一種以mapk家族蛋白為靶標(biāo)篩選調(diào)節(jié)病毒活性化合物的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以MAPK家族特定的三個蛋白(P38、JNK、ERK)為靶標(biāo)篩選抗病毒化合物的方法，以及由該方法篩選獲得的黃酮母核類化合物，還涉及由該篩選方法篩選獲得的特定化合物在調(diào)節(jié)MAPK家族蛋白表達(dá)活性中的應(yīng)用，以及所述化合物在激活機(jī)體細(xì)胞自體防御功能中的應(yīng)用。
【專利說明】—種以MAPK家族蛋白為靶標(biāo)篩選調(diào)節(jié)病毒活性化合物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種特定多蛋白靶點的抗病毒小分子化合物的篩選方法，由此獲得的化合物及其抗病毒應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]流感是一個全球性的人畜共患的由流感病毒引起的季節(jié)性爆發(fā)的呼吸系統(tǒng)疾病，全球范圍內(nèi)每年大約有20 %的人被流感病毒感染。雖然現(xiàn)有的藥物和疫苗對于流感病毒的傳播和疾病的控制能起到一定的作用，但是其效果相當(dāng)有限，原因之一是因為大多數(shù)藥物僅針對某些特定的病毒蛋白靶點，而RNA病毒的基因組高突變率，進(jìn)而導(dǎo)致病毒耐藥性的產(chǎn)生和宿主免疫系統(tǒng)的逃逸效果，更進(jìn)一步的，流感病毒的基因組僅由八個RNA片段編碼了所有的 11 個蛋白(HA, NA, NP, NSl, NS2, PA, Ml, M2, PB1-F2, PBland PB2)，也限制了抗病毒藥物的靶標(biāo)數(shù)量。
[0003]另一方面，雖然不同致病強(qiáng)度流感病毒的感染使宿主產(chǎn)生不同強(qiáng)度的免疫應(yīng)答，但是多數(shù)流感病毒毒株如H1N1，H3N2, H5N1和H7N9亞型，在進(jìn)化過程中產(chǎn)生了相似的抑制宿主免疫應(yīng)答的能力，即在流感病毒感染宿主初期，宿主體內(nèi)免疫反應(yīng)被抑制，待到感染后期，病毒已經(jīng)大量復(fù)制和擴(kuò)散，突然爆發(fā)大規(guī)模免疫反應(yīng)，使得機(jī)體嚴(yán)重受損如病毒性肺炎。
[0004]目前，不同于傳統(tǒng)的僅以病毒基因組為靶標(biāo)開發(fā)抗病毒藥物的策略，一些較為新穎的抗流感藥物開發(fā)策 略開始著眼于不同的角度，例如通過調(diào)節(jié)特定的病毒生命周期所需要細(xì)胞因子，或是通過激活宿主細(xì)胞的抗病毒反應(yīng)等，這些新的策略已被證明具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)勢。宿主的抗病毒效應(yīng)不止體現(xiàn)在免疫系統(tǒng)的激活，更表現(xiàn)為細(xì)胞的自體防御功能(也被稱為細(xì)胞自主免疫)，在所有的生物體中，這一功能都用來保護(hù)宿主對抗病原微生物。不像免疫細(xì)胞的特異性抗病毒功能，細(xì)胞自主免疫在大部分細(xì)胞系中都有存在，表現(xiàn)為宿主的第一層防御機(jī)制。在免疫系統(tǒng)被激活且免疫細(xì)胞募集至感染點前，某些體細(xì)胞例如上皮細(xì)胞已經(jīng)開始通過一定步驟對不同病毒周期進(jìn)行抑制(包括侵入、脫殼、復(fù)制和釋放等)，并通過一些由宿主釋放的信號(例如宿主防御因子和分泌型細(xì)胞因子和趨化因子，如干擾素)抑制病毒的擴(kuò)散，這一過程有效的抑制了病毒的復(fù)制和傳播，同時也減少了組織損傷。
[0005]在細(xì)胞自體防御調(diào)控機(jī)制的分子生物學(xué)途徑中，MAPK通路是重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，該通路通過將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)信號來調(diào)控多種細(xì)胞內(nèi)生理生化活動，特別是細(xì)胞的自體免疫應(yīng)答。MAPK家族包括三個成員，分別為JUN-N末端激酶(JNK)，p38激酶(p38)和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK)。
[0006]在流感病毒感染的細(xì)胞模型中，目前已有文獻(xiàn)報道，JNK和p38蛋白通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子ATF-2和c-Jun的表達(dá)，參與調(diào)控干擾素β，干擾素Y和其他抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，繼而調(diào)控宿主對流感病毒感染的免疫反應(yīng)。已有報道表明，增加JNK和ρ38激酶表達(dá)，不但增強(qiáng)宿主上皮細(xì)胞抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)，同時通過增強(qiáng)宿主免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的活化和募集，即增強(qiáng)宿主天然免疫和獲得性免疫反應(yīng)。
