一種用于糖尿病預(yù)防、保護(hù)和治療的重組蛋白rxRegX的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組蛋白rxRegX，用于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療。重組蛋白rxRegX包括：(1)，氨基酸序列與基本序列(SEQ NO.1)同源性比對結(jié)果≥60％的蛋白；(2)，以“(1)”中涉及的蛋白為基礎(chǔ)拆分后的短肽；(3)，以“(1)”和“(2)”中涉及的蛋白或短肽的修飾后產(chǎn)物。利用編碼重組蛋白rxRegX的cDNA序列構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)，制備重組蛋白rxRegX。重組蛋白rxRegX能夠在體外實(shí)驗(yàn)中促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖、抵抗凋亡和壞死；在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中抵抗胰島β細(xì)胞凋亡、促進(jìn)β細(xì)胞再生，發(fā)揮對糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療作用。本發(fā)明利用重組蛋白rxRegX抵抗胰島β細(xì)胞凋亡和壞死、促進(jìn)β細(xì)胞再生，是對現(xiàn)有糖尿病藥物在胰島β細(xì)胞的維護(hù)治療方面空缺的補(bǔ)充，有利于全方位地進(jìn)行對糖尿病的治療，從根本上改善糖尿病人自身胰島素分泌量的不足。
【專利說明】
一種用于糖尿病預(yù)防、保護(hù)和治療的重組蛋白rxRegX
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體涉及一種能夠用于糖尿病預(yù)防、保護(hù)和治療的重 組蛋白rxRegX。
【背景技術(shù)】
[0002] Reg蛋白家族(Regenerating protein family)是在研究胰腺炎和胰島增殖過程 中發(fā)現(xiàn)的，其成員包括小鼠源的7種（mRegl、mReg2、mReg3a、mReg30、mReg3 y、mReg35和 mReg4)、大鼠源的5種（rRegl、冰683<1、冰6830、冰6835和冰684)以及人源的5種蛋白（111^區(qū)1 a、hReglf3、hReg3f3、hReg3y和hReg4)。以上Reg家族蛋白在序列和結(jié)構(gòu)上存在高度相似性， 由160~170個氨基酸構(gòu)成，其中C端含有一個f丐型凝集素結(jié)構(gòu)域(C-type lectin domain)， 約120個氨基酸殘基，是媽依賴的碳水化合物識別結(jié)構(gòu)域（Carbohydrate Recognition Domains) ;N端含有20多個氨基酸長度的信號肽，能夠通過旁分泌或自分泌途徑控制細(xì)胞增 殖和分化。Reg家族蛋白約含有28個保守的氨基酸殘基位點(diǎn)，包括6個半胱氨酸構(gòu)成分子內(nèi) 二硫鍵，穩(wěn)定其相似的蛋白質(zhì)構(gòu)象。Reg家族蛋白作為類營養(yǎng)因子能夠刺激多種細(xì)胞和組織 增殖再生，抵抗毒性損傷和疾病的發(fā)生發(fā)展。Regl(PTP或PSP)和Reg3S(INGAP)是最早發(fā)現(xiàn) 的Reg家族成員，能夠促進(jìn)胰島0細(xì)胞的增殖和分化。其他Reg蛋白也被證明對胰島0細(xì)胞的 增殖和存活產(chǎn)生積極作用。然而，開發(fā)Reg家族蛋白做為潛在的藥用重組蛋白，用于糖尿病 的治療尚屬空白。
[0003] 糖尿病是一種嚴(yán)重危害人類生命和生活質(zhì)量的疾病。隨著現(xiàn)代醫(yī)療科技的發(fā)展， 依賴藥物治療、血糖監(jiān)測、胰島素工程以及對疾病認(rèn)識的加深，人類在糖尿病治療領(lǐng)域取得 了很大進(jìn)步。然而，目前針對糖尿病治療的廣譜藥物只能暫時(shí)性控制血糖，且始終存在藥物 耐受和胰島素依賴等癥狀，難以徹底根治。其慢性并發(fā)癥如糖尿病腎病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、視 網(wǎng)膜病變等也不能得到很好解決。無論在自身免疫引起的1型糖尿病或胰島素耐受的2型糖 尿病中，胰島0細(xì)胞數(shù)量的減少和功能缺失將最終導(dǎo)致糖代謝功能紊亂。目前能夠有效維持 胰島辟田胞數(shù)量和功能的主要途徑包括胰島移植、干細(xì)胞療法以及內(nèi)源性辟田胞的存活和再 生。前兩者受到胰島供體和干細(xì)胞研究水平的限制，而如何誘導(dǎo)內(nèi)源性0細(xì)胞的存活和再生 是具有極大前景的研究方向。有研究表明在動物實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用合適的刺激能夠促進(jìn)胰島M田 胞增殖。