一種hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法，該方法通過設計hFGF21靶位點引物并合成sgRNA寡核苷酸鏈序列，然后構建重組慢病毒質粒，獲得重組慢病毒轉染細胞，穩(wěn)定敲除hFGF21基因，獲得hFGF21基因敲除人肝細胞株；本發(fā)明方法簡單，sgRNA靶向性好，敲除效率高。
【專利說明】
一種hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法
技術領域
[0001 ]本發(fā)明涉及生物技術領域，具體涉及hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法。
【背景技術】
[0002] 成纖維細胞生長因子(Fibroblast growth factor，FGF)作為一大類多肽分子可 以與細胞膜上的受體特異性地結合并發(fā)揮生物學功能。到目前為止該家族已有22個成員被 發(fā)現，其中hFGF21就是人類FGF亞家族中的重要成員?，F有的研究表明，FGF21是新發(fā)現的一 種參與糖脂代謝過程調控的細胞因子并與糖脂代謝密切相關，主要在肝臟組織中形成高表 達。人FGF21蛋白質序列有210個氨基酸組成，包括前端的28個氨基酸的信號肽序列和后段 182個氨基酸序列的成熟肽，該基因位于al，2-墨角藻糖基轉移酶基因5-側翼區(qū)。人FGF21蛋 白與肝素不能特異性地直接結合，這也是它在FGF家族中比較特殊的一個特點，即使在肝素 的參與下hFGF21也不能與可溶性的FGF受體（Fibroblast growth factor receptors, FGFRs)直接結合。但如果有配體ffilotho存在的情況下，FGF21便可以穩(wěn)定地結合FGFRs，進 而激活FGF的信號通路并在體內發(fā)揮調控糖脂代謝的相關生物學功能。
[0003]近年來發(fā)現，FGF21在內分泌系統(tǒng)中可以有效調控各種內分泌功能來促進糖脂代 謝，對治療代謝綜合癥方面，如2型糖尿病，有很大的發(fā)展?jié)摿?。早?005年就有研究發(fā)現 FGF21能明顯增加人脂肪細胞葡萄糖吸收，既不依靠于胰島素作用調節(jié)也不依賴外源性肝 素的作用，這與胰島素的快速作用是不同，FGF21促進細胞的葡萄糖攝取是獨立的，并且此 項研究發(fā)現了 FGF21蛋白的半衰期雖然較短，但是與胰島素相比較藥效發(fā)揮的時間卻相對 很長。這為FGF21稱為治療2型糖尿病的新型靶點藥物提供了可能性。而隨著科技的進步，人 們對健康問題的研究也越來越多。有研究者發(fā)現，FGF21可以抑制小鼠和猴對糖的偏好。這 是FGF21配合在中樞神經系統(tǒng)中的配體ffilotho來降低大腦中多巴胺的獎賞通路而進行作 用的，同時另有美國的科學家表示這種FGF21促進細胞對單糖的吸收作用主要是肝臟分泌 的FGF21進行作用。這個癥狀與2型糖尿病人愛吃甜食，飲酒而引起的發(fā)病癥狀不謀而合，又 為臨床上2型糖尿病的治療提供了新思路。而FGF21的作用遠不止于糖代謝。近期有研究表 明FGF21可以結合代謝和免疫系統(tǒng)來防止胸腺的損傷，從而達到延長壽命的效果。這樣看 來，FGF21的功能似乎很多，但沒有全然研究清楚。所以，對于FGF21基因的功能研究，就顯得 尤為重要。
[0004] CRSRP_Cas9體系是一種近幾年來流行的基因組修飾技術，因其操作方便，進行基 因編輯的效率更高，更易得到純合的突變體并且可以進行多位點突變而受到人們的青睞。 CRISPR系統(tǒng)原本是細菌用來抵御外界侵襲的免疫反應系統(tǒng)，全稱為規(guī)律成簇的間隔短回文 重復序列（Clustered Regylarly Interspaced Short Palindromic Repeats)，最早是在 1987年日本科學家們意外發(fā)現基因的編碼區(qū)附近有規(guī)律的間隔重復序列，且該區(qū)域附近還 存在一段短序列，而這時他們正在研究大腸桿菌編碼的堿性磷酸酶基因，之后的科學家又 發(fā)現細菌的CRISPR系統(tǒng)可以在轉移組織外源的質粒，或在細菌免疫方面發(fā)揮作用。2013年 科學家發(fā)現并利用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，在多種細胞的特定基因位點上進行基因編輯。