[0007]另一方面，ERK則參與調(diào)控病毒核糖核蛋白復(fù)合體出核過程，已有文獻(xiàn)報道表明，多數(shù)流感病毒毒株如H1N1，H3N2，H5N1和H7N9亞型的生活周期基本相同，在病毒復(fù)制過程中都需要ERK調(diào)控其病毒核糖核蛋白復(fù)合體出核過程，因此，降低的ERK表達(dá)對流感病毒出核過程具有抑制作用，從而能夠抑制流感病毒的復(fù)制。
[0008]雖然MAPK家族通過調(diào)控流感病毒自身復(fù)制過程和宿主免疫應(yīng)答過程而影響流感病毒的擴(kuò)散及對機(jī)體的損傷的基礎(chǔ)功能都已被闡明。但是，并未有任何報道表明，存在某一化合物，能夠同時調(diào)控JNK、p38和ERK的分子效應(yīng)。而同時，一般意義的抗感冒病毒藥物篩選方案，也多集中在針對單一靶標(biāo)蛋白的目標(biāo)化合物的篩選過程，因此，也并沒有任何以上述MAPK家族中的多個成員的組合效應(yīng)為調(diào)節(jié)目標(biāo)的定點藥物篩選方案的報道。
[0009]下列參考文獻(xiàn)作為【背景技術(shù)】的參考，以其公開的內(nèi)容引入本申請:
[0010]1.Huang, Y.T.&Turchek, B.Μ.，Mink lung cells and mixed mink lung andA549cells for rapid detection of influenza virus and other respiratory viruses.J Clin Microbiol38，422-423 (2000).[0011]2.Chakrabarti, A.K.et al., Host gene expression profiling in influenzaA virus-1nfected lung epithelial (A549)cells:a comparative analysis betweenhighly pathogenic and modified H5Nlviruses.Virol J7, 219(2010).[0012]3.Pauli,E.K.et al., Influenza A virus inhibits type I IFN signaling viaNF-kappaB-dependent induction of S0CS-3expression.PLoSPathog4, el000196(2008).[0013]4.Karlas,A.et al.,Genome-wide RNAi screen identifies human host factorscrucial for influenza virus replication.nature463, 818-822 (2010).[0014]5.Ludwig, S.，Planz，0.，Pleschka，S.，&Wolff, T.，Influenza-virns-1nducedsignaling cascades:targets for antiviral therapy?Trends in MolecularMedicine9，46-52(2003).[0015]6.Muller, K.H.et al.，Emerging cellular targets for influenza antiviralagents.TRENDS inPharm acological Sciences33，89-99 (2012).[0016]7.Randowj F.，MacMicking，J.D.，&James，L.C.，Cellular Self-Defense:HowCell-Autonomous Immunity Protects Against Pathogens.Science340, 701-706(2013).[0017]8.Lee, S.Μ.Y.&Yen, H.L., Targeting the host or the virus:Current andnovel concepts for antiviral approaches against influenza virus infection.Antiviral Research96, 391-404 (2012).[0018]9.Ronald，P.C.&Beutler, B.，Plant and Animal Sensors of ConservedMicrobial Signatures.Science330，1061-1064 (2010).[0019]10.Yan，N.