié)合。 關于在聯(lián)邦政府資助的研究與開發(fā)下完成的發(fā)明的權利聲明
[0002] 不適用。 發(fā)明領域
[0003] 本發(fā)明設及微生物學、分子生物學和蛋白質(zhì)生物化學領域。更具體而言，本發(fā)明設 及用于對多核巧酸文庫分析和富集編碼功能蛋白的變體的組合物和方法。 發(fā)明背景
[0004] 對多核巧酸文庫篩選編碼優(yōu)選蛋白活性的變體在生物技術中是一項中屯、事 業(yè)（參見例如，雅克爾（化ckel)和希爾韋特化ilved)，生物技術當前述評（化rr化in Biotechnol) 21，753-759 (2010))。遺憾地，隨著文庫多樣性增加，在文庫中活性變體的數(shù)目 呈指數(shù)下降（參見例如，郭佑UO)等人，PNAS(2004);布洛姆炬loom)等人，PNAS(2005))。 該種相反的關系導致多核巧酸文庫的篩選無效且昂貴。由于僅僅文庫的一小部分編碼功能 蛋白，因此通常必須篩選數(shù)千、數(shù)百萬或甚至數(shù)十億的變體，W便鑒定所希望的克隆。篩選 通常是緩慢且昂貴的，因為它典型地需要自定義的宿主細胞轉(zhuǎn)化、蛋白質(zhì)表達和頻繁純化 與定量、與底物或配體進行特異反應、信號檢測與定量。
[0005] 為有助于文庫篩選嘗試，已經(jīng)研發(fā)了許多方法和大量的機器人自動化（參見例 如，邁爾克（Maerkl)，生物技術當前述評（QirrOpinBiotechnol)22,59-65(2011);戈達德 (Goddard)和雷蒙德巧eymond)，生物技術當前述評15,314-322(2004);瓦勒爾（W址ler) 和雷蒙德，生物技術當前述評12,535-544(2001))。盡管如此，但是篩選通量是不足的且 仍是昂貴的，因為必須從龐大的可能性中鑒定有希望的變體。例如，在一個100-氨基酸 蛋白中突變兩個隨機氨基酸形成包含1.98X106個獨特成員的文庫（參見例如，迪特里希 值ietrich)等人，生物化學年鑒（AnnRevBiochem)79,563-590(2010))。所有篩選途徑的 中屯、局限在于，它們必須針對祀蛋白與特異反應物的活性或相互作用并且針對檢測與分離 陽性變體的手段兩者進行自定義。 發(fā)明概述
[0006] 在不同方面中，在此考慮的本發(fā)明或多個發(fā)明可W包括但無需局限于W下實施例 中的任何一個或多個。
[0007] 實施例1 ; 一種針對可能編碼功能多膚的多核巧酸而對多個多核巧酸進行富集并 對該富集的多個多核巧酸進行篩選的方法，該方法包括；(a)提供編碼一種多膚的變體的 多個多核巧酸，其中該些多核巧酸中的至少一些編碼一種具有至少一種活性的多膚；化） 從該些多核巧酸產(chǎn)生多膚；（C)確定該些多膚是否可溶；（d)選擇編碼可溶性多膚的多核巧 酸，W形成富集的多個多核巧酸；并且（e)針對編碼具有該活性的多膚的多核巧酸篩選該 富集的多個多核巧酸。
[000引實施例2 ;如實施例1所述的方法，其中所述選擇產(chǎn)生編碼一種具有該活性的多膚 的多核巧酸的至少2倍富集。
[0009] 實施例3 ;如實施例2所述的方法，其中所述選擇產(chǎn)生編碼一種具有該活性的多膚 的多核巧酸的至少選自下組的富集程度的富集，該組由W下各項組成；5倍、10倍、15倍、20 倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90 倍、95 倍、100 倍、1〇3倍、10 4倍、10 5倍、10 6倍、10 8倍W及 10 9倍。
[0010] 實施例4 ;一種關于可能編碼功能多膚的多核巧酸的水平來比較至少兩個多核巧 酸文庫的方法，該方法包括；(a)提供編碼相同多膚的變體的多核巧酸的至少兩個不同文 庫；化）針對每一多個多核巧酸；（i)從該些多核巧酸產(chǎn)生多膚；并且（ii)確定該些多膚是 否可溶；并且（C)將具有最高水平的可溶性多膚的多個多核巧酸鑒定為包含最高水平的可 能編碼功能多膚的多核巧酸的多個多核巧酸。
