專利名稱：豬促生長(zhǎng)素傳遞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及傳遞外源多肽至宿主中的表達(dá)構(gòu)建體。本發(fā)明還涉及包括該表達(dá)構(gòu)建體的重組細(xì)胞和包括該重組細(xì)胞的半滲透膠囊。
背景技術(shù)：
在哺乳動(dòng)物中，促生長(zhǎng)素(生長(zhǎng)激素)通常由腦垂體分泌。但是，已經(jīng)證實(shí)向豬給予外源促生長(zhǎng)素會(huì)提高攝食效率15-20％，增加日增重10-15％，降低身體脂肪10-20％，增加瘦肉含量5-10％，降低攝食量。令人遺憾的是，促生長(zhǎng)素(它是190個(gè)氨基酸的小蛋白質(zhì))對(duì)胃酸和蛋白降解敏感，因此需要每日注射才會(huì)有效果。當(dāng)前，福利和道德的考慮使得使用氣動(dòng)pST注射槍不受歡迎，每日用藥的費(fèi)用也限制了其大規(guī)模的使用。
基因治療的最新進(jìn)展已經(jīng)發(fā)展出了新的策略，無需依賴自體靶細(xì)胞和免疫抑制治療，而使用包封在半滲透藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。APA膠囊環(huán)境允許細(xì)胞存活和生長(zhǎng)，因此轉(zhuǎn)染細(xì)胞保持存活并在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)分泌生長(zhǎng)因子。APA對(duì)小蛋白是可通透的，因此基因表達(dá)可以通過外源機(jī)制控制。APA屏障抑制免疫監(jiān)視和細(xì)胞排斥事件，從而可以在膠囊中使用非宿主、高表達(dá)細(xì)胞。APA屏障也可能阻止宿主受體中轉(zhuǎn)染細(xì)胞不受控制的增殖。APA膠囊可以取出，可能還可以再次使用，從而打消對(duì)于食用轉(zhuǎn)基因材料的擔(dān)憂。而且，如果膠囊被嚴(yán)重的組織創(chuàng)傷損害，正常的宿主-移植物排斥就會(huì)摧毀植入的細(xì)胞。
發(fā)明概述發(fā)明人現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，在基因序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞中之前，胰島素分泌信號(hào)與異源基因序列的連接導(dǎo)致外源基因產(chǎn)物分泌水平出乎意料的增長(zhǎng)。這一發(fā)現(xiàn)已經(jīng)導(dǎo)致開發(fā)出了改進(jìn)的基因傳遞系統(tǒng)，包括包封重組細(xì)胞植入宿主中。
因而，第一方面，本發(fā)明提供了一種表達(dá)盒，包括編碼胰島素分泌信號(hào)的序列，其與編碼一種多肽的異源序列有效連接。
“異源序列”是指不是編碼胰島素的序列的序列。
“有效連接”是指胰島素分泌信號(hào)序列與異源編碼序列鄰接并位于同一閱讀框。
優(yōu)選的胰島素分泌信號(hào)是具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的胰島素分泌信號(hào)。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，可以對(duì)分泌信號(hào)進(jìn)行多種修飾而不會(huì)對(duì)信號(hào)的生物活性有不利影響。例如，這可以通過在肽序列中進(jìn)行各種改變或通過保守或非保守的氨基酸插入、缺失和取代(如D-氨基酸，脫氨基酸)實(shí)現(xiàn)，所述改變?nèi)缌蛩峄?、磷酸化、硝化和鹵化，只要這些改變不會(huì)對(duì)分泌信號(hào)的總體生物活性有不利影響。因此，在表達(dá)盒中包括已經(jīng)以上述一種或多種方式修飾的胰島素分泌信號(hào)被認(rèn)為包括在本發(fā)明之中。
異源序列可以編碼除胰島素以外的目標(biāo)多肽。例如，異源序列可以編碼激素、細(xì)胞因子、受體激動(dòng)劑或拮抗劑、信息素或酶。在優(yōu)選實(shí)施方案中，異源序列編碼生長(zhǎng)激素。優(yōu)選，生長(zhǎng)激素是促生長(zhǎng)素。
本發(fā)明第二方面提供了包括第一方面的表達(dá)盒的載體。該載體可以是將表達(dá)盒導(dǎo)入細(xì)胞的任何合適的載體。合適載體包括病毒載體和細(xì)菌質(zhì)粒。