[0005] 慢病毒載體是由一些逆轉錄病毒改造而來的，以假病毒顆粒的形式攜帶外源基因 進入宿主細胞內，可以把外源基因整合到宿主細胞基因組中，由于慢病毒顆粒是一種臨時 組裝的假病毒顆粒，只有一次感染能力，不能在宿主細胞內擴增，因此感染后宿主細胞不會 產生CPE現象而導致細胞死亡，同時因外源基因在被感染細胞基因組中形成穩(wěn)定表達并可 穩(wěn)定傳代。同時，由于慢病毒載體系統(tǒng)不具備增殖的能力，它對機體的免疫原性很低，因此 這也是慢病毒載體作為基因治療和特定基因表達細胞株構建研究以及轉基因動物制備等 的常用工具的原因。故而，利用lenti-CRISPR-V2慢病毒系統(tǒng)，構建的人肝細胞HL7702的 hFGF21基因穩(wěn)定敲除細胞株，意在為今后研究hFGF21基因的功能及其可能作為糖尿病靶點 藥物和基因治療方面的研究做進一步的準備。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明目的在于提供hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法，通過構建人肝細胞 HL7702的hFGF21基因穩(wěn)定敲除細胞株。
[0007] 本發(fā)明通過下列技術方案實現本發(fā)明目的：
[0008] 1、sgRNA靶點設計及其寡核苷酸鏈的合成
[0009] 根據NCBI發(fā)布的hFGF21編碼區(qū)序列，尋找啟動子后富含NGG的序列區(qū)域，應用 http://crispr.mit .edu/網站設計了 2對針對hFGF21的sgRNA序列，采用如下引物分別合成 sgRNA寡核苷酸鏈序列sgRNA2、sgRNA3
[0014] 2、lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒構建及鑒定
[0015] 對lenti-CRISPR-V2質粒的BsmBI酶位點進行酶切，然后將步驟（1)的2個SgRNA寡 核苷酸鏈互補序列退火分別連接在酶切后的lenti-CRISPR-V2質粒上，將連接產物轉化到 STBL3感受態(tài)細胞中，鑒定構建成功，獲得2個lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒； [0016] 3、lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒的制備及鑒定
[0017]按常規(guī)方法制備:運用polyf ect-v試劑和opti-DEME培養(yǎng)基，將2個質粒分別轉入 三個不同圓盤的293T細胞中，培養(yǎng)8-12h后換液，再培養(yǎng)至轉染的48h后，可以收集培養(yǎng)液， 得到慢病毒顆粒，將慢病毒顆粒進行濃縮，獲得慢病毒顆粒sgRNA2、sgRNA3;
[0018] 4、穩(wěn)定敲除hFGF21的人肝細胞株構建及篩選
[0019] 以8yg/mL的聚凝胺（polybrene)來使慢病毒顆粒sgRNA2和慢病毒顆粒sgRNA3同時 感染HL7702細胞;在感染細胞24h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞;最后用嘌呤霉素來 篩選感染細胞，獲得hFGF21基因敲除人肝細胞株；
[0020] 5、穩(wěn)定敲除hFGF21的人肝細胞株的鑒定。
[0021]本發(fā)明具備的優(yōu)點及效果：
[0022]糖尿病是一種綜合代謝疾病，是由于胰島素功能異常而導致的非調控性血糖升高 而引起的一系列并發(fā)癥。而FGF21基因是新發(fā)現的一種參與糖脂代謝過程調控的細胞因子 并與糖脂代謝密切相關。它可以獨立于胰島素信號通路來調控血糖吸收，降低血糖。而 FGF21的功能研究卻鮮有報道，故而對FGF21的功能研究成為該領域的熱點。本次研究獲得 的hFGF21基因穩(wěn)定敲除的人肝細胞株是第一次被構建出來，這對FGF21功能的研究提供了 很重要的技術支持，使我們開展以FGF21基因作為治療糖尿病靶點的研究成為可能。
