專利名稱：促肝細胞生長素注射液及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域。具體涉及促肝細胞生長素注射液及制備方法和應用。
背景技術：
早在七十年代初，人們發(fā)現實驗性切除大鼠肝臟的2/3或手術切除大部分損傷的人體肝臟后只需7-10天就可使肝臟恢復到原體積大小并自行停止；同時胚胎肝勻漿注入肝損傷鼠體內可明顯促進肝細胞再生，因此認為在體內存在某種物質調節(jié)細胞的再生。1973早LaBrecque從大鼠再生肝臟中提取一種肝再生促進物質，將70％肝部分切徐后殘余的成年大鼠肝細胞制備勻漿并高速離心，從上清液中提取的物質可明顯刺激單層培養(yǎng)的正常大鼠肝細胞DNA合成增加，并命名為“肝刺激物質(Hepatic Stimulator Substance，HSS)。Goldberg從大鼠部分肝切除后的殘余肝組織提純的肝再生因子在體內可使肝細胞DNA合成增加3-4倍；Starzl在狗的再生肝中亦發(fā)現類似物質。Russell等和鹽田邦郎等證明血小板內的肝再生因子也促進肝細胞DNA合成顯著；同步和彥等在肝部分切除后48小時的大鼠小腸粘膜的可溶性成份中提取的肝再生因子與肝組織中的肝再生因子不同；謝明等從人胎肝細胞中提取的人胎肝再生因子具有較強的促進鼠肝細胞DNA合成的作用。廣州空軍醫(yī)院陳光明等從乳豬肝中提取的“肝細胞生長素(HGF)”應用于臨床治療各種肝炎患者有較好的療效。因此，到目前已發(fā)現一系列物質均能促進肝細胞DNA合成，調節(jié)肝細胞再生，其來源不同，有肝源性、血小板源性和腸源性；分子量等理化性質亦不相同，甚至同一來源不同方法的制備的物質也有差別，所以命名有不同，如“肝細胞再生因子”、“肝細胞生長素(HGF)”、“促肝生長素(Hepatopoietin，HPP)”、“肝刺激物質(HepaticStimulator Substance，HSS)”、“DNA合成促進因子(DNA SynthesisPromoter)”，關于這類物質分子量的報導相差較大，坪內博仁等從暴發(fā)性肝炎病人血液中經Sephadex G-200分離后測其分子量為230000；Goldberg等從大鼠血漿中分離后其分子量約為38000；LaBrecque從乳鼠肝臟提取的HSS分子量為1-2萬；陳光明制備的乳豬HCF分子量為10685，無論其分子量大小，他們都有其生物活性，使肝細胞DNA合成增加。
肝臟再生因子的研究在國內外都報道很多，但應用于臨床研究的很少，目前，國內廣州空軍醫(yī)院研制的“肝細胞生長素HGF”已初步應用于臨床治療各種肝病患者，為低分子量多肽，有一定的治療效果。
病毒性肝炎在我國是常見病、多發(fā)病、其死亡率高，目前無理想的治療藥物，嚴重影響人們的生命健康。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是采用優(yōu)化的方法從乳豬肝中提取活性高、純度理想的促肝細胞生長素，提供一種療效確切的治療肝病藥物。
本發(fā)明公開了一種含促肝細胞生長素注射液，所述的肝細胞生長素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質，該蛋白質由15種氨基酸組成，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/ml；主要活性組份蛋白質分子量為2.1萬道爾頓，占總蛋白含量的60％以上，具有較高的刺激肝細胞DNA合成的活性。
所述的組成蛋白質的15種氨基酸為Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。
本發(fā)明所述促肝細胞生長素注射液為每毫升含蛋白質15-25μg、pH6.0-8.0的水針或凍干粉針。
本發(fā)明所要解決的另一技術問題是公開上述促肝細胞生長素注射液的制備方法。
本發(fā)明公開的促肝細胞生長素注射液是通過將乳豬肝勻漿、攪拌、加熱、過濾、吸附、洗脫、除鹽、除菌、分裝獲得的。該注射液具體通過下述技術方案制得1.勻漿取經洗滌后的乳豬肝先在攪肉機上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿。
2.攪拌把勻漿置于提取罐內，按比例加入提取液，比例為1∶3W/V，同時以慢速攪拌一小時。
3.加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達到95℃時停止加熱，并在此溫度點上保持15-20分鐘。
4.過濾加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過濾的方式進行固液分離，保留濾液。