&Chen，Z.J.J.，Intrinsic antiviral immunity.NatureImmunologyl3, 214-222(2012).[0020]11.MacMicking, J.D., Interferon-1nducible effector mechanisms incell-autonomous immunity.Nature Reviews Immunologyl2, 367-382(2012).[0021]12.Sadler，A.J.&Williams, B.R.G.，Interferon-1nducibIe antiviraleffectors.Nature Reviews Immunology8，559-568(2008).[0022]13.Grandvaux, N.，tenOever, Β.R.，Servant, M.J.，&Hiscott，J.，The interferonantiviral response:from viral invasion to evasion.Current Opinion inlnfectiousDiseasesl5，259-267 (2002).[0023]14.Costa-Pereira,A.P.etal.,The antiviral response to gamma interferon.Journal of Virology76, 9060-9068(2002).[0024]15.Randall, R.E.&Goodbonrn, S.，Interferons and viruses:an interplaybetween induction， signalling， antiviral responses and virus countermeasures.Journal of General Virology89, 1-47(2008).[0025]16.Levy, D.E.&Garcia-Sastre, A.，The virus battles:IFN induction ofthe antiviral state and mechanisms ofviral evasion.Cytokine&Growth FactorReviewsl2, 143-156(2001).[0026]17.Hazzalin, C.A.&Mahadevan，L.C.，MAPK-regulated transcription:A continuously variable gene switch?Nature Reviews Molecular CellBiology3, 30-40(2002).[0027]18.Stephan Ludwig.1nfluenza viruses and MAP kinasecascades-Noveltargets for an antiviralintervention?SignalTransduction7, 81-88(2007).[0028]19.Pleschka, S.etal., Influenza virus propagation is impairedby inhibition of the Raf / MEK / ERK signalling cascade.Nature CellBiology3, 301-305(2001).
【發(fā)明內(nèi)容】

[0029]正是基于細(xì)胞自體防御功能在抗病毒過程中的重要作用，以及MAPK家族成員在這一過程中的不同分子效應(yīng)，本發(fā)明人設(shè)計了一種以JNK、p38和ERK分子為靶標(biāo)的抗病毒藥物篩選策略，并以此出發(fā)，對相關(guān)的小分子化合物進(jìn)行了功能篩選，進(jìn)而結(jié)合篩選結(jié)果的功能驗證，證實了這一篩選策略的有效。
[0030]1、本發(fā)明涉及一種以MAPK蛋白家族成員為靶標(biāo)篩選調(diào)節(jié)病毒活性的小分子化合物的方法，
[0031]所述的MAPK(Mitogen-activatedprotein kinase)蛋白家族是p38 (protein38)、JNK(JUN N-terminal kinase) >ERK(extracellular-signal-regulated kinase)蛋白或其磷酸化形式；
`[0032]所述的病毒優(yōu)選為RNA病毒，更優(yōu)選為流感病毒，最優(yōu)選為流感病毒HlNl株系；
[0033]所述的篩選方法為檢測目標(biāo)小分子對所述的MAPK蛋白家族成員的表達(dá)量或功能的調(diào)控效果，若，
[0034]①所述目標(biāo)小分子上調(diào)p38、JNK蛋白或其磷酸化形式，或下調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有抗病毒活性；
[0035]②所述目標(biāo)小分子下調(diào)p38、JNK蛋白或其磷酸化形式，或上調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有增強(qiáng)病毒活性的功能；
