檢測耳聾基因的核酸序列及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了檢測耳聾基因的核酸序列及其應(yīng)用，屬于基因測序和生物檢驗(yàn)領(lǐng)域。一組檢測耳聾基因的特異性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示的核苷酸序列。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：本發(fā)明設(shè)計了一套全新的同時檢測4個耳聾基因的全外顯子共計9497bp的特異性多重PCR引物及使用該引物進(jìn)行檢測的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù)方案應(yīng)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行耳聾基因檢測，可以快速準(zhǔn)確的檢測所有位于4個耳聾基因上的突變位點(diǎn)，包括一直熱點(diǎn)突變和新發(fā)突變。具有高通量、低成本、檢出率高等特點(diǎn)。
【專利說明】
檢測耳聾基因的核酸序列及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及檢測耳聾基因的核酸序列及其應(yīng)用，屬于基因測序和生物檢驗(yàn)領(lǐng)域。 具體為檢測4個耳聾基因的全外顯子的檢測方法，以及所述方法中使用的特異性引物，特別 是涉及以多重PCR技術(shù)結(jié)合高通量測序技術(shù)進(jìn)行檢測的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 耳聾是一種最常見的感覺系統(tǒng)疾病，在新生兒中的發(fā)病率約為1/1000,其中約 60%的耳聾患者是由于遺傳因素造成的。按表型特點(diǎn)不同分為綜合征性耳聾（SHI)和非綜 合征性耳聾(NSHI)。根據(jù)遺傳方式不同將遺傳性耳聾分為常染色體顯性遺傳(AD)、常染色 體隱性遺傳(AR)、X連鎖遺傳、Y連鎖遺傳及線粒體遺傳五類，其中以常染色體隱性遺傳性耳 聾最多見，約占75%-80%。大規(guī)模耳聾分子流行病學(xué)研究表明，我國人群中最常見的致病 基因包括GJB2、GJB3、SLC26A4(PDS)、線粒體DNA(12S rRNA)。
[0003] GJB2基因定位在13ql2區(qū)域，與DFNB1的表型相關(guān)，以輕度至極重度的語前感音神 經(jīng)性聽力損失為多見，亦可表現(xiàn)進(jìn)行性聽力損害。GJB2基因全長4804bp，編碼區(qū)678bp，含2 個外顯子，編碼縫隙連接蛋白connexin26(Cx26)。如果縫隙連接復(fù)合物中的Cx26蛋白缺乏， 就會妨礙去極化相進(jìn)入細(xì)胞的鉀離子在復(fù)極相回流，使Corti器局部鉀離子中毒并造成耳 聾。對GJB2基因型與表型的相關(guān)性研究，比較一致的認(rèn)識是GJB2基因的缺乏造成先天性聽 力損失，而缺失、框移、剪接和不穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄等涉及功能缺失的突變可能與綜合征或成年后耳 聾有關(guān)，并且決定于突變位點(diǎn)的重要性及替換氨基酸的性質(zhì)。GJB2基因突變范圍幾乎涉及 該基因所有編碼區(qū)域，突變形式包括剪切、無義突變、錯義突變、插入及缺失導(dǎo)致移碼突變 等。
[0004] GJB3定位于人類染色體1P33-35,編碼有270個氨基酸的連接蛋白31，全長3617bP。 GJB3基因編碼的蛋白Cx31是間隙連接蛋白家族中的重要成員，分布在身體多個組織器官 上，但以皮膚和內(nèi)耳最多，其突變可導(dǎo)致可變性紅斑皮膚角化病(EKV)、聽力損傷和周圍神 經(jīng)病變，是后天高頻感音神經(jīng)性耳聲患者的常見突變基因。
[0005] SLC26A4基因又稱PDS基因，位于人類染色體7q31，含有21個外顯子，編碼含有780 個氨基酸的蛋白質(zhì)Pendr in。SLC26A4基因與DFNB4表型相關(guān)，呈進(jìn)行性或波動性癥狀，一般 可以發(fā)展至極重度聽力損失，累及所有頻率。
