專利名稱：促肝細(xì)胞生長素生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種促肝細(xì)胞生長素，特別是分子量小于8000道爾頓的促肝細(xì)胞生長素的生產(chǎn)方法，屬于生物制品藥物生產(chǎn)方法的領(lǐng)域。
為臨床搶救重癥肝炎及治療慢性活動型肝炎，國內(nèi)外許多學(xué)者正在積極探索胎肝細(xì)胞治療機(jī)理及進(jìn)行提取其有效成分的研究。1975年Labrecgue等首先報(bào)道了從大鼠肝臟中提取一種肝再生刺激物質(zhì)(HepiticStimulatorSubstance，Hss)，建立了一種經(jīng)典的提取方法。Demetriou等于1978年對此種物質(zhì)做了進(jìn)一步的探索，并稱其為“肝細(xì)胞生長促進(jìn)因子”。
Labregue制備HSS的經(jīng)典方法是(1)取動物肝臟加入35%的予冷生理鹽水，將組織搗碎、勻漿、破碎細(xì)胞。
(2)在水浴中迅速將勻漿液加熱至95℃保持1.5分鐘。
(3)27000g高速離心30分鐘。取上清液加6倍體積的冷乙醇4℃攪拌2小時，27000g高速離心20分鐘，棄去上清液，沉淀用雙蒸水溶解至原液量即為粗制HSS。該制品僅見用于HGF的性質(zhì)、作用研究，因動物來源的HSS中含有大量的大分子雜質(zhì)不能用于人體。近年來，有些學(xué)者，將此細(xì)胞因子命名為肝細(xì)胞生長因子(HepatatocyteGrcwthFactor，HGF)。HGF是一類具有特異性促進(jìn)肝細(xì)胞再生的物質(zhì)，可分為大分子量(大于11萬)，中分子量(2～6萬)，小分子量(小于2萬)，由于大分子量和中分子量的HGF均屬于蛋白質(zhì)類物質(zhì)，容易使受者產(chǎn)生過敏反應(yīng)，很難在臨床上使用，而目前國內(nèi)外學(xué)者都重點(diǎn)從事于大分子量和中分子量HGF的研究，因此較長時間徘徊于動物實(shí)驗(yàn)階段。1989年，我國廣州空軍醫(yī)院首先改進(jìn)了Labrecque等的傳統(tǒng)制備方法，采用負(fù)壓透析法，并以乳豬新鮮肝臟為原料，制備了分子量小于12000道爾頓，含有HGF的多肽類物質(zhì)，并命名為肝細(xì)胞生長素(HGF)。在臨床試用過程中取得了較好的療效。廣州空軍醫(yī)院生產(chǎn)HGF(透析法)的步驟是1、將新鮮乳豬肝臟去外膜及韌帶，切碎。
2、按固體與液體的比例1∶3加入蒸餾水，在組織搗碎機(jī)中打碎10000轉(zhuǎn)/分×3分鐘，共打碎7次，每次間隔5分鐘。
3、3000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，取上清液。
4、選用截留分子量12000的透析袋，將離心后上清液裝入透析袋中，每袋不超過500毫升，透析袋內(nèi)外溶液按1∶2，在4℃無菌條件下壓抽濾透析8小時以上。本品含蛋白質(zhì)0.6～0.7毫克/毫升。
5、收集透析外液，低溫抽干濃縮，使每毫升溶液含蛋白質(zhì)不應(yīng)低于5毫克，每瓶分裝4毫升。
6、凍干、封口用此方法生產(chǎn)HGF制劑主要有以上幾點(diǎn)不足，(1)HGF收率低;(2)單位體積的多肽濃度低，給制劑工藝帶來困難;(3)分子量偏大，在使用過程中容易出現(xiàn)過敏反應(yīng);(4)生產(chǎn)過程容易污染熱原和細(xì)菌，生產(chǎn)環(huán)境要求高。(5)生產(chǎn)周期長。
本發(fā)明的目的是要提供一種HGF收率高、單位體積多肽濃度大、分子量小、生產(chǎn)過程不易污染、生產(chǎn)周期較短的方法。
本發(fā)明的目的是如此實(shí)現(xiàn)的以新鮮豬肝為原料，采用以下步驟生產(chǎn)HGF1、加入蒸餾水初攪后細(xì)胞破碎勻漿與水浴加熱同時完成，再將勻漿液迅速置于冰鹽浴中冷卻;
2、離心及過濾澄清;
3、將澄清液進(jìn)行第一次超濾;
4、將超濾液加入賦形劑后進(jìn)行第二次超濾，收集分子量8000道爾頓以下組分5、分裝凍干。