[0036]所述的篩選方法優(yōu)選為檢測目標(biāo)小分子對MAPK蛋白家族成員的表達(dá)量或功能的調(diào)控效果，若，
[0037]①所述目標(biāo)小分子上調(diào)p38、JNK蛋白或其磷酸化形式，且同時下調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有抗病毒活性，
[0038]②所述目標(biāo)小分子下調(diào)p38、JNK蛋白或其磷酸化形式，且同時上調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有增強(qiáng)病毒活性的功能。
[0039]所述的小分子化合物包括但不限于，天然小分子化合物、人工合成的小分子化合物，寡肽及其類似物、多糖及其類似物、天然及人工合成的小分子寡聚物，優(yōu)選為天然存在的黃酮母核的小分子化合物或人工合成的黃酮母核的結(jié)構(gòu)類似物。
[0040]2、本發(fā)明還涉及由所述的篩選方法篩選得到調(diào)節(jié)病毒活性的小分子化合物，
[0041 ] 所述的小分子化合物的優(yōu)選結(jié)構(gòu)式為，
[0042]
【權(quán)利要求】
1.一種以MAPK蛋白家族成員為靶標(biāo)篩選調(diào)節(jié)病毒活性的小分子化合物的方法，所述的 MAPK 蛋白家族成員為 p38 (protein38) > JNK(JUN N-terminal kinase)、ERK(extracellular-signal-regulated kinase)蛋白或其磷酸化形式。
2.權(quán)利要求1所述的篩選方法，其特征在于，所述的病毒優(yōu)選為RNA病毒，更優(yōu)選為流感病毒，最優(yōu)選為流感病毒HlNl株系。
3.權(quán)利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，所述方法為檢測目標(biāo)小分子對所述的MAPK蛋白家族成員的表達(dá)量或功能的調(diào)控效果，若， ①所述目標(biāo)小分子上調(diào)P38、JNK蛋白或其磷酸化形式，或下調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有抑制病毒活性的功能； ②所述目標(biāo)小分子下調(diào)P38、JNK蛋白或其磷酸化形式，或上調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有增強(qiáng)病毒活性的功能。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的篩選方法，其特征在于，所述方法為檢測目標(biāo)小分子對所述的MAPK蛋白家族成員的表達(dá)量或功能的調(diào)控效果，若， ①所述目標(biāo)小分子上調(diào)P38、JNK蛋白或其磷酸化形式，且同時下調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有抑制病毒活性的功能， ②所述目標(biāo)小分子下調(diào)P38、JNK蛋白或其磷酸化形式，且同時上調(diào)ERK蛋白或其磷酸化形式的表達(dá)量或功能時，則判定該化合物具有增強(qiáng)病毒活性的功能。
5.權(quán)利要求1-4所述方法篩選獲得的具有調(diào)節(jié)病毒活性的小分子化合物，其特征在于，所述小分子化合物不是已知結(jié)構(gòu)的黃酮類天然小分子化合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的小分子化合物，其特征在于，所述的小分子化合物的結(jié)構(gòu)通式為:.。麻Rs ο 其中，Rl為H或苯基、鄰甲氧苯酚基、對苯甲醚基、鄰二苯甲醚基、對苯酚基取代基，R2為H或0R4或苯基、鄰甲氧苯酚基、對苯甲醚基、鄰二苯甲醚基、對苯酚基、多元環(huán)糖及其寡聚物取代基，R3為羥基或H，R4為H或多元環(huán)糖及其寡聚物取代基，wOvC 或占3 O 其中，Rl為苯基、鄰甲氧苯酚基、對苯甲醚基、鄰二苯甲醚基、對苯酚基取代基，R2為H，R3為羥基，R4為H或多元環(huán)糖及其寡聚物取代基。
7.權(quán)利要求1-4所述方法篩選獲得的小分子化合物在制備同時調(diào)節(jié)MAPK家族中多個蛋白的功能的制劑中的應(yīng)用。
8.權(quán)利要求1-4所述方法篩選獲得的小分子化合物在制備激活細(xì)胞自體防御功能的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P31/16GK103667420SQ201310611605
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月28日
【發(fā)明者】梁偉, 董文娟, 張春玲, 魏秀莉, 黃峰 申請人:中國科學(xué)院生物物理研究所