[0023] 本發(fā)明經嘌呤霉素逐代篩選已形成穩(wěn)定的細胞株，經Western Blot鑒定，sgRNA2 和sgRNA3組合實驗方案的HL7702細胞的hFGF21蛋白已經完全不表達;證明本發(fā)明真實可 與巨〇
【附圖說明】
[0024] 圖1為本發(fā)明中l(wèi)enti-CRISPR-V2-sgRNAl重組慢病毒質粒測序結果；
[0025] 圖2為本發(fā)明中l(wèi)enti-CRISPR-V2-sgRNA2重組慢病毒質粒測序結果；
[0026] 圖3為本發(fā)明中l(wèi)enti-CRISPR-V2-sgRNA3重組慢病毒質粒測序結果；
[0027]圖4為包裝慢病毒48h后收獲的病毒原液及濃縮液檢測，其中1:水為陰性對照；2: 慢病毒質粒sgRNAl為陽性對照;3:慢病毒濃縮液sgRNAl; 4:慢病毒濃縮液sgRNA2; 5:慢病毒 原液sgRNA3; 6:慢病毒原液sgRNA2; 7:慢病毒原液sgRNAl; M: Maker DL2000;
[0028] 圖5為加入嘌呤霉素篩選48h后的HL7702細胞狀態(tài)，其中a圖：lenti-v2-crispr/ cas9重組慢病毒感染的細胞，僅可見部分圓形死亡細胞，大部分存活;b圖：正常培養(yǎng)的細 胞，全部死亡；
[0029] 圖6為Western blot檢測敲除hFGF21的人肝細胞株結果，sgRNA2+sgRNA3實驗組能 高效敲除hFGF21基因。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明，但本發(fā)明保護范圍不局限于 所述內容，實施例中使用的試劑和方法，如無特殊說明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。
[0031] 實驗材料:293T細胞、人肝細胞HL7702、質粒、大腸桿菌菌株STBL3均為中國醫(yī)學科 學院醫(yī)學生物學研究所GLP實驗室保存。
[0032] 主要試劑：BsmBI限制性內切酶、Bradgord蛋白檢測試劑盒購于TAKARA公司，2χ PCR mix購于Tiangen公司，病毒DNA/RNA提取試劑盒購于Axygen公司，小量質粒提取試劑盒 購于Omega公司，預染全藍蛋白Maker、快速預染蛋白電泳系統(tǒng)和Western blot半干轉系統(tǒng) 購于Bio-rad公司，Opti-MEM、高糖DMEM、胎牛血清和雙抗購于Gibco公司，慢病毒包裝試劑 盒和濃縮試劑盒均購于廣州GeneCopoeia公司，Polybrene購于Sigma公司，鼠抗GAPDH單克 隆抗體、兔源二抗購于碧云天公司，兔抗hFGF21單克隆抗體、鼠源二抗購于abcom公司，化學 發(fā)光HRP底物試劑盒購于Millipore公司，噪呤霉素購于solarbio公司。引物合成均由 TaKaRa公司完成。
[0033]實施例1 :sgRNA靶點設計及其寡核苷酸鏈的合成
[0034] 應用]11^口://(31^8口1'.1]1；[1:.6(111/網站設計了3對針對11?6?21的881?祖序列。設計方法 如下：（1)根據NCBI發(fā)布的hFGF21編碼區(qū)序列，尋找啟動子后富含NGG的序列區(qū)域，并提交至 http://crispr.mit. edu/網站。（2)根據網站給出的結果的得分，選擇得分較高并且可能的 突變堿基離PAM位點較遠的一對序列作為sgRNA候選序列。根據載體說明書在sgRNA互補序 列兩端分別加上相應的酶切位點，即在每條sgRNA序列的F鏈的5'端加 CACC，另外在每條 sgRNA序列的R鏈的5'端加上AAAC，這可以與lenti-CRISPR-V2質粒經BsmBI酶切后形成的黏 性末端形成互補。需要注意的是，如果sgRNA序列F鏈的5'端的開頭的第一個堿基不是G，那 么應該人為地添加在CACC的后面，然后在其互補的R鏈的3'端就要增加一個C。
[0035] hFGF21靶位點及sgRNA寡核苷酸鏈序列
[0042]將sgRNA的退火引物按如下體系進行退火合成sgRNA寡核苷酸鏈，將表內各成分混 合均勻后，煮沸5min，自然冷卻后于-20°C保存。