5.提純5.1.上樣把經固液分離得到的濾液以10升/時的流速上樣至已經裝好、并經平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上樣量為柱體積的6倍。
5.2.洗脫上樣完畢后，分別用A、B洗脫液進行分段洗脫，并收集B液洗脫峰。
5.3.除鹽用超濾膜超濾器除鹽；6.半成品檢定用Lowry法測定蛋白質含量，用注射用水調整其含量，使之為15-25μg/ml；用pH計測定pH值，調節(jié)pH值為6.0-8.0；控制氯離子濃度小于1.0mmol/L；7.除菌用0.2μ微孔濾器進行除菌過濾。
9.分裝，即得水針劑或冷凍干燥得凍干粉針，4℃以下保存。
本發(fā)明制備中所述的提取液為pH值7.6，0.02M的磷酸鹽緩沖液(PBS)；所述的A洗液是指含氯化鈉0.28M的PBS溶液；所述的B洗液是指含氯化鈉0.65M的PBS溶液。
本發(fā)明所要解決的再一技術問題是公開上述促肝細胞生長素注射液在制備治療肝病藥物中的應用。
本發(fā)明促肝細胞生長素注射液能促進肝細胞DNA合成，使肝細胞再生，可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
其治療劑量為重癥肝炎和肝硬化靜脈注射，每次4毫升(60μg)，每天兩次，30天為一療程。慢性肝炎靜脈注射，每次2毫升(30μg)，每天兩次，30-60天為一療程。
本發(fā)明促肝細胞生長素注射液對熱敏感，4℃以下活性可保存一年，室溫14天(25℃)活性降低，95℃，30分鐘失去活性。
注射液在pH6.0-8.0范圍內穩(wěn)定，不失去活性；對胰蛋白酶敏感，對SDS不敏感。注射液的活性測定可采用體內、外3H-TdR摻入法檢測，與對照組比較，均有明顯生物活性；其放射性計數(cpm)為對照組的1.7倍以上。
用本發(fā)明促肝細胞生長素注射液進行有關毒理、藥代、藥效和臨床試驗一、毒理試驗1.促肝細胞生長素注射液的局部試驗采用實驗豚鼠，經肌肉注射，呼吸平穩(wěn)、心跳頻率在正常范圍內無異常改變，無過敏反應，局部亦未發(fā)紅、腫、熱現象，無熱源反應。
2.促肝細胞生長素注射液的急性及長期毒性試驗急性毒性試驗選用健康小白鼠，肌肉和靜脈兩種途徑給藥，分別作一次肌注和一次靜注毒性試驗，肌肉和靜脈用藥劑量達到最高允許劑量即750μg/kg體重時，均無動物死亡，動物行為正常，對外界反應靈敏，LD50無法測算。長期毒性試驗，分成為高、中、低劑量組進行動物試驗，無動物死亡，亦未發(fā)現神經系統、心血管系統、呼吸系統等的異常改變。
3.促肝細胞生長素注射液的特殊毒性試驗為了觀察促肝細胞生長素是否致癌變、畸變，利用姊妹染色體交換(SCE)，染色體畸變和細胞轉化等試驗，分別從染色體和細胞水平檢測促肝細胞生長素注射液是否致畸變和致癌變，設三個劑量組及對照組，同時設平行管，觀察細胞染色體的變化，無論從SCE細胞數觀察和間隔、二著絲粒、多著絲粒，大小環(huán)及染色體間交換，與對照組比較均無統計學差異(P＞0.05)。
致癌變試驗，采用3T3細胞培養(yǎng)，在軟瓊脂上培養(yǎng)觀察，促肝細胞生長素注射液三個劑量組均無細胞克隆形成，陽性對照組細胞克隆的形成為陽性，空白對照組陰性，說明促肝細胞生長素注射液不致癌變，亦不致突、畸變。
4.促肝細胞生長素注射液的生殖毒性試驗選用性成熟健康小白鼠、體重20克左右，分給藥與對照組，治療組分高、低劑量組，分別在受精前、妊娠期以及泌乳期用藥，實驗結果表明，胎胚形態(tài)、外觀、器官發(fā)育正常、無畸胎發(fā)現，自然分娩后新生動物情況良好，與對照組均無差異。
上述試驗表明本發(fā)明注射液安全無毒。
二、促肝細胞生長素注射液的藥代動力學試驗將125I標記的促肝細胞生長素注射液，注射兔靜脈，注射后1、2、4、6、12、24、33、48、72小時分別靜脈抽血測血中放射性高、中、低劑量組濃度，結果注射后4小時血中達最高濃度，33小時后基本消失，半衰期為10小時，以肝臟分布最高，主要通過腎臟排泄。
通過8例正常人藥代動力學觀察，藥物劑量120μg/8ml/次，用藥前、用藥后5’、10’、30’、45’、1°、2°、3°、4°、6°、8°、12°、24°共13次標本分離血清后低溫保存，用生物活性檢測方法檢測，實驗結果對受試者實驗前后肝功能、心電圖、腎功能均無改變。血中開始出現最高活性為0.84小時，半衰期為6.96小時。
三、藥效試驗
A.促進肝細胞DNA合成作用(一)材料和方法動物健康純系SD大白鼠，體重200-250g。
HepG2細胞。
試劑3H-TdR(0.5mci/ml)，1640培養(yǎng)基及細胞培養(yǎng)其它常用試劑。促肝細胞生長素注射液，蛋白濃度15μg/ml。