[0011] 實施例5 ;如實施例4所述的方法，其中每一多個多核巧酸都包括至少一些編碼一 種具有至少一種活性的多膚的多核巧酸，并且該方法另外包括針對編碼具有該活性的多膚 的多核巧酸篩選該鑒定的多個多核巧酸。
[0012] 實施例6 ;如任何W上實施例所述的方法，其中該方法另外包括針對編碼具有高 于預定水平的活性的多膚的多核巧酸篩選該富集或鑒定的多個多核巧酸。
[0013] 實施例7 ;如任何W上實施例所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括在宿主細胞中表達 該些多膚。
[0014] 實施例8 ;如實施例7所述的方法，其中將該些多膚在宿主細胞中表達為融合蛋 白，其中該融合蛋白還包括一個溶解度報告部分。
[0015] 實施例9 ;如實施例8所述的方法，其中該宿主細胞表達一種互補多膚，該互補多 膚能夠結(jié)合至融合蛋白的溶解度報告部分，W產(chǎn)生一種可檢測的蛋白質(zhì)復合物。
[0016] 實施例10 ;如實施例9所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括；在該宿主細胞中從一種 表達載體表達該些融合蛋白，該表達載體包括誘導型或阻抑型啟動子；終止該些融合蛋白 的表達并且允許該些宿主細胞休眠一段時間足W允許降解或加工錯誤折疊的融合蛋白；所 述休眠期后，從誘導型或阻抑型啟動子表達該互補多膚。
[0017] 實施例11 ;如實施例10所述的方法，其中確定該些多膚是否可溶包括針對該可檢 測的蛋白質(zhì)復合物篩選該些宿主細胞。
[0018] 實施例12 ;如實施例11所述的方法，其中選擇該些編碼可溶性多膚的多核巧酸W 形成富集的多個多核巧酸包括：裂解包括該可檢測的蛋白質(zhì)復合物的任何一個或多個宿主 細胞；并且回收編碼該融合蛋白的該多核巧酸。
[0019] 實施例13 ;如實施例12所述的方法，其中通過核酸擴增回收編碼該融合蛋白的該 多核巧酸。
[0020] 實施例14 ;如實施例1-6中任一項所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括在一種反應 混合物中表達該些多膚，該反應混合物包括用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的組分。
[0021] 實施例15 ;如實施例14所述的方法，其中在分開的反應混合物中表達不同多膚， 該些分開的反應混合物包括用于體外轉(zhuǎn)錄/翻譯的組分，其中至少約20%的該些反應混合 物中每反應混合物表達一種或更少的所述多膚（即，一種多膚或沒有多膚）。
[0022] 實施例16 ;如實施例15所述的方法，其中該些分開的反應混合物包括油包水乳液 中的水相液滴。
[0023] 實施例17 ;如實施例16所述的方法，其中將該些多膚表達為融合蛋白，其中每種 融合蛋白都包括一個或多個溶解度報告部分，該一個或多個溶解度報告部分包括；多膚附 接標簽，該標簽能夠與該多個多核巧酸中的多核巧酸形成共價鍵，或W其他方式結(jié)合至其 上；W及多膚親和標簽。
[0024] 實施例18 ;如實施例17所述的方法，其中化）的產(chǎn)生包括；在該些水相液滴中表 達該些融合蛋白；并且允許每種融合蛋白都被表達，該每種融合蛋白都能夠與多核巧酸在 該水相液滴中形成共價鍵，或W其他方式結(jié)合至其上。
[0025] 實施例19 ;如實施例18所述的方法，其中確定該些多膚是否可溶，并且選擇該些 編碼可溶性多膚的多核巧酸W形成富集的多個多核巧酸包括通過親和捕獲而回收結(jié)合至 融合蛋白的多核巧酸。
[0026] 實施例20 ;如任何W上實施例所述的方法，其中該多個多核巧酸包括來源于來自 植物或動物的樣品或來源于環(huán)境樣品的多核巧酸集。