[0043] 退火體系：
[0045] 實施例2: lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒構建及鑒定 [0046] 1、酶切及連接
[0047] 按酶切體系對lenti-CRISPR-V2質粒在BsmBI酶位點進行酶切，將各成分充分混合 均勻后，于37°C水浴加熱40min后，得到帶有粘性末端慢病毒質粒載體。隨后按連接體系將 sgRNA分別連接在慢病毒質粒載體上，將各成分混合均勻后，在16°C下反應16h后得到 lenti-CRISPR-V2-sgRNA 重組慢病毒質粒。
[0048] 酶切體系
[0050]連接體系
[0052] 2、感受態(tài)細胞的制備
[0053] (1)_80°C保存的用STBL3甘油菌解凍，在無抗生素的LB瓊脂平板上劃線，置于細菌 培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)16h。次日挑取LB瓊脂平板上的白色單克隆菌落，放入5ml的無抗生素的 LB 培養(yǎng)液中 250rmp/min、37°C 搖菌 16h。
[0054] (2)然后把lmL以上菌液轉接到100mL無抗生素的LB培養(yǎng)液中250rmp/min、37 °C搖 菌2h左右，觀察培養(yǎng)液的細菌濃度，若有少量菌體出現即可判斷已經進入對數生長期并收 菌。
[0055] (3)此時將100mL菌液移至預冷的50mL離心管中，冰浴lOmin。
[0056] (4) 10000g、4°C、lOmin離心，然后棄上清;再把10mL預冷的0 · lmol/L的CaC12加入 50mL的離心管中，為防止細胞破裂用移液管輕輕重懸沉淀，并立即冰浴30min。
[0057] (5)冰浴30min后10000g、4°C、10min離心，然后棄上清；按初始培養(yǎng)液每25mL加入 200μ1 80%甘油和lmL預冷的O.lmol/L的CaC12,并輕輕重懸細胞沉淀，此時并可按100μΙ/ 管的量將感受態(tài)細胞分裝，_80°C凍存?zhèn)溆谩?br>[0058] 3、轉化
[0059] (1)把100μ1的STBL3感受態(tài)細胞置于冰上，再把20μ1的連接產物加入感受態(tài)細胞 中（若是純質粒轉化則加 UU)，輕輕混勻后，立即冰浴45min。
[0060] (2)冰45min后，立即放入42 °C的水浴鍋中熱激90s。
[0061 ] (3)熱激90s后再立即冰浴3min。
[0062] (4)然后加入800μ1無抗生素的LB培養(yǎng)液，混勻后先37°C水浴30min，再轉至37°C的 恒溫搖床250rpm/min搖菌30min。
[0063] (5)搖菌結束后10000g、2min離心，棄部分上清，剩余約100μ1培養(yǎng)液輕輕將沉淀重 懸，再把重懸液轉入LB瓊脂平板(含100yg/mL氨芐青霉素)上均勻涂布，把培養(yǎng)皿倒置于37 °C細菌培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。
[0064] (6)次日觀察平板，若有單克隆菌落長出，并可挑菌，搖菌。
[0065] 4、質粒小量抽提及測序鑒定
[0066] 將慢病毒系統(tǒng)的攜帶叫1^^1、881?^2、881?^3重組慢病毒質粒和包裝質粒?8?八12 和PMD2. G分別轉化擴增。根據Biomiga去內毒素質粒小量抽提試劑盒說明書進行質粒抽提， 具體實驗操作步驟如下：
[0067] (1)實驗前需準備：
[0068] a、首先把RNaseA進行適當離心，然后全部加入BufferAl中混勻，并置于4°C保存；
[0069] b、在使用前加入60mL無水乙醇到DNA Wash Buffer中混勾；
[0070] c、Buffer B1若產生沉淀可于50°C水浴中加熱至沉淀溶解，且用完要扭緊瓶蓋； [0071] cUBuffer N3若低于10°C會產生沉淀可于37°C水浴中加熱至沉淀溶解;所有離心 操作均在室溫下進行。
[0072] (2)操作步驟：