本發(fā)明第一方面的表達(dá)盒或第二方面的載體還可以包括一個(gè)或多個(gè)調(diào)控基因表達(dá)的元件。合適調(diào)控元件的實(shí)例包括褪黑素應(yīng)答元件(MRE)(見Schrader et al.,1996，此處全文引入作為參考)，和/或雷帕霉素介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子(見Magari et al.,1997，此處全文引入作為參考)。在優(yōu)選實(shí)施方案中，調(diào)控元件可以實(shí)現(xiàn)目標(biāo)多肽的脈動(dòng)表達(dá)。
本發(fā)明第三方面提供了一種重組細(xì)胞，它包括本發(fā)明第一方面的表達(dá)盒。
重組細(xì)胞可以是細(xì)菌、真菌、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在優(yōu)選實(shí)施方案中，重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，細(xì)胞是大鼠成肌細(xì)胞(L6)。
本發(fā)明第四方面提供生產(chǎn)多肽的方法，包括在可以表達(dá)和分泌所述多肽的條件下培養(yǎng)第三方面的重組細(xì)胞，可選地包括分離該多肽。
本發(fā)明的重組細(xì)胞可以包封在半滲透基質(zhì)中以傳遞或植入人體。
因此，本發(fā)明第五方面提供植入宿主的膠囊，該膠囊包括包封本發(fā)明第三方面的一種或多種重組細(xì)胞的半滲透膜。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。APA半滲透膜的制備見Basic et al.,1996，該文獻(xiàn)全文引入作為參考。
本發(fā)明第六方面提供向宿主給予多肽的方法，包括向宿主給予本發(fā)明第一方面的表達(dá)盒。
本發(fā)明第七方面提供向宿主給予多肽的方法，包括在宿主中植入本發(fā)明第五方面的膠囊。
宿主可以是任何動(dòng)物或人。在優(yōu)選實(shí)施方案中，宿主是家畜。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，宿主選自放牧牛、圈養(yǎng)牛、奶牛、豬和家禽。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明提供了傳遞遺傳物質(zhì)到宿主中的改進(jìn)系統(tǒng)。胰島素分泌信號(hào)與生物活性多肽的連接導(dǎo)致從重組細(xì)胞分泌的多肽增加。分泌后，分泌信號(hào)可以切除，留下生物活性多肽。重組細(xì)胞包封在半滲透膜中時(shí)，可以分泌相當(dāng)數(shù)量的生物活性多肽，借助半滲透膜可以通過外來方式控制基因表達(dá)。植入包封的重組細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)在于植入需要的手術(shù)最輕。此外，半滲透膜減少了免疫監(jiān)視和細(xì)胞排斥，這意味著非宿主細(xì)胞可以用在膠囊中。
在優(yōu)選實(shí)施方案中，半滲透膜是持久耐用的，從而具有限制細(xì)胞生長(zhǎng)并阻止在宿主受體中的不受控制增殖的優(yōu)勢(shì)。膠囊的另一個(gè)優(yōu)勢(shì)在于它們可以被取出并再次使用。
為了更清楚地理解本發(fā)明的特點(diǎn)，以下參照非限定性實(shí)施例和附圖敘述本發(fā)明的優(yōu)選方式。
附圖簡(jiǎn)述

圖1胰島素分泌信號(hào)-pST基因構(gòu)建體。
圖2胰島素分泌信號(hào)-pST肽序列。
圖3對(duì)照和pST-L6IXS處理豬的增重率(從0天起)。
圖4對(duì)照和pST-L6IXS處理豬的增重百分比。
圖5對(duì)照和pST-L6IXS處理動(dòng)物的血漿pST水平。
圖6Plate 1-pST-L6IXS膠囊給藥部位評(píng)估。
Plate 2-pST-L6IXS膠囊置于培養(yǎng)基中進(jìn)行來自體內(nèi)的評(píng)估。
圖7從宿主動(dòng)物取出后24小時(shí)從膠囊分泌pST的來自體內(nèi)的評(píng)估。
圖8在給予pST膠囊之前(白柱體)和一周后(黑柱體)平均血漿pST(3小時(shí)@30分鐘間隔)(*顯著性)圖9分別植入分泌25ng/ml和500ng/ml的膠囊的兩只豬206和228的每日血漿pST濃度。