(二)方法1.體內法選健康SD大白鼠，體重200g左右。設五個劑量組，分別給藥2.5μg/kg體重/天、1.25μg/kg體重/天、0.63μg/kg體重/天、0.32μg/kg體重/天、0.16μg/kg體重/天。并設一個對照組，用生理鹽水代替促肝細胞生長素注射液。各劑量組及對照組分配大白鼠5只。首先將大白鼠用乙醚麻醉，外科手術方法切除其肝臟的三分之一，給予正常飲食飲水，六小時后按上述方案腹腔給藥一次，再過十八小時后腹注射3H-TdR50μCi，三小時后處死取肝組織1克，加0.1mol/L NaCl-檸檬酸鈉充分勻漿后，3000轉/分離心20分鐘，去上清，沉淀加1mol/LNaCl勻漿，于4℃靜置過夜后，3000轉/分離心10分鐘，取上清，加無水乙醇至出觀沉淀，低速離心10分鐘，收集沉淀加2ml1mol/LNaCl，迅速攪拌加速溶解，加等體積氯仿—異戊醇(24∶1)劇烈振蕩15分鐘，3000轉/分離心10分鐘，取上層加2倍無水乙醇，離心取沉淀，加2ml蒸餾水溶解，取1ml滴在玻璃纖維膜上，烤干后加閃爍液放射性計數，另1ml稀釋后在260nm波長處測吸收度。按0.200相當于0.01mg/ml DNA換算成DNA的濃度，計算各組1分鐘放射性計數值cpm/mgDNA。
2.體外法將體外培養(yǎng)的HepG2培養(yǎng)液中加入三種不同劑量的促肝細胞生長素注射液，使促肝細胞生長素終濃度分別為16.6μg/ml、3.3μg/ml和0.66μg/ml。另設空白對照組，用生理鹽水代替促肝細胞生長素。各劑量組和空白對照組又各設四個平行孔。37℃、5％的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時后每孔加入3H-TdR5μCi，繼續(xù)培養(yǎng)6小時，吸去培養(yǎng)液，用胰酶——EDTA使細胞脫壁，離心收集細胞，將細胞吸至玻璃纖維膜上，在膜上用蒸餾水破細胞，然后用5％三氯醋酸變性蛋白、95％乙醇固定，膜片在37℃烤箱中烤干后放入液閃杯中，加閃爍液(POP-POPOP)5ml，用液體閃爍儀測一分鐘的放封性計數值(cpm值)。
(三)結果1.體內法測定結果表1 體內法測定肝細胞生長素注射液活性結果給藥途徑劑量(μg/kg體重) X±SD(cpm/mgDNA) 倍數靜注 2.508508±821 2.571.258342±799 2.530.636427±650 1.950.325758±542 1.740.163001±290 0.91生理鹽水對照組 3302±185注X±SD(×104)表示各劑量組平行管cpm/mgDNA計數的平均值±標準差。
靜注ED50為0.60μg/kg體重/天。
靜注的有效劑量范圍為0.32μg/kg體重/天以上。
2.體外細胞培養(yǎng)法測定結果。
表2體外法測定(放射性計數)結果分組 劑量(μ g/ml) X±SD(cpm/2.5×105) 倍數空白對照組 不加細胞，不加 40(本底)促肝細胞生長素16.610.520±311 2.14給藥組3.3 9.678±280 1.980.668.142±184 1.67對照組生理鹽水4.923±111注X±SD表示各組平行孔cpm計數的均值±標準差。
(四)結論經體內法活性測定得知，促肝細胞生長素注封液有明顯促進肝細胞DNA合成的作用，3H-TdR的摻入明顯優(yōu)于對照組。通過對不同劑量促肝細胞生長素注射液活性的研究表明，靜注的有效劑量為0.32μg/kg體重以上；靜注的半有效劑量為0.60μg/kg體重；靜注的藥效隨劑量增加而升高，但達1.25μg/kg體重/天時達到一種類似“穩(wěn)定”的狀態(tài)。體外細胞培養(yǎng)中活細胞計數和放射性計數與對照組相比也顯著差異。放射性計數cpm值代表了肝細胞中3H-TdR的摻入量，因而也反映了細胞DNA的合成速度。由此可見促肝細胞生長素不論在體內或體外均有明顯促進肝細胞DNA合成的作用。認為促肝細胞生長素是一種活性高、藥效強的刺激肝細胞DNA合成的藥物。
B.D-半乳糖胺或四氯化碳所致肝損害動物試驗實驗用純系健康大小白鼠各50只，大鼠體重在132-214克，小鼠體重50-100克，隨機分組(1)肝損傷組10只；(2)治療組30只(促肝細胞生長素組2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg；各10只)；(3)生理鹽水組10只。肝損傷組用D-半乳糖胺按500毫克/公斤體重腹腔注射或四氯化碳按0.5ml/100克體重造成肝損害，每天腹腔或靜脈注射1ml生理鹽水，72小時后處死取肝組織進行病理檢查。治療組動物如前造成肝損害，促肝細胞生長素組每天用促肝細胞生長素注射液分別按2.5μg/kg、1.25μg/kg、0.63μg/kg體重腹腔和靜脈注射共三天(每天一次)，治療組動物均在72小時處死取肝臟進行病理檢查。生理鹽水組的大白鼠不用D-半乳糖胺造成肝損害，小白鼠不用四氯化碳造成肝損害，僅每天用無菌生理鹽水5毫升腹腔和靜脈注射一次，共三次，72小時處死取肝送病理檢查(表3)。