由于采用上述方法，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)采用初攪后，加熱與勻漿同時進(jìn)行的新工藝，可使細(xì)胞在短時間內(nèi)破碎勻漿，一次處理量大，比勻漿器法可提高工作效率8倍，適合大規(guī)模生產(chǎn)的需要。并且在勻漿時加熱，解決了固體液體比例，由1∶3增加到1∶1，提高了單位體積的蛋白含量。同時使熱不穩(wěn)定蛋白質(zhì)沉淀、變性，離心后去除，為成品的熱穩(wěn)定性好，保存時間長打下了基礎(chǔ)。經(jīng)多次實(shí)驗(yàn)證明，使用本法肝細(xì)胞可達(dá)到100%的破碎。在勻漿過程中加熱，還可殺死一部分細(xì)菌。同時，使用二步超濾工藝亦可有效的除去制品中的熱原質(zhì)和殘留細(xì)菌，因而本工藝在半無菌條件下即可生產(chǎn)，降低了對環(huán)境的要求。(2)首次使用切相流超濾器制備HGF。我們采用美國Milipore超濾設(shè)備，經(jīng)多次生產(chǎn)證明，無論是大分子的分離和除菌、除熱原效果，還是對保持HGF的良好的生物活性都是可靠的。(3)首次選用收分子量8000道爾頓以下的組份作為HGF制劑成分。肝細(xì)胞生長素是一種含有多種肽類的混合物，而起關(guān)鍵作用的是HGF分子，因此，HGF的分子量測定則成為HGF制劑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。國內(nèi)外報(bào)導(dǎo)HGF的分子量測定結(jié)果不一，但均在10000道爾頓以上，因此，廣州空軍醫(yī)院選用的透析袋是截留分子量12000道爾頓。由于該制劑是自異體的動物臟器提取的多肽成份，含有芳香族氨基酸，有微弱的半抗原性，對個別T細(xì)胞功能缺陷患者可能發(fā)生過敏反應(yīng)。面制品分子量大，大分子雜多肽成分也就多。我們在研究中發(fā)現(xiàn)HGF分子量實(shí)際小于8000道爾頓，是在7500道爾頓左右，進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明8000～12000道爾頓的成分中幾乎沒有HGF的活性成分，因而小分子的HGF幾乎全部在8000以下組分中。這一發(fā)現(xiàn)使我們最終確定使用8000道爾頓的超濾膜進(jìn)行截留，與透析法相比排除了12000～8000道爾頓之間的大分子雜多肽成分，使產(chǎn)品更加純化。本發(fā)明提供的分子量小于8000道爾頓的促肝細(xì)胞生長素(以下簡稱8HGF)制劑，經(jīng)氨基酸組成分析表明，其中色氨基、酪氨酸和苯氨酸含量顯著低于用透析法生產(chǎn)的HGF，(以下簡稱12HGF)，此外紫外光譜分析也證明，在相同含量的情況下，8HGF在280nm處時的光密度值低于12HGF在相同波長下的吸收值，說明8HGF含有較少的芳香族氨基酸。這一結(jié)果與aa組成分析相吻合，由于8HGF具有較小的分子量，且含有較少的芳香族aa，因此發(fā)生過敏反應(yīng)的可能性大大降低，同時，急性毒性實(shí)驗(yàn)指出，8HGF的半數(shù)至死量LD為3000～3500毫克/公斤，而12HGF的DL2100～2475毫克/公斤，由此可以看出8HGF制劑較12HGF更為安全可靠。我們采用8000道爾頓的截留分子量，不但大大提高了HGF的純度而且又排除了相對大分子的多肽成分，大大降低了過敏反應(yīng)的發(fā)生可能性，因此也大大降低了制劑的抗原性。保持藥物的療效的同時，長期使用無不良反應(yīng)。(4)在制備8HGF過程中采用兩步超濾法，增加了控制過程，減少了細(xì)菌污染的機(jī)會，縮短了制備時間，特別適合于大規(guī)模生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本，對防止生物制品的熱原，提高產(chǎn)品的純度均為非常有利。
8HGF是最后保留8000道爾頓以下有效物質(zhì)的生產(chǎn)工藝而得到的，除測得多肽含量外，尚含有少量的DNA、RNA和糖類等成分和一定量的游離aa。特別指出的是本品中還含有有利于肝病恢復(fù)的高于正常人血清水平15倍左右的Zn和微量的Se,這些成分與12HGF含量基本相同，8HGF的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)指出，HGF95℃加熱2分鐘不失去活性是熱穩(wěn)定性蛋白質(zhì)(多肽)。實(shí)驗(yàn)證明8HGF在4℃二年不失去活性，室溫3個月活性仍保持在90％以上。而12HGF，4℃保存為12個月，室溫保存為一個月，表明8HGF較12HGF熱穩(wěn)定性提高了。尤其在4℃下保存期長更加有利于臨床使用，并為生產(chǎn)、銷售過程中保證制品的質(zhì)量提供了保證。