圖10實(shí)施例4中的豬的增重率(ROG，公斤/日，黑方塊)和P2背脂肪測(cè)定。
圖11植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬增重率(ROG)(±SEM)。
圖12植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬背脂肪(P2)(+SEM)。
圖13植入pST分泌或?qū)φ彰庖咧行曰蛑委?IGT)膠囊后公豬腰(眼)肌肉面積(+SEM)。
發(fā)明詳述實(shí)施例1ISS-pST構(gòu)建體的克隆pST基因獲自Southern Cross Biotechnology Pty Ltd的大腸桿菌。含有pST基因的質(zhì)粒pMG939使用標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒制備技術(shù)從細(xì)菌中分離。設(shè)計(jì)用來擴(kuò)增pST基因的PCR引物，在5’末端加入XhoⅠ位點(diǎn)，3’末端加入XbaⅠ位點(diǎn)，以進(jìn)行連接。
修飾pST基因序列然后連接至來自前原胰島素cDNA的分泌信號(hào)序列(ISS)。NheⅠ(GCTAGC)和XbaⅠ(TCTAGA)限制位點(diǎn)分別構(gòu)建在ISS起始密碼子之前pST 3’末端密碼子之后，以便整合進(jìn)pCI-neo質(zhì)粒(Promega)。然后分離pST融合構(gòu)建體并測(cè)序，以驗(yàn)證編碼區(qū)(圖1)。
大鼠成肌細(xì)胞(L6)用胰蛋白酶處理后2小時(shí)，用LipoTAXI(Stratagene)進(jìn)行轉(zhuǎn)染(pST基因整合細(xì)胞)。PST轉(zhuǎn)染L6細(xì)胞克隆在培養(yǎng)物中維持，用G418選擇，直至產(chǎn)生＞107細(xì)胞。培養(yǎng)物上清的等分試樣(2ml)在-20℃保存，直至用悉尼大學(xué)(Camden)的Dr P.Wynn首創(chuàng)的pST放射免疫試驗(yàn)(RIA)測(cè)定pST濃度。RIA敏感性被認(rèn)為大于0.4ng/ml,CV為12.4％。多克隆抗血清用pST肽抗原在豚鼠中產(chǎn)生。RIA結(jié)果(表1)表明pST基因構(gòu)建體產(chǎn)生一種蛋白(圖2)，它被由豬腦垂體純化的天然形式pST產(chǎn)生的多克隆抗血清識(shí)別。L6克隆pCI/pst-1.5如下所述由修飾轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生。
修飾轉(zhuǎn)染法一般說來，L6細(xì)胞粘附在培養(yǎng)板上，需要用胰蛋白酶解吸附才能傳代；轉(zhuǎn)染一般在24小時(shí)后進(jìn)行。該方法產(chǎn)生分泌6-18ng/ml pST的L6細(xì)胞克隆(n=10)。胰蛋白酶處理2小時(shí)后，加入LipoTAXI(Promega)和ISS/pST質(zhì)粒至L6細(xì)胞增加pST分泌速率10到20倍(＞180ng/ml,n=5克隆)。該較高的pST分泌速率降低了促進(jìn)生長(zhǎng)所需的細(xì)胞數(shù)(膠囊數(shù))。
表1用ISS-pST轉(zhuǎn)染的各克隆的濃度(ng/ml)
實(shí)施例2豬促生長(zhǎng)素-大鼠成肌細(xì)胞(L6)免疫中性表達(dá)系統(tǒng)(pST-L6IXS)的制備按照Basic et al,1996所述進(jìn)行包封步驟，包括如下改進(jìn)。
在室溫下包封細(xì)胞，利用氯化鈣(或乳酸鈣)(100mM)使藻酸鹽(1.5％w/v)液滴形成凝膠，然后立即用鹽水(0.9％NaCl)洗滌，再重懸于聚-L-賴氨酸(0.05％)中5分鐘。37℃氯化鈣交聯(lián)10分鐘產(chǎn)生與細(xì)胞活力更相容的藻酸鹽基質(zhì)。
聚-L-賴氨酸包被和鹽水洗滌之后，加入另一層藻酸鹽。檸檬酸鈉(55mM)室溫處理4分鐘軟化膠囊至一定堅(jiān)度，增加進(jìn)一步操作的難度。檸檬酸鈉處理4分鐘顯著降低細(xì)胞活力至＜35％。檸檬酸鈉處理之前將膠囊置于細(xì)胞濾過器使得37℃下處理1分鐘提高細(xì)胞活力達(dá)＞98％。
對(duì)包封方法的步驟和設(shè)備改進(jìn)提高了包封的效率(時(shí)間和資源)，細(xì)胞活力一般增加64％。