例如，一些生長因子如肝細(xì)胞生長因子(HGF)和胰高血糖素樣肽-l(GLP-l)能夠刺 激0細(xì)胞增殖，但無法長期有效維持0細(xì)胞的數(shù)量。而Reg家族蛋白，一方面能夠通過多種信 號通路上調(diào)細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)0細(xì)胞增殖；同時(shí)還能抑制線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡途 徑，阻抑13細(xì)胞凋亡和壞死。這可能是Reg家族蛋白長期有效維持13細(xì)胞數(shù)量和功能的根本所 在。此外，在本發(fā)明中首次發(fā)現(xiàn)重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)和其同源性彡60%的家族成員 以及經(jīng)拆分的短肽和修飾后產(chǎn)物，能夠誘導(dǎo)外分泌腺細(xì)胞轉(zhuǎn)化再生為胰島素產(chǎn)生細(xì)胞，即 潛在的辟田胞，可能進(jìn)一步產(chǎn)生胰島結(jié)構(gòu)。
[0004]綜上所述，重組蛋白rxRegX具有較為保守的序列和結(jié)構(gòu)，能夠促進(jìn)胰島0細(xì)胞增 殖、抵抗凋亡和壞死，進(jìn)而有效維持胰島0細(xì)胞數(shù)量和功能，可用于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治 療。介于重組蛋白rxRegX用于糖尿病領(lǐng)域的開發(fā)尚屬空白，本發(fā)明選擇保護(hù)自主開發(fā)制備 的重組蛋白rxRegX用于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 發(fā)明目的：
[0006] 本發(fā)明提供了一種重組蛋白rxRegX，能夠促進(jìn)胰島辟田胞增殖、抵抗凋亡和壞死， 促進(jìn)0細(xì)胞再生，用于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療，從根本上改善糖尿病人由于胰島0細(xì)胞數(shù) 量和功能缺陷引起的自身胰島素分泌量的不足。
[0007] 技術(shù)方案：
[0008] 一種用于糖尿病預(yù)防、保護(hù)和治療的重組蛋白rxRegX。
[0009] 所述重組蛋白rxRegX的氨基酸序列包括但不限于SEQ NO. 1。
[0010] 所述重組蛋白rxRegX的氨基酸序列包括但不限于SEQ NO.2~3,其特征在于與SEQ NO. 1同源比對結(jié)果彡60 %的任一蛋白。
[0011] 所述重組蛋白rxRegX的氨基酸序列包括但不限于SEQ N0.4~7,其特征在于是上 述任一蛋白的拆分短肽。
[0012] 所述重組蛋白rxRegX包括上述所有涉及蛋白和短肽的修飾后產(chǎn)物。
[0013] -種分離的核酸，編碼上述所有涉及的蛋白和短肽。
[0014] 一種表達(dá)載體，含有上述的核酸。
[0015] -種表達(dá)宿主細(xì)胞，含有上述的表達(dá)載體。
[0016] 一種包涵體蛋白提取、親和層析純化和復(fù)性方法，用于重組蛋白rxRegX的制備。 [0017]上訴任一項(xiàng)涉及的重組蛋白rxRegX的生物學(xué)活性驗(yàn)證。
[0018]具體來說，本發(fā)明通過常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)獲得多種Reg家族蛋白的 cDNA序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒;轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)宿主，ImM異丙基硫代半乳糖苷（IPTG)誘導(dǎo)重 組蛋白表達(dá);利用包涵體提取的一般方法獲得包涵體重組蛋白，溶于8M的尿素溶液中，過鎳 親和層析柱進(jìn)行純化；隨后用聚丙稀酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE)、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)和高效液相色譜(HPLC)方法鑒定重組蛋白rxRegX純度。通過噻唑藍(lán)(MTT)和Western blot檢測重組蛋白rxRegX促進(jìn)小鼠胰島素瘤(MIN6)和人胰腺癌(PANC-1)細(xì)胞增殖的作用； 細(xì)胞周期和Western blot方法驗(yàn)證其調(diào)控相關(guān)周期蛋白表達(dá)的作用;細(xì)胞流式方法證明重 組蛋白rxRegX能有效抵抗鏈脲菌素(Stz)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死。同時(shí)，本發(fā)明建立了小鼠 胰島損傷模型，證明重組蛋白rxRegX能夠顯著控制血糖和體重，維持小鼠的生命狀態(tài)，甚至 促進(jìn)0細(xì)胞的再生。
[0019] 有益效果：