綜上所述，本工藝加熱勻漿同時一步完成，采用二步超濾技術(shù)，采用截留分子量8000道爾頓多肽成分，所建立的HGF制備方法在國內(nèi)外均為首次。本工藝克服了透析法的不足是目前生產(chǎn)HGF最有效的方法。
分子量8HGF制劑與12HGF制劑性能比較1、利用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳、層析色譜分析，8HGF主帶主要在7500道爾頓左右，平均分子量在7000道爾頓左右，12HGF平均分子量為10650道爾頓。
2、紫外吸收光譜紫外光譜分析證明，在相同含量的情況下，8HGF在280nm處時的光密度值明顯低于12HGF在相同波長下的吸收值，說明8HGF含有較少的芳香族氨基酸。
3、高壓液相色譜測定的組成分析結(jié)果表明8HGF制劑中色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、芳香族氨基酸明顯低于12HGF。
4、活性測定結(jié)果幾種方法制備的HGF制劑均無種屬特異性，而具有器官特異性。8HGF刺激小白鼠DNA合成增加率與12HGF結(jié)果無明顯差別。
5、藥效學(xué)分析在模擬動物肝衰模型中，在增加動物存活率、改善肝功能指標(biāo)等方面，8HGF、12HGF均取得相同結(jié)果。
6、急性毒性試驗(yàn)8HGF的半數(shù)致死量LD為3000～3500毫克／公斤，12HGF的LD為2100～2475毫克／公斤。
7、急性毒性、過敏、細(xì)菌、熱原符合中國藥典90版規(guī)定。
實(shí)施例1、將新鮮乳豬肝去外膜及韌帶、洗凈，在不銹鋼膠體磨中按固體與液體之比等于11加入蒸餾水，初攪1分鐘后，通95℃循環(huán)水，水浴加熱循環(huán)攪打1.5分鐘(細(xì)胞全部破碎)使細(xì)胞勻漿。將勻漿液迅速置于冰鹽浴中冷卻至4℃。
2、在4℃下離心3000轉(zhuǎn)／分×20分鐘，取上清液，利用0.3微米的薄膜過濾澄清。
3、澄清液用美國Milipore超濾器，截留分子量10000道爾頓，收集分子量10000道爾頓以下組分，超濾速度50～500毫升／分。
4、將超濾液按比例加入4％的甘露醇作為賦形劑溶解后再用8000道爾頓的超濾膜截留8000～10000道爾頓之間組分，收集8000道爾頓以下的多肽成分，本品每毫克含蛋白質(zhì)不少于10毫克。
5、分裝、凍干、質(zhì)檢。
權(quán)利要求
1.一種促肝細(xì)胞生長素，特別是分子量小于8000道爾頓的促肝細(xì)胞生長素的生產(chǎn)方法，以新鮮乳豬肝為原料，其特征是1.A、加蒸餾水初攪后細(xì)胞破碎勻漿與水浴加熱同時完成，再將勻漿液迅速置于冰鹽浴中冷卻，然后1.B、離心及過濾澄清，1.C、將澄清液進(jìn)行第一次超濾，1.D、將超濾液加入賦形劑后進(jìn)行第二次超濾，收集分子量8000道爾頓以下組分，1.E、分裝、凍干。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是勻漿時固體與液體的比例可以是1∶1，加熱溫度可以是95℃，攪拌時間可以是1.5分鐘，冷卻溫度可以至4℃。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是離心操作溫度可以是4℃，轉(zhuǎn)速可以是3000轉(zhuǎn)/分，時間可以是20分鐘，過濾膜可以是0.3微米。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是第一次超濾膜截留分子量可以是10000道爾頓，超濾速度可以是50～500毫升/分。
全文摘要
一種促肝細(xì)胞生長素生產(chǎn)方法，屬于生物制品藥物生產(chǎn)方法領(lǐng)域。其特點(diǎn)是采有二步超濾技術(shù)截留分子量8000道爾頓的多肽成分，并且將細(xì)胞破碎勻漿與水浴加熱同時完成。此方法克服了現(xiàn)有技術(shù)生產(chǎn)的同類藥品所含多肽濃度低、制造中收率低以及使用中容易出現(xiàn)過敏反應(yīng)等缺陷。特別適用于臨床搶救重癥肝炎或治療慢性活動型肝炎。
文檔編號C07K1/34GK1085803SQ9211132
公開日1994年4月27日 申請日期1992年10月20日 優(yōu)先權(quán)日1992年10月20日
發(fā)明者馬骉, 姜桂榮 申請人:空軍第四研究所