實(shí)施例3pST-L6IXS植入豬的初步試驗(yàn)(1)將pST-L6IXS給予生長(zhǎng)中的小鼠獲得的初步結(jié)果表明了較好的生長(zhǎng)特性。在用公豬進(jìn)行的初步試驗(yàn)(n=9，平均活體重61公斤)中，在不同部位給予不等量的pST-L6IXS(0天，每只動(dòng)物頸部肌肉，3個(gè)膠囊，i.m.；頸部，3個(gè)膠囊，s.c.；耳根部，10個(gè)膠囊，s.c.；頸部，20個(gè)膠囊，i.m.；頸部，29個(gè)膠囊，i.m.)。頸靜脈穿刺采集血樣(10ml)，給藥后-14、0、7、14、21、28和36天記錄P2超聲(us)測(cè)定結(jié)果。試驗(yàn)中全程監(jiān)測(cè)pST-L6IXS給藥部位的組織反應(yīng)事件。36天將動(dòng)物無痛處死，對(duì)軀體各部分進(jìn)行分析(背部脂肪厚度，BF(mm)；眼肌面積，EMA(cm)；前臂骨長(zhǎng)，BONE(cm)；心臟重量，HEART(gm)；脾臟重量，SPLEEN(gm)；肝臟重量，LIVER(gm))并記錄(見表2)，回收pST-L6IXS。圖3代表對(duì)照(con，平均值±SE,n=4)和各只pST-L6IXS處理豬的增重率(從0天起)。對(duì)照(con)(平均值±SE)和各只pST-L6IXS處理動(dòng)物相對(duì)于pST-L6IXS處理的增重百分比在圖4中示出。對(duì)照(平均值±SE)(con)和各只pST-L6IXS處理動(dòng)物的血漿pST(ng/ml)通過放射免疫試驗(yàn)(RIA)確定并在圖5中示出。處死時(shí)評(píng)價(jià)pST-L6IXS給藥部位(圖6,Plate 1，箭頭)，然后取出并置于培養(yǎng)基中進(jìn)行來自體內(nèi)的24小時(shí)pST分泌評(píng)估(圖6,Plate 2)(圖6)。在36天i.m.或s.c.給藥均未觀察到明顯的組織損害或免疫反應(yīng)。但是，置于耳部(s.c.)的膠囊似乎高度血管化，而且100％可回收。置于頸部的膠囊可回收的小于10％。
pST-L6IXS在體內(nèi)36日仍有效，并且似乎在膠囊中增殖(Plate2)，膠囊可以取出，從而打消對(duì)食用轉(zhuǎn)基因材料的擔(dān)憂。而且，如果膠囊受損(即由于嚴(yán)重的組織創(chuàng)傷)，正常的宿主-移植物排斥會(huì)摧毀L6細(xì)胞，防止轉(zhuǎn)染材料的增殖。小鼠和豬中進(jìn)行的試驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)pST-L6IXS可有效改變血清pST，提高生長(zhǎng)特性，還可能提高動(dòng)物的免疫能力。
表2pST-L6IXS初步試驗(yàn)公豬由Westmill piggery(Young,NSW)在EMAI的高度安全豬舍進(jìn)行試驗(yàn)ACEC號(hào)98/20
實(shí)施例4pST-L6IXS植入豬的初步試驗(yàn)(2)為了優(yōu)化通過膠囊的pST-L6IXS傳遞，從而獲得類似于每日注射pST的能量再分配的生長(zhǎng)應(yīng)答，進(jìn)行了第二次初步試驗(yàn)。
如實(shí)施例1所述，制備了多種分泌速率(6-200ng/ml)的pST分泌細(xì)胞。對(duì)pST分泌細(xì)胞外加脅迫(即細(xì)菌污染)后，2-25ng/ml的pST分泌速率似乎是最穩(wěn)定的(數(shù)據(jù)未示出)。因此，選擇分泌約5ng/ml(克隆pCI/pst-14)和約10ng/ml(pCI/pst-12)的克隆進(jìn)行該初步試驗(yàn)。在公豬(n=10，平均活體重78.1kg)耳根部以s.c.途徑給予不同數(shù)量的膠囊(按照實(shí)施例2所述步驟制備)(表3)。
a=克隆pCI/pst-14(5ng/ml)b=克隆pCI/pst-12(10ng/ml)試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)記錄體重。動(dòng)物分別圈養(yǎng)于圍欄(2m2)，并在控制的環(huán)境條件下(22℃)穩(wěn)定一周。動(dòng)物自由飲水，定量給予標(biāo)準(zhǔn)顆粒狀食料(3kg/日@0:900hrs)，記錄每日殘留。插管置于耳靜脈(evc)，24小時(shí)后開始取樣。對(duì)照豬(即不給予pST膠囊)血漿(10毫升)每30分鐘收集一次，共3小時(shí)。系列取樣后，耳后部給予pST膠囊。通過evc收集血樣(10毫升)(每日@11:00hrs)，插管仍留置。處理(給予pST膠囊后7日)血漿(10ml)每30分鐘收集一次，共3小時(shí)。處死和軀體分析在21日后活體重為約100kg時(shí)進(jìn)行。然后由耳部回收pST膠囊，置于體外培養(yǎng)(進(jìn)行pST分析)。評(píng)估膠囊植入部位的免疫應(yīng)答(如淋巴細(xì)胞浸潤(rùn))。