[0073] a、分別對以上各個質粒進行轉化，把相應的單克隆菌挑到5mL LB培養(yǎng)基(含100μ g/mL氨節(jié)青霉素）中250rmp/min、37°C搖菌16h。
[0074] b、菌液以10000g、lmin離心，棄上清，收集菌體沉淀。
[0075] c、把250μ1 Buffer A1加入沉淀中，充分重懸沉淀。
[0076] d、再把250μ1預熱Buffer B1加入以上的重懸液中，反轉5-10次輕輕混合均勻，室 溫靜置2_5min直至看到溶液粘稠澄清透明。
[0077] e、然后再加入60μ1預熱Buffer N3,立即反轉5-10次充分混勻并可看到白色絮狀 沉淀，13000rpm、20min室溫離心。
[0078] f、小心把上清移至新的1.5mL離心管中，加入上清液1倍體積的Buffer RET和無水 乙醇250μ1，充分混勻。
[0079] g、把700μ1的以上混合溶液加入到DNA吸附柱內的收集管中，13000rpm、20s室溫離 心，棄濾液，再把剩下的混合溶液加入到DNA吸附柱內的收集管中重復此步驟，直至全部溶 液轉移完畢。
[0080] h、然后把500μ1 Buffer KB加入到吸附柱內，13000rpm、lmin室溫離心，棄濾液。
[0081 ] i、再把500μ1 DNA Wash Buffer加入到吸附柱內，13000rpm、20s室溫離心，棄濾 液，并重復進行以上步驟。
[0082] j、最后把60μ1 Elution Buffer小心懸空滴入吸附柱內，再把吸附柱內置于新的 離心管內，室溫靜置孵育2min，13000rpm、lmin室溫離心，把濾液重新吸回到吸附柱內，重復 以上步驟，即質粒提取完畢。
[0083]重組質?；驕y序結果顯示，插入在質粒酶切位點之間的片段與預期一致，證明 lenti-CRISPR-sgRNAl，lenti-CRISPR-sgRNA2，lenti-CRISPR-sgRNA3,重組質粒構建成功， 見圖1、2、3。
[0084]將構建好的重組慢病毒質粒各取15μ1測序，剩余的于_20°C保存。
[0085] 實施例3: lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒的制備及鑒定
[0086] 1、重組慢病毒的包裝
[0087]轉染前兩天，將用于包裝慢病毒的細胞293T細胞接種于15cm圓碟中，加入高糖 DEME完全培養(yǎng)基(89 %高糖DMEM、10 % FBS，1 %雙抗)在5 % C02、37 °C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根 據細胞的生長速度及時觀察，當細胞進入對數生長期且密度達到70%_80%便可進行慢病 毒質粒的共轉染。按下列體系配制A、B兩管混合液，將兩管混合液分別混勻后，將B管加入A 管中，混勻，靜置20min后，將細胞中原培養(yǎng)基吸出更換為新鮮培養(yǎng)基，按實驗分組分別沿壁 加入AB混合液后，在5 % C02、37 °C細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8至12h后，棄原來的培養(yǎng)基并更換為新 鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0088]慢病毒包裝混合液配制 [0089] A管（重組慢病毒質粒）
[0091] B管(轉染試劑）
[0092] Polyfect-V 60μ1
[0093] 〇pti-DEME 1440μ1
[0094] 共1500μ1;
[0095] 2、慢病毒原液的收集與濃縮
[0096] 在轉染48h后吸出細胞培養(yǎng)基于新的15mL離心管內，500g、4°C、10min離心，上清即 為重組慢病毒原液;把上清液小心轉入超濾管中，3000g、4°C、20min離心，收集濃縮柱中液 體，即為重組慢病毒濃縮液液，重組慢病毒濃縮液分裝后可于-80°C可長期保存。
[0097] 3、慢病毒顆粒的PCR鑒定
[0098]用AXYGEN病毒DNA/RNA提取試劑盒提取慢病毒原液及濃縮液中的慢病毒RNA，具體 步驟如下：
[0099] (D實驗前準備：
[0100] a、根據試劑盒說明書在Byffer W1A和Byffer W2concentrate中加入相應體積的 無水乙醇；