說明表中+、++、+++分別表示肝組織學觀察中，光鏡下以中央靜脈和門靜脈為視野中心，肝細胞壞死、變性、浸潤和濁腫程度為輕、中、重；0表示無病毒改變。括號中數字表示產生各病理改變程度的動物數。
表3不同劑量的促肝細胞生長素注射液對不同動物、不同途徑、不同藥物所致肝損害的療效觀察大白鼠D-半乳糖胺肝組織學觀察分類 動物數 途徑壞死變性細胞浸潤濁腫生理鹽水 100 0+(1) +(1) 腹腔肝損傷組 10 +++(5) +++(2)+++(2)++(4) 腹腔促肝細胞生長素治療組2.5μg/kg 100 0 0+(1) 腹腔1.25μg/kg100 0 0+(1) 腹腔0.63μg/kg100+(1) +(1) +(2) 腹腔小白鼠四氯化碳組織學觀察分類 動物數 途徑壞死變性細胞浸潤濁腫生理鹽水 100 0+(1) +(1) 靜脈肝損傷組 10 +++(4) +++(2)++(3) ++(5) 靜脈促肝細胞生長素治療組2.5μg/kg 100 0+(1) +(1) 靜脈1.25μg/kg100 0 0+(1) 靜脈0.63μg/kg100 +(1) 0+(1) 靜脈小結促肝細胞生長素注射液治療組有明顯的改善肝細胞壞死、變性、炎癥侵潤、濁腫作用，病變恢復接近正常。生理鹽水注射組，與病理組的病變有顯著差異，證示了促肝細胞生長素有再生肝細胞的能力，從理論上證明了促肝細胞生長素有促使DNA的合成和支持代謝、免疫調節(jié)的作用。
四、臨床試驗(一)用藥方法、劑量及療程分重型肝炎組和重度慢性肝炎組，二組均在常規(guī)的基礎綜合治療基礎上，加用促肝細胞生長素注射液。
使用時劑量為；120μg加入10％葡萄糖100-250ml中靜脈滴注，每日一次，療程4周，有效者可延長至6-8周。
常規(guī)的基礎綜合治療包括靜滴葡萄糖注射液、茵梔黃注射液、維生素、脂肪乳、支鏈氨基酸、適量的新鮮血、新鮮血漿、白蛋白及止血藥等，但在治療期間，重型肝炎組不能用皮質激素、日達仙，前列腺素、胎肝注射液、胎肝及其他乳肝制劑等治療藥物；重度慢性肝炎組不能使用皮質激素、抗病毒藥物、日達仙等治療藥物。
(二)觀察內容1.癥狀及體征(包括乏力、食欲、惡心、嘔吐、腹脹、神志、尿量、出血情況、腹水量、黃疸、肝濁音界)，于治療前、治療后每2周和治療結束時各觀察記錄一次。
2.血常規(guī)、尿常規(guī)、血尿素氮及肌酐，血氨、甲胎蛋白(AFP)、電解質、腹水常規(guī)及細菌培養(yǎng)，于治療前、治療后每2周和治療結束時各觀察記錄一次。
3.肝功能血清丙氨酸轉氨酶(ALT)、天門冬氨酸轉氨酶(AST)、總膽紅素(TBIL)、直接膽紅素(DBIL)、凝血酶原活動度(PTA)、總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、于治療前、治療2周時和治療結束時各觀察記錄一次。
4.血清病毒標志物測定抗-HAVIgM、HBsAg、HbeAg，抗-HBs、抗-HBe、抗-HBc，HBsAg或/和HBeAg陽性者測HBVDNA，抗-HCV陽性者測定HCVRNA，HBsAg陽性者測抗-HDV、HDVAg，另外，還測定抗-HEV，以上指標于治療前記錄一次。
5.記錄藥物在應用過程中的不良事件。
(三)療效判定標準療效分為顯效、有效、無效三個標準。
重型肝炎和重度慢性肝炎療效判定標準1.顯效臨床癥狀恢復，血清膽紅素、ALT復常。
2.有效；血清膽紅素，ALT降至治療前水平50％以下。
3.無效療程結束后臨床及肝功能未達到上述標準或死亡。
將顯效例數和有效例數合并統計為總有效例數。
(四)統計學方法1.病人癥狀、體征的變化用X2檢驗進行統計分析。
2.病人的生化指標，如ALT、AST、TBIL、ALB、PTA及AFP的變化用改變率來表示 因改變率呈偏態(tài)分布，因此用中位數表示之，+代表上升，一代表下降。用秩和檢驗進行統計分析。
(五)結果A.促肝細胞生長素(威佳)注射液對重度慢性肝炎的治療效果1.病死率及死亡原因應用促肝細胞生長素后，333例重度慢性肝炎病人中，死亡2例。其中1例死于消化道出血，另一例死于肝腎綜合征。存活331例。用藥觀察期間病死率為0.6％。