[0020]本發(fā)明提供了一種有活性的重組蛋白rxRegX，說明了其氨基酸序列特征。重組蛋 白rxRegX具有生物學(xué)活性和藥用價(jià)值，其能夠促進(jìn)胰島0細(xì)胞增殖、抵抗凋亡和壞死，維持 胰腺內(nèi)胰島辟田胞的數(shù)量和功能，促進(jìn)辟田胞再生。因此，對重組蛋白rxRegX的開發(fā)可能有利 于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療。
[0021]本發(fā)明提供了一種制備重組蛋白rxRegX的方法。利用大腸桿菌表達(dá)宿主可降低生 產(chǎn)成本，包涵體表達(dá)重組蛋白有利于提高產(chǎn)量，鎳親和層析提高純化效率，通過此方法能最 終獲得有活性的重組蛋白rxRegX。
【附圖說明】
[0022] 圖1是重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)表達(dá)工程菌構(gòu)建的電泳圖。其中圖1A描述PCR擴(kuò) 增獲得重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)編碼基因基因，目的基因大小約為500bp;圖1B描述重組 蛋白rxRegX(SEQ N0 ? 1)基因插入pET-28a的表達(dá)質(zhì)粒圖。
[0023]圖2是重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)表達(dá)、純化和鑒定的電泳圖和曲線圖。其中圖2A 描述SDS-PAGE檢測重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)的表達(dá)和純化復(fù)性結(jié)果，泳道1為未誘導(dǎo)菌 液，泳道2為IPTG誘導(dǎo)后菌液，泳道3為純化復(fù)性后的重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1);圖2B描述 重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)的WB檢測結(jié)果，泳道1為陰性對照，泳道2為重組蛋白rxRegX (SEQ NO. 1);圖2C描述安捷倫1200高效液相色譜系統(tǒng)鑒定純化復(fù)性后重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)的純度，BSA為外參。
[0024]圖3是MTT鑒定重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促細(xì)胞增殖活性的柱狀圖。圖3A描述重 組蛋白rxRegX( SEQ NO. 1)促進(jìn)MIN6細(xì)胞增殖；圖3B描述重組蛋白rxRegX( SEQ NO. 1)促進(jìn) PANC-1細(xì)胞增殖。
[0025] 圖4是Western Blot鑒定重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)激活細(xì)胞增殖相關(guān)信號通路 的免疫印跡圖。描述了重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促進(jìn)Erkl/2、Akt和ATF-2的磷酸化，其中 泳道Ctrl為陰性對照，其余泳道代表不同檢測時(shí)間。
[0026] 圖5是重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)促進(jìn)細(xì)胞周期的流式檢測圖和Western Blot鑒 定重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)激活細(xì)胞周期相關(guān)信號通路的免疫印跡圖。描述了 10nM和 100nM的重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)能夠促進(jìn)細(xì)胞越過G1期進(jìn)入S期和G2期，同時(shí)這種作用 主要是上調(diào)Cyclin D1和CDK4的表達(dá)量而完成的，其中Ctrl為陰性對照。
[0027]圖6是重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)抵抗鏈脲菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和凋亡的流式檢 測圖。描述了l〇〇nM的重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)能夠有效減少鏈脲菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死 和晚期凋亡，其中Normal代表正常細(xì)胞群；Early Apop to tic代表早期凋亡細(xì)胞群；Late Apoptotic代表晚期凋亡細(xì)胞群;Necrotic代表壞死細(xì)胞群;Annexin V-FITC和PI是兩種細(xì) 胞標(biāo)記染料。