接受pST膠囊(分泌5到1000ng/ml)之前和之后7天，豬平均(3小時(shí)、30分鐘間隔)血漿pST濃度測(cè)定結(jié)果示于圖8。由圖8可見，免疫中性pST(5-100ng/ml)分泌膠囊處理后1周，豬血漿pST明顯減少。
個(gè)體間和個(gè)體中血漿pST濃度的變化在對(duì)照系列取樣期間似乎更明顯。這種現(xiàn)象反映在平均測(cè)定濃度的標(biāo)準(zhǔn)誤中。此外，穩(wěn)定基線和pST脈沖間隔(一般3-4小時(shí))不能被設(shè)計(jì)來鑒別激素脈沖的計(jì)算機(jī)程序識(shí)別。但是，穩(wěn)定基線和明顯的pST脈沖在pST膠囊給藥后一周的動(dòng)物中可以觀察到(圖9)。
動(dòng)物的增重率(ROG)似乎以劑量依賴方式對(duì)pST膠囊分泌有反應(yīng)(圖10)。30ng/ml的分泌率(即3個(gè)膠囊各分泌10ng/ml)似乎是觀察到生長(zhǎng)速率增加所需的最小劑量。大多數(shù)evc在21天保持有效，此時(shí)動(dòng)物用巴比妥鹽無痛處死以進(jìn)行軀體分析。軀體背部脂肪分析(不計(jì)皮膚的P2)測(cè)定值進(jìn)一步表明30ng/ml是pST膠囊給藥21天內(nèi)觀察到能量再分配所需的最小劑量(圖10)。
包括接受100個(gè)膠囊的動(dòng)物在內(nèi)，所有動(dòng)物在試驗(yàn)過程中未觀察到副反應(yīng)，即增重下降或不利免疫應(yīng)答。
實(shí)施例5pST-L6IXS植入豬的初步試驗(yàn)(3)實(shí)施例4后，進(jìn)行試驗(yàn)以評(píng)估在處死前不同時(shí)間(即處死前2、4和6周)向豬給予最佳pST分泌速率/膠囊數(shù)對(duì)背部脂肪的影響。每個(gè)處理使用8只動(dòng)物，8只動(dòng)物用作對(duì)照(即無pST膠囊)。
增重率測(cè)定結(jié)果在圖11中給出。
在全軀體冷凍(24小時(shí)@4℃)后進(jìn)行背部脂肪測(cè)定(圖12)。對(duì)距脊柱中心65毫米的第12肋骨記錄P2測(cè)定值。觀察到給予分泌pST的膠囊2、4和6周的豬背部脂肪較少約46％。給予pST IGT膠囊4周的動(dòng)物背部脂肪反應(yīng)差異更大，這可能與從多只這樣的動(dòng)物中不能回收膠囊有關(guān)。
分泌膠囊處理的豬腰部肌肉面積只有在pST IGT膠囊處理6周后才顯著增加(22％)(圖13)。
本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，對(duì)本發(fā)明的具體技術(shù)方案可以進(jìn)行多種改進(jìn)和/或修飾，而不會(huì)偏離本發(fā)明的精神和范圍。因此，本文所述的各種實(shí)施方案僅是示例性的而非限制性的。
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1．一種表達(dá)盒，包括編碼胰島素分泌信號(hào)的序列，該序列與編碼一種多肽的異源序列有效連接。
2．權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中胰島素分泌信號(hào)具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。
3．權(quán)利要求1的表達(dá)盒，其中胰島素分泌信號(hào)是修飾的胰島素分泌信號(hào)，具有與氨基酸序列為SEQ ID N0:1的胰島素分泌信號(hào)基本相同的總體生物活性。
4．權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的表達(dá)盒，其中異源序列編碼選自激素、細(xì)胞因子、受體激動(dòng)劑、受體拮抗劑、信息素和酶的多肽。
5．權(quán)利要求4的表達(dá)盒，其中多肽是生長(zhǎng)激素。
6．權(quán)利要求5的表達(dá)盒，其中多肽是促生長(zhǎng)素。
7．權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的表達(dá)盒，還包括使異源序列脈沖表達(dá)的一種或多種調(diào)控序列。