[0101 ] b、配制含1 %冰乙酸的異丙醇溶液，室溫密閉貯存。
[0102] (2)操作步驟：
[0103] a、取慢病毒原液或濃縮液200μ1加入新的1.5mL離心管內。
[0104] b、再加入Byffer V-L 200μ1，振蕩混勻，室溫靜置5min加入Byffer V-N 75μ1，再 振蕩混勾，然后12000g、5min離心；
[0105] c、將上清轉移到試劑盒內裝配的2mL離心管內，再加入含1%冰乙酸的異丙醇300μ 1，顛倒混勻；
[0106] d、然后將液體轉移到制備管里，6000g、lmin離心，棄濾液，繼續(xù)重復該步驟至液體 全部轉完；
[0107] e、之后加入Byffer W1A 500μ1，在室溫靜置lmin后，12000g、lmin離心，棄濾液；
[0108] f、接著加入Byffer W2 80(^1，1200(^、111^11離心。
[0109] g、把以上的制備管放回2mL離心管，12000g、lmin離心。
[0110] h、然后把制備管轉移至1.5mL新的離心管內，加入40μ1 Byffer TE到制備管中央， 室溫靜置孵育lmin，12000g、lmin離心洗脫DNA，把離心管內液體吸回重新加入到制備管中 央，重復以上步驟，1.5mL離心管內的液體即為RNA，-80 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0111] 將從慢病毒液中提取出來的總RNA用All-in-〇ne? First-Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒(GeneCopeia公司）進行逆轉錄，具體步驟如下:準備PCR小管， 按下列體系配制RNA-Prime Mix，將RNA-Prime Mix輕輕混勾，65°C的水浴lOmin，立即置于 冰上操作。
[0114] 按下列體系配制RNA逆轉錄反應的后續(xù)體系，然后37°C反應60min，85°C反應5min， 合成cDNA后-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0115] 逆轉錄反應體系如下：
[0117]以重組質?；蛐蛄袃啥藖碓O計引物，用多聚酶鏈式反應將提取的慢病毒基因組 進行擴增，進行2 %瓊脂糖凝膠電泳，觀察條帶大小。
[0118] CRISPR慢病毒鑒定引物序列（5' -3'）：
[0119] CRISPR 慢病毒鑒定 F: TGGAAGGACGAAACACCG
[0120] CRISPR 慢病毒鑒定 R: TCTTGCTGGGCACCTTGT;
[0121] PCR體系如下：
[0125] PCR擴增后經瓊脂糖凝膠電泳，相比于陽性對照（重組質粒），在包裝病毒后48h收 獲的病毒原液，有明顯的特異條帶，而且片段大小與預期的502bp-致(見圖4)。
[0126] 實施例4:穩(wěn)定敲除hFGF21的人肝細胞株構建及篩選
[0127] 1、HL7702細胞的復蘇、培養(yǎng)與傳代
[0128] (1)液氮凍存的正常人肝細胞系HL7702細胞37°C水浴中迅速解凍復蘇，離心后棄 凍存液，在高糖DMEM完全培養(yǎng)基中5 % C02、37 °C培養(yǎng)。
[0129] (2)觀察細胞的生長當細胞80%以上融合時，棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌殘余血清，加入 lmL胰酶消化細胞，在倒置顯微鏡下觀察，當大部分細胞收縮變圓時，棄胰酶加入完全培養(yǎng) 基終止消化，按1:3傳代。
[0130] 2、慢病毒顆粒感染HL7702細胞
[0131] (1)感染前一天，將生長狀態(tài)良好的HL7702細胞接種于24孔板內，待細胞密度達到 70 % -80 %時便可進行轉染，此時應該在24孔板上做好2個實驗組和對照組的標記。
[0132] (2)先將聚凝胺(polybrene)用培養(yǎng)基稀釋為8yg/mL備用。
[0133] (3)棄去實驗組細胞的舊培養(yǎng)基，加入已稀釋好的（polybrene)，再在每個實驗組 中先加入50μ1 sgRNA3慢病毒濃縮液。