[0028] 圖7是Western Blot鑒定重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)對細(xì)胞壞死和凋亡相關(guān)信號 通路影響的免疫印跡圖。描述了重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)能夠上調(diào)Bcl-2和Bcl-xL的表 達(dá)抵抗細(xì)胞壞死和凋亡，同時(shí)促進(jìn)Akt和JNK的磷酸化維持細(xì)胞活力并促進(jìn)細(xì)胞分化。
[0029]圖8是重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促進(jìn)原代胰島增殖的柱狀圖。描述了使用100nM 的重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)孵育原代胰島對胰島細(xì)胞生長的促進(jìn)作用。
[0030] 圖9是小鼠造模和給藥后血糖和體重變化的折線圖。其中圖9A描述了小鼠經(jīng)過鏈 脲菌素造模后，血糖持續(xù)上升至大約18mm〇l/L(第6天)并進(jìn)入平臺期，在平臺期血糖變化不 大，而經(jīng)過重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)給藥保護(hù)的小鼠，造模4天后血糖水平始終維持在 15mmol/L以下，低于鏈脲菌素造模組；圖9B描述了小鼠經(jīng)過鏈脲菌素造模后，體重快速下 降，共減少約8.5g，而重組蛋白rxRegX( SEQ NO. 1)給藥保護(hù)的小鼠，體重下降緩慢，僅約 3.5g〇
[0031] 圖10是血清胰島素含量測定的柱狀圖。描述了造模和給藥對血清胰島素含量變化 的影響，其中鏈脲菌素造模組血清中胰島素含量較低，而重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)保護(hù) 組血清胰島素含量雖然低于正常組但高于造模組，說明重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)對于維 持血清胰島素較為重要。
[0032]圖11是重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)降低致死率的折線圖。描述了重組蛋白rxRegX (SEQ NO. 1)能夠維持糖尿病模型小鼠的存活。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 實(shí)施例1:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)表達(dá)菌的構(gòu)建：
[0034] 全基因合成編碼重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)的DNA序列，PCR擴(kuò)增并引入限制性內(nèi) 切酶位點(diǎn)，插入表達(dá)載體。PCR反應(yīng)體系如下：
[0036]引物序列，限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)Ndel和Xhol(標(biāo)注下劃線部分)如下：
[0037] 上游引物 CTAGTGCATATGGAAGACTTCCAGAAGGAAGTGC
[0038] 下游引物CAGTCGCTCGAGCTACTGCTTGAACTTGCAGACA
[0039] PCR反應(yīng)程序?yàn)?開始94°C3分鐘，然后進(jìn)行35個循環(huán)(94°C15秒，60°C30秒，72°C1 分鐘），最后72°C2分鐘結(jié)束反應(yīng)。取10此產(chǎn)物用于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0040] PCR產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)雙酶切并純化后，應(yīng)用T4連接酶室溫連接過夜。將過夜連 接的pET28a-rxRegX(SEQ NO. 1)表達(dá)載體通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞 內(nèi)。抗性篩選獲得陽性菌落，雙酶切鑒定和測序鑒定是否有正確的序列插入載體，將含有正 確pET28a-rxRegX( SEQ NO. 1)插入序列的表達(dá)載體和其菌液保存于-80 °C冰箱。
[0041 ]質(zhì)粒抽提擴(kuò)增pET28a-rxRegX(SEQ NO. 1)表達(dá)載體，化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入T7 Expression E.coli表達(dá)菌，抗性篩選含有pET28a_rxRegX(SEQ NO. 1)的T7 Expression E. col i菌落，將菌液于-80 °C保存。