2.肝細胞生長素(威佳)注射液對重度慢性肝炎病人癥狀、體征的療效表4二周四周 六周好轉好轉 例 好轉 X2P例數 (％) 例數(％) (％)例數例數 數 例數乏力 322 23573.0 302 266 88.1 87 77 88.5 27.73 ＜0.001納差 316 24577.5 294 271 92.2 86 81 94.2 33.47 ＜0.001惡心 263 22485.2 246 235 95.5 70 67 95.7 19.25 ＜0.001嘔吐 167 14083.8 157 153 97.5 50 50 100 25.04 ＜0.001腹脹 247 17671.3 233 211 90.6 74 66 89.2 33.85 ＜0.001上腹不 192 11258.3 183 150 82.0 59 51 86.4 36.11 ＜0.001適黃疸 311 17054.7 292 234 80.1 85 74 87.1 60.42 ＜0.001出血 4629 63.1 4235 83.3 18 17 94.4 8.93 0.01用藥后2周，病人的乏力、納差、惡心、嘔吐、腹脹、上腹不適、黃疸及出血的好轉率分別為73.0％、77.5％、85.2％、83.8％、71.3％、58.3％、54.7％和63.1％；用藥至4周時好轉率分別為88.1％、92.2％、95.5％、97.5％、90.6％、82.0％、80.1％和83.3％；用藥6周時分別為88.5％、94.2％、95.7％、100％、89.2％、86.4％、87.1％和94.4％。這些變化經統計學處理，差異非常顯著，有統計學意義，P＜0.01。
3.促肝細胞生長素(威佳)注射液對重度慢性肝炎病人生化指標的療效表5

N病例數，M改變率的中位數，Min改變率最小值，Max，改變率最大值。重度慢性肝炎病人用促肝細胞生長素后ALT、AST、TBIL變化明顯下降，PTA、ALB的變化逐漸上升，AFP也有上升，但上升幅度逐漸減少。這些變化，經統計學處理，有非常顯著的差異，P＜0.01。
4.促肝細胞生長素(威佳)注射液對重度慢性肝炎的總臨床效果表6療效病例數 ％顯效 124 38.3有效 164 50.6無效 3611.1總有效288 88.9用促肝細胞生長素(威佳)注射液治療重度慢性肝炎總有效率為88.9％。
B.促肝細胞生長素對重型肝炎的治療效果1.促肝細胞生長素(威佳)注射液對重型肝炎病人癥狀、體征的影響表7
二周 四周 六周好轉 好轉 例好轉 X2P例數 (％) 例數(％) (％)例數 例數 數例數乏力 346 197 56.9 291 243 83.5 113 9886.7 71.86 ＜0.001納差 333 214 64.3 278 240 86.3 113 106 93.8 64.68 ＜0.001惡心 302 215 71.2 257 230 89.5 104 9995.2 47.75 ＜0.001嘔吐 212 162 76.4 181 168 92.8 767092.1 24.91 ＜0.001腹脹 315 183 58.1 264 225 85.2 104 9288.5 80.07 ＜0.001上腹不 231 125 51.4 197 156 79.2 847285.7 46.89 ＜0.001適黃疸 345 141 40.9 287 200 69.7 110 8577.3 74.20 ＜0.001出血 77 39 50.7 644671.9 232087.0 17.110.002用藥后2周，病人的乏力、納差、惡心、嘔吐、腹脹、上腹不適、黃疸及出血的好轉率分別為56.9％、64.3％、71.2％、76.4％、58.1％、51.4％、40.9％和50.7％；用藥至4周時好轉率分別為83.5％、86.3％、89.5％、92.8％、85.2％、79.2％、69.7％和71.9％用藥6周時分別為86.7％、93.8％、95.2％、92.1％、88.5％、85.7％、77.3％和87.0％，這些變化經統計學處理，差異非常顯著，有統計學意義，P＜0.01。
2.使用促肝細胞生長素(威佳)注射液對重型肝炎病人生化指標的影響表8

重型肝炎病人應用促肝細胞生長素后ALT、AST、TBIL、ALB及PTA均有明顯的改變，隨著治療時間的延長，ALT、AST、TBIL逐漸下降，ALB與PTA上升，改變率經統計學處理，有非常顯著的差異，P＜0.01。
3.促肝細胞生長素(威佳)注射液對重型肝炎的臨床效果①促肝細胞生長素對重型肝炎的總臨床效果表9
療效病例數 ％顯效 118 34.0有效 154 44.4無效 7521.6總有效272 78.4用促肝細胞生長素(威佳)注射液治療重型肝炎總有效率為78.4％。