[0134] (4)而后將50μ1 sgRNAl加入到標記有sgl+sg3的實驗組中，將50μ1 sgRNA2加入到 標記有sg2+sg3的實驗組中。對照組就以新鮮的完全培養(yǎng)基進行換液。
[0135] (5)輕輕搖動24孔板使重組慢病毒顆粒均勻分布，然后在5%C02、37°C培養(yǎng)24h后， 更換為新鮮的的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
[0136] 實施例5:穩(wěn)定敲除hFGF21的人肝細胞株的鑒定
[0137] 1、嘌呤霉素篩選hFGF21穩(wěn)定表達的HL7702細胞株
[0138] (1)在進行細胞篩選前應先進行嘌呤霉素最小致死量實驗：
[0139] a、提前培養(yǎng)好細胞密度長至80%的HL7702細胞儀24孔板內。
[0140] b、將lmL水加入100mg的白色粉末狀嘌呤霉素中，漩渦震蕩溶解后，在無菌間內用 0.22μπι的過濾嘴進行過濾。然后再取約10mL左右的細胞間無菌水，用相同濾嘴進行過濾備 用。
[0141] c、準備10個1.5mL的EP管，將濾好的無菌水900μ1/管加入EP管中，再加入100μ1溶 解好的嘌呤霉素溶液，配制為10mg/mL的嘌呤霉素貯存液，-20°C儲存。
[0142] d、查閱相關資料可以知道HL7702細胞對嘌呤霉素的最小致死量約在0.2yg/mL左 右。依此設計了嘌呤霉素梯度范圍。
[0143] e、在8mL的完全培養(yǎng)基中加入1.6mL嘌呤霉素貯存液，濃度為2mg/mL，設為A管;然 后把3mL A管中的溶液加入3mL完全培養(yǎng)基中，濃度為lmg/mL，設為B管。據后面梯度，做相應 稀釋。
[0144] f、設嘌呤霉素梯度(mg/mL)為：2，1·75，1·5，1·25，1，0·8,0·6,0·4,0·3,0·2,0·1， 〇,設1個副孔，以嘌呤霉素〇mg/mL設為正常對照組，將不同嘌呤霉素濃度的培養(yǎng)基以500μ1/ 孔的量加入相應組的24孔板細胞中，5 % C02、37 °C培養(yǎng)觀察。
[0145] g、48h后觀察發(fā)現培養(yǎng)的HL7702細胞嘌呤霉素最小致死量為0.3yg/mL。
[0146] (2)在慢病毒顆粒感染HL7702細胞5d后，用含0.3yg/mL嘌呤霉素(經最小致死量實 驗得出〇.3yg/mL為正常培養(yǎng)的HL7702細胞的最小致死量）的選擇培養(yǎng)基篩選陽性克隆。選 取空白對照組細胞全部死亡后實驗組存活的細胞為陽性克隆，挑取陽性單克隆細胞至含 0.3yg/mL嘌呤霉素培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)并進行持續(xù)篩選。
[0147] CRISPR/cas9敲除后則會帶有嘌呤霉素抗性基因篩選標記，加入0.3ug/mL的嘌呤 霉素后，正常HL7702細胞在48h后死亡，Ienti-v2-crispr/cas9感染的只有部分死亡，大部 分存活(見圖5)。
[0148] 2、穩(wěn)定敲除hFGF21的人肝細胞株的Western鑒定
[0149] (1)單層貼壁細胞蛋白提?。?br>[0150] a、待25T細胞培養(yǎng)瓶的嘌呤霉素抗性篩選的HL7702細胞和正常對照細胞長滿后， 棄培養(yǎng)基，用PBS洗滌兩遍，置于冰上。
[0151] b、在2mL蛋白裂解液中加入lOOmM的PMSF 20μ1和蛋白酶抑制劑4μ1，充分混勻后置 于冰上備用。
[0152] c、每瓶洗滌干凈的細胞加入400μ1上述配制好蛋白裂解液，放于冰上裂解30min。
[0153] d、裂解后把含有細胞碎片的裂解液移至新的1.5mL離心管中，12000rpm、4°C、5min 離心。
[0154] e、將上清液即為裂解后的蛋白，然后按需要分裝至干凈的離心管，-20°C凍存?zhèn)?用。
[0155] (2)用Bradford法蛋白質濃度測定試劑盒對各抽提細胞蛋白進行蛋白定量，具體 步驟如下：
[0156] a、BSA蛋白的濃度梯度制備:分別取6支新的1.5mL離心管，按下列體系進行配制。 BSA蛋白濃度梯度配制表