[0027] 實施例21 ;-種篩選有助于蛋白質(zhì)折疊的分子伴侶的方法，該方法包括；(a)在宿 主細胞中或在體外反應混合物中表達一種融合蛋白，其中該融合蛋白包括一個趨于錯誤折 疊或凝集的部分，其中該部分被連接至一個或多個溶解度報告部分，并且其中該宿主細胞 或體外反應混合物還包括或產(chǎn)生一種潛在的分子伴侶；化）確定該融合蛋白是否可溶；（C) 如果該融合蛋白是可溶的，則將該潛在的分子伴侶鑒定為有助于該融合蛋白的折疊的分子 伴侶。
[002引實施例22 ;如實施例21所述的方法，其中在多個宿主細胞或體外反應混合物中表 達該融合蛋白，并且不同宿主細胞或反應混合物分別包括或產(chǎn)生不同的潛在的分子伴侶， 并且其中，當在體外反應混合物中表達該融合蛋白時，至少約20%的該些反應混合物中每 反應混合物包括或產(chǎn)生一種或更少的所述潛在的分子伴侶。
[0029] 實施例23;如實施例22所述的方法，其中該些潛在的分子伴侶表達自選自W下各 項的多核巧酸集：編碼已知的分子伴侶多膚的集，編碼一種或多種已知的分子伴侶多膚的 變體的集，編碼膚的集，來源于來自植物或動物的樣品或來源于環(huán)境樣品的集，或者該些潛 在的分子伴侶包括選自W下各項的小分子集；多個已知的小分子分子伴侶，一種或多種已 知的小分子分子伴侶的多個變體，和多個小分子，其中在該小分子集中的每個小分子都被 連接至獨特的多核巧酸條碼。
[0030] 實施例24 ;如實施例23所述的方法，其中一種給定的潛在的分子伴侶是一種通過 表達編碼該潛在的分子伴侶的多核巧酸而產(chǎn)生于該宿主細胞或體外反應混合物中的多膚 或膚。
[0031] 實施例25 ;如實施例22-24中任一項所述的方法，其中在表達一種互補多膚的宿 主細胞中表達該融合蛋白，該互補多膚能夠結(jié)合至融合蛋白的溶解度報告部分，W產(chǎn)生一 種可檢測的蛋白質(zhì)復合物。
[0032] 實施例26 ;如實施例25所述的方法，其中確定該些融合蛋白是否可溶包括針對該 可檢測的蛋白質(zhì)復合物篩選該些宿主細胞。
[003引實施例27 ;如實施例24所述的方法，其中鑒定該潛在的分子伴侶包括：裂解包括 該可檢測的蛋白質(zhì)復合物的任何一個或多個宿主細胞；并且回收編碼該潛在的分子伴侶的 多核巧酸。
[0034] 實施例28 ;如實施例27所述的方法，其中通過核酸擴增回收編碼該潛在的分子伴 侶的該多核巧酸。
[003引實施例29 ;如實施例22-24中任一項所述的方法，其中在分開的反應混合物中表 達該些融合蛋白，該些分開的反應混合物包括油包水乳液中的水相液滴。
[0036] 實施例30 ;如實施例29所述的方法，其中每種融合蛋白都包括一個或多個溶解度 報告部分，該一個或多個溶解度報告部分包括；多膚附接標簽，該標簽能夠與多核巧酸形成 共價鍵，或W其他方式結(jié)合至其上；W及多膚親和標簽。
[0037] 實施例31 ;如實施例30所述的方法，其中該方法包括允許每種融合蛋白都該樣， 該每種融合蛋白都能夠與多核巧酸在該水相液滴中形成共價鍵，或W其他方式結(jié)合至其 上，該多核巧酸編碼潛在的分子伴侶，或結(jié)合至其上。
[003引實施例32 ;如實施例31所述的方法，其中確定該融合蛋白是否可溶包括通過親和 捕獲而回收結(jié)合至融合蛋白的多核巧酸。
[0039] 實施例33 ;-種用于鑒定一個或多個可溶和/或功能結(jié)構域的蛋白質(zhì)結(jié)構域作 圖方法，該方法包括；(a)在宿主細胞中或在體外反應混合物中表達一種融合蛋白，其中該 融合蛋白包括有待作圖的蛋白質(zhì)的一部分，其中該部分被連接至一個或多個溶解度報告部 分；化）確定該融合蛋白是否可溶；（C)如果該融合蛋白是可溶的，則將該部分鑒定為作為 可溶和/或功能結(jié)構域的部分。
[0040] 實施例34 ;如實施例33所述的方法，其中在多個宿主細胞或體外反應混合物中表 達多個不同的融合蛋白，并且其中，當在體外反應混合物中表達該融合蛋白時，至少約20% 的該些反應混合物中每反應混合物包括或產(chǎn)生一種或更少的所述潛在的分子伴侶。
[0041] 實施例35 ;如實施例34所述的方法，其中該多個不同的融合蛋白包括有待被作圖 繪的蛋白質(zhì)的多個不同部分，每個部分都被連接至一個或多個溶