[0042] 實(shí)施例2:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)的表達(dá)、純化和鑒定：
[0043] 接種重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)表達(dá)菌于37°C培養(yǎng)，待0D值到0.4~0.6左右，加 入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)表達(dá)。取誘導(dǎo)發(fā)酵9小時(shí)的菌液，離心收集菌體沉 淀，每克菌體中加入20mL細(xì)胞裂解液I、200yL ImM PMSF、400yL 20mg/mL溶菌酶，攪拌30分 鐘使菌體裂解完全。超聲破碎20分鐘待菌體不再粘稠，12000rpm離心收集rxRegX(SEQ N0.1)包涵體沉淀。將該包涵體用細(xì)胞裂解液II+l%Trit〇n-100重懸洗滌2次，雙蒸水洗滌1 次，離心獲得洗滌后的rxRegX(SEQ NO. 1)包涵體，每克用20ml 8M尿素溶解5小時(shí)以上，應(yīng)用 鎳柱親合層析純化。純化后的rxRegX(SEQ NO. 1)包涵體蛋白進(jìn)行透析復(fù)性，逐步去除尿素 和巰基乙醇，并加入還原型谷胱甘肽和氧化型谷胱甘肽幫助重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1) 復(fù)性。復(fù)性后重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)溶解于roS溶液中進(jìn)行凍干保存。最后，蛋白純品 經(jīng)過SDS-PAGE、Western blot和HPLC鑒定，在相應(yīng)分子量處條帶單一，純度可達(dá)97.6%。 [0044] 實(shí)施例3:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促進(jìn)細(xì)胞增殖
[0045] 將MIN6和PANC-1細(xì)胞鋪至96孔板中（2500個cells/孔），細(xì)胞貼壁后的時(shí)間為0h， 分別在0、24、48h向培養(yǎng)基中加入重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)和roS空白，重組蛋白rxRegX (SEQ N0.1)給藥設(shè)置濃度梯度，終濃度分別為lnM、10nM、100nM和500nM。在第0、24、48、72小 時(shí)使用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)能夠促進(jìn)MIN6 和PANC-1細(xì)胞增殖，并且存在濃度和時(shí)間依賴性，具有類營養(yǎng)因子的特性。
[0046] 根據(jù)MTT的結(jié)果，確定合適的重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)給藥劑量。在給藥后0、 15、30、45、6〇!^11收集細(xì)胞，提取胞內(nèi)總蛋白，如8七6?1131(^檢測￡41/2、厶肚438和厶了卩-2的 磷酸化，最后應(yīng)用灰度分析解析條帶。重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)能夠有效促進(jìn)Erkl/2、 Akt、p38和ATF-2的磷酸化。加入Akt、Erkl/2和p38的抑制劑，抑制其磷酸化作用，MTT檢測發(fā) 現(xiàn)，抑制劑的加入能夠阻抑重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)的促增值活性。Western blot檢測 加入蛋白抑制劑后Akt、Erkl /2等蛋白的磷酸化水平受到抑制。
[0047] 實(shí)施例4:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促進(jìn)細(xì)胞周期
[0048] 將MIN6和PANC-1細(xì)胞鋪至6孔板中（106個cells/孔），待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基換為 1 % FBS+低糖DMEM，饑餓24h后，向培養(yǎng)基中加入1 OnM和100nM重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)和 陰性對照PBS。加藥24h后，收集細(xì)胞用roS洗滌兩次后，20%乙醇固定過夜，之后應(yīng)用PI對細(xì) 胞進(jìn)行染色，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示細(xì)胞饑餓后加入PBS細(xì)胞被大量組 織在G1期，而加入重組蛋白rxRegX (SEQ NO. 1)的細(xì)胞G1期的比例明顯下降，G2期的比例明 顯提高，重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)能夠促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞越過G1/S期的能皇，進(jìn)入G2期。 Western blot檢測細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和⑶K4的表達(dá)量的變化發(fā)現(xiàn)，重組蛋白 rxRegX(SEQ N0.1)能夠上調(diào)周期相關(guān)蛋白Cyclin D1和⑶K4的表達(dá)量，從而促進(jìn)加快細(xì)胞 周期。