[0158] b、酶標板法測定位置樣品蛋白質濃度:將樣品用蒸餾水做適當稀釋(若樣品濃度 超過標曲范圍，則測定的濃度會不準確，因此應該把較高濃度的蛋白進行一定程度的稀 釋），在酶標板上選擇相應數量的孔，分別加上以上制備的0-5號管中不同濃度的蛋白質溶 液和相應的樣品稀釋液各20μ1，然后各孔中分別加入200μ1 Bradford試劑輕輕混勻，把酶 標版置于37°C靜置lOmin。以所制備的0號管為空白對照組，在酶標儀上測出相應各個孔的 A595的平均吸光度值，再以1-5號管的A595平均吸光度值為縱坐標，與之相對應的蛋白質濃 度作為橫坐標，繪制出標準曲線。根據樣品稀釋液A595的平均吸光度值對標準曲線上的蛋 白質濃度，乘以稀釋倍數，即為樣品蛋白質濃度。
[0159] (3)將需要檢測的蛋白質按體積4:1比例加入5x loading Byffer混勾，100°C處理 5-10min，放4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0160] (4)利用Bio-Rad進行預染快速SDS-PAGE，以18yg/孔的蛋白樣品量上樣。以225V電 泳30min。然后以2.5A、25V恒電流半干轉轉移至PVDF膜上（5min)(注意避免氣泡產生，要用 玻璃棒將氣泡趕出轉運體系外）。以1 %TBST配制的5 %BSA室溫封閉lh，加入以1:1000稀釋 的兔抗hFGF21 (abcom公司）或以1:2000稀釋的鼠抗GATOH抗體(碧云天公司），4 °C孵育過夜。 次日用1 % TBST以10min/次，洗膜3次;然后以兔源1:2000和鼠源1:5000稀釋的二抗室溫孵 育lh，再用1 % TBST以10min/次，洗膜3次。將膜豎直在濾紙上吸走殘留的TBST后，將化學發(fā) 光HRP底物試劑A、B液按1:1充分混勻，加在PVDF膜表面，然后進行發(fā)光顯色拍照。相比于正 常HL7702細胞，實驗組sg2+sg3的的蛋白沒有表達，而實驗組sgl+sg3的蛋白表達量幾乎相 同（見圖6)。


【主權項】
1. 一種hFGF21基因敲除人肝細胞株的構建方法，其特征在于，方法如下： (1) 采用如下引物分別合成sgRNA寡核苷酸鏈序列sgRNA2、sgRNA3 hFGF21 sgRNA2 F: caccgGAGACCGGGTTCGAGCACTC R: aaacGAGTGCTCGAACCCGGTCTCc, hFGF21 sgRNA3 F: caccgGGAAACTCACCGATCCATAC R: aaacGTATGGATCGGTGAGTTTCCc； (2) lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒構建 對lenti-CRISPR-V2質粒的BsmBI酶位點進行酶切，然后將步驟（I)的2個sgRNA寡核苷 酸鏈序列分別連接在酶切后的lenti-CRISPR-V2質粒上，將連接產物轉化到STBL3感受態(tài)細 胞中，鑒定構建成功，獲得2個lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒； (3 ) I ent i -CRI SPR-V2-sgRNA重組慢病毒的制備 按常規(guī)方法將步驟(2)獲得的2個lenti-CRISPR-V2-sgRNA重組慢病毒質粒分別轉入細 胞中，培養(yǎng)，收集培養(yǎng)液，濃縮獲得慢病毒顆粒sgRNA2、sgRNA3; (4)敲除hFGF21的人肝細胞株構建 以濃度8yg/mL的聚凝胺來使慢病毒顆粒sgRNA2和慢病毒顆粒sgRNA3同時感染HL7702 細胞;在感染細胞24h后，更換新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細胞;最后用嘌呤霉素來篩選感染細 胞，獲得hFGF21基因敲除人肝細胞株。
【文檔編號】C12N5/071GK105950541SQ201610450913
【公開日】2016年9月21日
【申請日】2016年6月21日
【發(fā)明人】張瑩, 魯帥堯, 胡婧雯, 馬開利, 江勤芳, 高家紅, 黃璋瓊, 吳正存, 李云, 李聰, 杜廷福
【申請人】中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所