8．包括權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的表達(dá)盒的載體。
9．包括權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的表達(dá)盒的重組細(xì)胞。
10．權(quán)利要求9的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞是細(xì)菌、酵母、昆蟲或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
11．權(quán)利要求10的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
12．權(quán)利要求11的重組細(xì)胞，其中細(xì)胞是大鼠成肌細(xì)胞(L6)。
13．制備多肽的方法，包括在可以表達(dá)和分泌該多肽的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求9到12任一項(xiàng)的重組細(xì)胞，并可選地包括分離該多肽。
14．用于植入宿主的膠囊，膠囊包括包封權(quán)利要求9到12任一項(xiàng)的重組細(xì)胞的半滲透膜。
15．權(quán)利要求14的膠囊，其中半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。
16．向宿主給予多肽的方法，其中該方法包括向宿主給予權(quán)利要求1到7任一項(xiàng)的表達(dá)盒。
17．向宿主給予多肽的方法，其中該方法包括在宿主中植入權(quán)利要求14或15的膠囊。
18．權(quán)利要求16或17的方法，其中宿主是動(dòng)物或人。
19．權(quán)利要求18的方法，其中宿主是家畜。
20．權(quán)利要求19的方法，其中家畜是豬。
21．向豬給予促生長(zhǎng)素的方法，其中該方法包括在豬中植入包括包封重組細(xì)胞的半滲透膜的膠囊，所述重組細(xì)胞包括和表達(dá)一種表達(dá)盒，所述表達(dá)盒包括編碼胰島素分泌信號(hào)的序列，所述胰島素分泌信號(hào)與編碼促生長(zhǎng)素的異源序列有效連接，其中所述膜對(duì)表達(dá)的促生長(zhǎng)素是可通透的。
22．權(quán)利要求21的方法，其中胰島素分泌信號(hào)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
23．權(quán)利要求21的方法，其中胰島素分泌信號(hào)是修飾的胰島素分泌信號(hào)，其具有與氨基酸序列為SEQ ID NO:1的胰島素分泌信號(hào)基本相同的總體生物活性。
24．權(quán)利要求21到23任一項(xiàng)的方法，其中重組細(xì)胞是哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
25．權(quán)利要求24的方法，其中哺乳動(dòng)物細(xì)胞是大鼠成肌細(xì)胞(L6)。
26．權(quán)利要求21到25任一項(xiàng)的方法，其中半滲透膜是藻酸鹽-聚-L-賴氨酸-藻酸鹽(APA)膜。
27．權(quán)利要求21到26任一項(xiàng)的方法，其中向豬植入一個(gè)或多個(gè)膠囊，這些膠囊足以分泌至少30ng/ml的促生長(zhǎng)素。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于傳遞外源多肽(如促生長(zhǎng)素等生長(zhǎng)激素)至宿主中的表達(dá)構(gòu)建體。在本發(fā)明一個(gè)應(yīng)用中,將表達(dá)構(gòu)建體導(dǎo)入非宿主重組細(xì)胞,該細(xì)胞包封于半滲透膜中,用于植入宿主。半滲透膜抑制免疫監(jiān)視和細(xì)胞排斥事件,從而可以使用非宿主的高表達(dá)重組細(xì)胞。
文檔編號(hào)A61P5/02GK1323348SQ99812256
公開日2001年11月21日 申請(qǐng)日期1999年10月18日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月16日
發(fā)明者M·基根, M·R·瓊斯, G·P·M·莫雷 申請(qǐng)人:聯(lián)邦科學(xué)及工業(yè)研究組織, 西悉尼大學(xué)(尼平), 豬只研究及開發(fā)公司