②促肝細胞生長素對重型肝炎(亞急性、慢性)不同分期病人的臨床觀察效果 表10顯效 有效 無效 總有效病例數N％N％N％N％早期 129 49 38.0 67 51.9 13 10.1 116 89.9中期 145 56 38.6 67 46.2 22 15.2 123 84.8*晚期 51 12.0 13 25.5 37 72.6 14 27.5*用促肝細胞生長素治療亞急性、慢性重型肝炎早期、中期和晚期的總有效率分別為89.9％、84.8％和27.5％。
*重型肝炎早期與中期的總有效率比較差異無統計學意義，X2＝1.59，P＝0.21；重型肝炎晚期的總有效率與早期和中期比較差異顯著，有高度統計學意義，X2＝89.08，P＜0.001。
結論在基礎綜合治療上加用促肝細胞生長素對重度慢性肝炎的總有效率為88.9％，對重型肝炎的總有效率為78.4％。表現為病人病死率較低，癥狀、體征及生化指標的改善較明顯。這與促肝細胞生長素注射液能夠促進肝細胞的再生、降低腫瘤壞死因子(TNF)水平，及對肝細胞膜有一定的修復作用有關。
上述試驗結果顯示，本發(fā)明促肝細胞生長素注射液有顯著的再生肝細胞的能力，促使DNA的合成和支持代謝、免疫調節(jié)的作用，是理想的治療肝病藥物。
具體實施例方式
實施例1促肝細胞生長素注射液的制備原料健康乳豬，豬齡15-20天，體重7-7.5kg/只，于上午6-8時放血處死取肝臟，清洗血液后-20℃保存。
1.勻漿取經洗滌后的乳豬肝先在攪肉機上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿。
2.攪拌搗碎后的勻漿置于提取罐內，按1∶3W/V的比例加入提取液，于室溫下低速(60轉/分)攪拌一小時，以充分提取所需成分。
3.加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達到95℃時停止加熱，并在此溫度點上保持15-20分鐘。
4.過濾和冷卻加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過濾的方式進行固液分離，保留濾液。
5.提純5.1.DEAE-Sepharose FF的裝柱和處理把新購入的DEAE-Sepharose FF中的酒精倒掉，加入3倍以上體積的PBS，搖勻，以“自然沉降法”裝柱，裝好后柱內無氣泡，無分層觀象。然后用2M的氯化鈉溶液洗1個柱體積，用蒸餾水洗3個柱體積，再用PBS平衡至流出液的pH值與PBS相同。
5.2、上樣把經固液分離得到的濾液以10升/時的流速給已經裝好、并經平衡的DEAE Sepharose FF柱上樣，上樣量為柱體積的6倍。
5.3.A液洗脫上樣完畢后，先用A液洗脫，流速15000ml/小時，用紫外分光光度計檢測洗脫液在280nm的吸收度，小于0.5后停用A液洗脫。
5.4.B液洗脫
當A液洗脫液的A280nm小于0.5時，換為B液洗脫，流速8000ml/小時，同樣用A280nm監(jiān)測，當A280nm開始上升時，收集此部分洗脫液，至A280nm小于0.5時停止收集。
5.5.除鹽采用進口超濾膜超濾器除鹽，經除鹽后即為半成品促肝細胞生長素。
6.半成品檢定6.1.蛋白質含量用Lowry法測定蛋白質含量，用注射用水調整其含量，使之為15-25μg/ml。
6.2.PH值調整用pH計測定pH值，調節(jié)pH值為7.0-7.8(6.0-8.0)。
6.3.氯離子檢查用“硝酸銀滴定法”測定，要求氯離子濃度小于1.0mmol/L。
6.4、內毒素檢測以鱟試劑檢測半成品的內毒素，使蛋白含量在15-25μg/ml時，其內毒素值應小于5.25EU/ml。
7.除菌用0.2μ微孔濾器進行除菌過濾。
8.分裝安瓿，2ml/支，蛋白質含量為15μg/ml，保存于4℃以下。
實施例2 促肝細胞生長素蛋白質含量測定對照品溶液的制備 取已在五氧化二磷干燥器中減壓干燥至恒重的牛血清白蛋白對照品約15mg，精密稱定，置100ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。
標準曲線的制備精密量取對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml分別置具塞試管中，均加水使成4.0ml，分別精密加入福林酚試液甲6ml，搖勻，放置10分鐘，再分別精密加入福林酚試液乙1ml，立即搖勻，至35℃水浴中保溫35分鐘，放冷至室溫，以第一份為空白，照分光光度法(中國藥典1990年版二部附錄24頁)，在660nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱座標，濃度為橫座標，繪制標準曲線。
測定法精密量取本品4ml，照標準曲線制備項下的方法，自“分別精密加入福林酚試液甲6ml”起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中蛋白質的含量(μg)，計算，即得。