[0049] 實(shí)施例5:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)抵抗鏈脲菌素誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和壞死
[0050] 將MIN6細(xì)胞鋪至6孔板中（106個cells/孔），細(xì)胞貼壁后分別在0小時(shí)和16小時(shí)向 培養(yǎng)基中加入重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)和陰性對照PBS，給藥劑量為終濃度100nM。20小 時(shí)后向培養(yǎng)基中加入終濃度為10mM的鏈脲菌素，4小時(shí)后收集細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞兩次后應(yīng) 用Annexin V-FITC和PI進(jìn)行雙標(biāo)記，檢測細(xì)胞凋亡和壞死情況。FlowJo7.6.1軟件分析顯 示，只加入鏈脲菌素的細(xì)胞大部分處于凋亡晚期和壞死;加入重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1) 能夠明顯減少凋亡晚期和壞死細(xì)胞的比例，少量細(xì)胞被阻抑于凋亡早期。
[00511根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)流程，在第24小時(shí)提取胞內(nèi)總蛋白，Western blot檢測和灰度分析 發(fā)現(xiàn)重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)能夠上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bcl-xL的表達(dá)，從而抑制 細(xì)胞壞死；能夠促進(jìn)Akt和JNK的磷酸化，從而維持細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞分化；能夠抑制 Caspase-3的水解，從而抑制細(xì)胞凋亡。
[0052]實(shí)施例6:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)促進(jìn)原代胰島增殖
[0053]小鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，75%乙醇消毒，于無菌條件下膽總管內(nèi)插入4.5號頭 皮針，經(jīng)膽總管向胰腺中逆流灌注入預(yù)冷的膠原酶V溶液。待整個胰腺膨脹，迅速摘取完整 的胰腺組織放入無菌離心管中，38°C水浴中靜止消化lOmin。振蕩使其成為細(xì)砂狀，充分分 散胰腺組織后加入小牛血清和Hanks液終止消化。將上述消化液過40目的篩網(wǎng)，流出液離心 用Hanks液洗滌2次。向細(xì)胞沉淀中加入25%Ficoll溶液混勻，其上依次分別加入23%、 20%、ll%Ficoll溶液，離心后吸出23%~20%和20%~11%界面的胰島，用Hanks液洗滌2 次。提取的原代胰島置于20%FBS的RPMI1640高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)待用。將胰島鋪至24孔板中 (20個/孔），每24小時(shí)向培養(yǎng)基中加入重組蛋白rxRegX( SEQ NO. 1)和陰性對照roS，給藥劑 量設(shè)置濃度梯度。4~8天后用BrdU法檢測胰島細(xì)胞增殖情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，終濃度100nM 的重組Reg3a蛋白能夠促進(jìn)原代胰島的生長。