取8個批號的促肝細胞生長素注射液，每批取5支樣品，依上述方法測得其蛋白質含量。結果見表11。促肝細胞生長素注射液的蛋白質含量為15.0-25.0μg/ml。
表11 不同批號促肝細胞生長素注射液的蛋白質含量(μg/ml) 實施例3 促肝細胞生長素注射液的氨基酸組成分析取10個不同批號的促肝細胞生長素注射液，每批號取10個樣品，經鹽酸處理，110℃加熱，離心取上清液，用鄰苯二甲醛柱前衍生高效液相色譜測定其氨基酸組成，與氨基酸標準品的高效液相色譜圖譜比較。
取促肝細胞生長素注射液2.5ml加12N鹽酸2.5ml，110℃水解后，取上清液1ml抽干，加入雙蒸水溶解，加鄰苯二甲醛、巰基乙醇等上HPLC所得圖譜與標準比較，計算每個峰的面積。其氨基酸組成共有15種(見表12)，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/L。
表12 促肝細胞生長素注射液的氨基酸組成及濃度測定氨基酸濃度(nmol/ml±SD)氨基酸 濃度(nmol/ml±SD)Asp12.71±3.23 Ala 13.63±4.27
Glu 19.40±5.65 Met0.31±0.12Ser 14.33±4.37 Val8.57±2.48Thr7.36±2.31 ILe5.88±2.18Gly 22.18±8.02 Leu 11.05±4.20His2.75±0.61 Lys 6.3±1.63Tyr1.83±0.62 Phe3.54±1.04Arg5.36±1.20 Total135.21±10.23實施例4 促肝細胞生長素注射液的聚丙烯酰胺疑膠電泳和分子量測定將促肝細胞生長素注射液經10％聚丙烯酰胺凝膠電泳(顯)示產品中有三個蛋白質組份，經細胞培養(yǎng)TdR3H摻入法用β-液體閃爍儀檢測得知其中跑在最前面的一條主要區(qū)帶A為有活性的區(qū)帶，其余兩條帶為無活性的次要區(qū)帶。經紫外掃描檢測和高效液相色譜圖面積計算主帶占總蛋白時的60％以上(Folin-酚法測定蛋白質含量)。
分子量測定取本品1支，凍干后，加蒸餾水20μl使溶解，加水解液(取十二烷基硫酸鈉0.1g，硫基乙醇100μl，甘油1g，溴酚藍指示液適量)，置沸水浴中水解3分鐘，備用。標準蛋白(SIGM公司，分子量14400-94000)，水解方法同供試品。凝膠濃度為10％。照SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定(部頒標準生化藥品第一冊1989附錄61頁)，以相對適移率(R’m)為橫座標，已知分子量標準蛋白的對數為縱座標，在半對數坐標紙上繪圖，從標準曲線中查出供試品的分子量。促肝細胞生長素注射液的有效成份為A帶，分子量約2.1萬道爾頓。
實施例5 促肝細胞生長素注射液的活性測定促肝細胞生長素促使肝細胞DNA合成，利用此原理建立體內、體外的測活方法。(HepG2細胞培養(yǎng)3H-TdR摻入法)材料和方法1.促肝細胞生長素注射液(自制蛋白含量15μg/ml)。
2.試劑檸檬酸鈉、氯仿、異戊醇、無水乙醇、PPO-POPOP閃爍液、1640培養(yǎng)基、氯化鈉等。
3.儀器754紫外分光光度計、液體閃爍儀、二氧化碳培養(yǎng)箱。
4.促肝細胞生長素活性測定方法一體內3H-TdR摻入法。
(1)動物實驗SD大白鼠體重180-230g，于上午8:00-10:00用乙醚麻醉，手術切除1/3(切左后葉)，術后六小時于腹腔內注射促肝細胞生長素注射液，術后23小時于腹腔注入50uCi3H-TdR(中國原子能科學研究所)，術后25小時處死鼠取肝臟。對照組大白鼠用等體積生理鹽水代替促肝細胞生長素注射液腹腔注射，其余同實驗組。
(2)肝細胞DNA提取及測定肝組織1克，加0.1mol/L NaCL-0.05mol/L檸檬酸納4ml制成勻漿，3000rpm/分離心20’，沉淀再用0.1mol/L NaCl-0.05mol/L檸檬酸鈉洗滌二次，沉淀加5ml 5M NaCl研磨，粘度逐漸增加，4℃放置24-48小時，取上清液加95％乙醇至出現凝膠狀態(tài)停止，取膠狀物加5ml1mol/L NaCl溶解，加等量氯仿-異戌醇(24∶1)，振蕩15分鐘，3000rpm/分離心10分鐘分三層，取上清液加2倍體積95％乙醇出現纖維狀物，取此物用75％乙醇洗二次，加2ml蒸餾水溶解，其中1ml滴于49型玻璃纖維膜，干燥后用FJ-2107液體閃爍測放射性計數(cpm值)，最后計算cpm值/mgDNA。
5、體外法測定促肝細胞生長素注射液生物活性由于體內法測活性比較繁瑣復雜，而且動物個體之間差異較大，存在一定的實驗誤差。參照LaBreque和Romero等推薦的體外細胞培養(yǎng)測活性方法，本發(fā)明建立了體外測定促肝細胞生長素生物活性的方法，多次實驗證實此方法簡便、準確、重復性好。故此我們將此方法作為促肝細胞生長素注射液產品的常規(guī)活性檢查方法。現將方法報導如下。