[0054]實(shí)施例7:重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)對糖尿病小鼠的保護(hù)作用 [0055] 6~8周齡的健康雄性BALB/c小鼠飼養(yǎng)至體重25g以上后，進(jìn)行預(yù)保護(hù)，即尾靜脈每 天注射一次重組蛋白rxRegX(SEQ N0.1)(100yg/kg)和roS陰性對照。預(yù)保護(hù)5天后，饑餓過 夜，腹腔注射150mg/kg的鏈脲菌素(一般1周左右，陰性對照組隨機(jī)三次測量血糖值在11~ 35mmol/L即認(rèn)為造模成功）。同時(shí)設(shè)置空白組（僅生理鹽水）和僅重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)給藥組(不注射鏈脲菌素）。造模后每2~3天監(jiān)測小鼠血糖和體重變化。造模后第15天 小鼠眼眶取血，檢測血清中胰島素的含量;摘取胰腺組織用福爾馬林固定過夜，蠟塊包埋切 片，胰島素抗體免疫組化顯色后，拍照并統(tǒng)計(jì)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞面積占胰腺總面積百分比、密 度，以及胰島素產(chǎn)生細(xì)胞細(xì)胞簇(包括胰島或新生胰島素產(chǎn)生細(xì)胞形成的細(xì)胞團(tuán)）的密度、 大小進(jìn)行比較，結(jié)果如下表，初步判斷重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)促進(jìn)胰島素產(chǎn)生細(xì)胞新 生。同時(shí)TUNEL檢測重組蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)能夠明顯減少胰島細(xì)胞內(nèi)的細(xì)胞凋亡。重組 蛋白rxRegX(SEQ NO. 1)對糖尿病小鼠具有保護(hù)作用，該作用的機(jī)制主要是抑制胰島辟田胞 的壞死和凋亡，促進(jìn)胰島0細(xì)胞的新生。
[0056]表7.1.胰島免疫組化的統(tǒng)計(jì)分析
[0058] 實(shí)施例8:重組蛋白^1^8乂(3￡〇從).2~7)的構(gòu)建表達(dá)和純化：
[0059] 重組蛋白^1^8乂(3￡〇勵.2~7)的構(gòu)建表達(dá)和純化與重組蛋白^1^8乂(3￡〇^).1) 的制備相似，最終均通過透析復(fù)性獲得有活性的純度較高的重組蛋白rxRegX(SEQ N0.2~ 7)。其中重組蛋白rxRegX(SEQ腸"~了丨通過奶^實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了促細(xì)胞增殖活性：重組蛋白 ^1^8乂(3￡〇^).3)能夠抑制胰島0瘤細(xì)胞的壞死和凋亡；重組蛋白^1^8乂(3￡〇勵.2)能夠 在體內(nèi)明顯降低糖尿病小鼠的血糖。具體重組蛋白 rxRegX(SEQ NO. 2~7)與rxRegX(SEQ NO. 1)的比較見下表。
[0060]表8.1.重組蛋白^1^8乂（5￡0從).2~7)與^1^8乂（5￡0從).1)的比較
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組蛋白rxRegX，用于糖尿病的預(yù)防、保護(hù)和治療。2. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX氨基酸序列包括但不限于SEQ NO. 1。3. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX包括但不限于SEQ N0.2~3，其特征在于，與SEQ NO. 1序列比對同源性彡60%。4. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX包括但不限于SEQ NO. 4~7，其特征在于，是以SEQ NO. 1同源性彡60 %的序列為基礎(chǔ)拆分的短肽。5. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX包括以上氨基酸序列的修飾后產(chǎn)物。6. 根據(jù)權(quán)利要求1，用于制備重組蛋白rxRegX的表達(dá)系統(tǒng)，包括編碼重組蛋白rxRegX的 DNA、含有該DNA的表達(dá)載體以及含有插入該DNA表達(dá)載體的宿主菌。7. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX用于糖尿病的預(yù)防，其特征在于，用于生理指標(biāo)輕 微變化或近期發(fā)生的糖尿病前驅(qū)病理狀態(tài)，防止胰島損傷導(dǎo)致的糖尿病病情發(fā)展。8. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX用于糖尿病的保護(hù)，其特征在于，用于糖尿病發(fā)病 各個時(shí)期，抑制胰島損傷引起的糖尿病病情惡化。9. 根據(jù)權(quán)利要求1，重組蛋白rxRegX用于糖尿病的治療，其特征在于，用于糖尿病發(fā)病 各個時(shí)期，促進(jìn)胰島再生阻抑甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病發(fā)展惡化。
【文檔編號】C07K14/47GK105968183SQ201610462902
【公開日】2016年9月28日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】羅晨, 王旻, 庾璐婷, 李想, 張志遠(yuǎn)
【申請人】中國藥科大學(xué)