HepG2細胞，調至細胞濃度為2.5×105/ml/孔，用1640培養(yǎng)基培養(yǎng)貼壁后每孔加一定劑量的促肝細胞生長素注射液，5％CO2連續(xù)培養(yǎng)24小時后，加5uCi3H-TdR/每孔，6小時用胰酶-EDTA消化細胞并全部收集于49型玻璃纖維膜上，用蒸餾水破細胞后三氯醋酸、乙醇處理，將膜烘干，放于閃爍液中，計數60秒的放射性計數(cpm)值，即為cpm值/2.5×105細胞/孔。為對照組的1.7倍以上者為合格產品。
結果1.體內法測定結果(表13)表13體內法測定促肝細胞生長素注射液活性結果分組 X±SD(cpm mgDNA) 倍數(與對照組比)給藥組(促肝細胞生長素)9315±2120 1.725生理鹽水對照組5400±14022.體外法測定結果(表14)表14體外法測定促肝細胞生長素注射液活性結果分組 X±SD(cpm/2.5×105細胞)倍數空白對照組(不加細胞) 36±10(本底)生理鹽水對照組 6010±128給藥組(促肝細胞生長素0.2ml)1.2488±249 2.08
權利要求
1.一種促肝細胞生長素注射液，其特征在于其中所述的肝細胞生長素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質，該蛋白質由15種氨基酸組成，分子量為2.1萬道爾頓，占總蛋白含量的60％以上。
2.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素注射液，其特征在于該注射液為每毫升含蛋白質15-25μg、pH6.0-8.0的水針或凍干粉針。
3.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素注射液，其特征在于其中所述的組成蛋白質的15種氨基酸為Asp、Glu、Ser、Thr、Gly、His、Tyr、Arg、Ala、Met、Val、Ile、Leu、Lys、Phe。
4.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素注射液的制備方法，其特征在于該注射液是通過將乳豬肝勻漿、攪拌、加熱、過濾、吸附、洗脫、除鹽、除菌、分裝獲得的。
5.根據權利要求4所述的促肝細胞生長素注射液的制備方法，其特征在于該注射液的制備包括下列步驟1)勻漿取經洗滌后的乳豬肝先在攪肉機上初步攪碎，再用膠體磨處理，得到乳豬肝的勻漿；2)攪拌搗碎后的勻漿置于提取罐內，按1∶3W/V的比例加入提取液，于室溫下低速60轉/分攪拌一小時，以充分提取所需成分；3)加熱以水浴的方式給提取罐加熱，至料液溫度達到95℃時停止加熱，并在此溫度點上保持15-20分鐘；4)過濾加熱完成后，先把料液冷卻至室溫，然后用過濾的方式進行固液分離，保留濾液；5)提純(5.1)上樣把經固液分離得到的濾液以10升/時的流速上樣至已經裝好、并經平衡的DEAE Sepharose FF柱中，上樣量為柱體積的6倍；(5.2)洗脫分別用含氯化鈉0.28M和0.65M的PBS溶液洗脫；(5.3)除鹽用超濾膜超濾器除鹽；6)半成品檢定用Lowry法測定蛋白質含量，用注射用水調整其含量，使之為15-25μg/ml；用PH計測定PH值，調節(jié)PH值為6.0-8.0；控制氯離子濃度小于1.0mmol/L；以鱟試劑檢測半成品的內毒素，使蛋白含量在15-25μg/ml時，其內毒素值應小于5.25EU/ml；8)除菌用0.2μ微孔濾器進行除菌過濾；9)分裝，即得水針劑或冷凍干燥得凍干粉針。
6.根據權利要求1所述的促肝細胞生長素注射液在制備治療肝病藥物中的應用，其特征在于所述的藥物可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
全文摘要
本發(fā)明涉及促肝細胞生長素注射液及制備方法和應用。本發(fā)明公開的促肝細胞生長素注射液，選用的促肝細胞生長素為從乳豬肝臟中提取分離獲得的一種活性蛋白質，該蛋白質由15種氨基酸組成，氨基酸總量為135.21±10.23nmol/ml；主要活性組份蛋白質分子量為2.1萬道爾頓，占總含量的60％以上，具有較高的刺激肝細胞DNA合成的活性，使肝細胞再生。該注射液可用于慢性肝炎、重癥肝炎、病毒性肝炎、中毒性肝炎和肝硬化的治療。
文檔編號A61K35/37GK1533806SQ0311605
公開日2004年10月6日 申請日期2003年3月28日 優(yōu)先權日2003年3月28日
發(fā)明者楊錦龍 申請人:威海賽洛金藥業(yè)有限公司