[0006] 線粒體DNA突變易導(dǎo)致藥物性耳聾，藥物中毒性耳聾指的是使用某些藥物治病或 人體接觸某些化學(xué)制劑所引起的耳聾。對耳功能有毒性作用，引起耳聾的藥物，統(tǒng)稱為耳毒 性藥物。多年來，由于大量化學(xué)藥物和抗生素的廣泛應(yīng)用，己發(fā)現(xiàn)近百種耳毒性藥物。mtDNA 突變A1555G和C1494T，使得人體線粒體中的12S rRNA的結(jié)構(gòu)與細(xì)菌的16S rRNA的結(jié)構(gòu)更為 相似，使得氨基糖苷類抗生素在與細(xì)菌結(jié)合的同時，與人體12S rRNA也形成了較為緊密的 結(jié)合。已知AmAn發(fā)揮抗菌作用是靠其特異地與細(xì)菌核糖體結(jié)合，抑制蛋白合成或?qū)е耺RNA 錯譯。A1555G突變產(chǎn)生的G-C堿基對有利于與AmAn結(jié)合。其結(jié)果破壞了線粒體蛋白的合成及 減少了 ATP的產(chǎn)量，使細(xì)胞內(nèi)外離子濃度失衡，導(dǎo)致了耳蝸毛細(xì)胞的死亡。
[0007] 目前臨床上對遺傳性耳聾致病基因診斷的主要方法包括限制性長度多態(tài)性分析 (RFLP)、斑點(diǎn)雜交(AS0)、基因掃描、變性高效液相色譜分析(DHPLC)、直接測序、基因芯片方 法等。但這些技術(shù)或耗時費(fèi)力，或成本較高，或難以同時檢測多個基因的不同突變位點(diǎn)，或 只能用于檢測已知突變對于新發(fā)突變或者低頻突變無法覆蓋。使用上述方法進(jìn)行檢測的主 要用于檢測GJB2基因位點(diǎn)：35delG、235del C、299del AT、176dell6;GJB3基因位點(diǎn)：538C> !';51^：26厶4基因位點(diǎn)：2168厶>6、1￥57-2厶>6;以及125冰祖位點(diǎn) ：149401'、1555厶>6。以上 位點(diǎn)檢測面窄，如GJB2基因的突變涉及所有外顯子區(qū)域，因此需要一種覆蓋度全的檢測方 法，涉及4個基因的全外顯子區(qū)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明要解決的第一個技術(shù)問題是提供一組同時檢測GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外顯子的耳聾基因檢測引物。
[0009] 本發(fā)明要解決的第二個技術(shù)問題是提供一種同時檢測GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全外顯子的耳聾檢測試劑盒。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0011] -組檢測耳聾基因的特異性引物，具有序列表SEQ ID No.1至SEQ ID No.170所示 的核苷酸序列。參見表1所示。
[0012] 本發(fā)明根據(jù)選擇目的基因 GJB2/GJB3/SLC26A4/12S rRNA的外顯子的DNA序列設(shè)計 特異性引物。引物與引物之間不形成二聚體，引物自身不形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板之間不 發(fā)生錯配，且引物設(shè)計區(qū)域不存在突變位點(diǎn)。同時，在引物設(shè)計時，每對引物之間的退火溫 度差異小于2攝氏度，擴(kuò)增產(chǎn)物長度在100_250bp之間。
[0013] 所述耳聾基因檢測引物，能夠同時檢測GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和 SLC26A4基因的全外顯子。
[0014]表1耳聾基因擴(kuò)增引物




[0020]本發(fā)明采用多重PCR反應(yīng)。根據(jù)引物設(shè)計方案，將表1中引物序列分組為8個引物池 (引物pool)，參見表2所示，每個引物池中的引物為10-16對。
[0021]表2耳聾基因擴(kuò)增引物池（引物pool)


[0025] 其中引物池 ID N0:1至引物池 ID N0:4使用rTaq酶進(jìn)行擴(kuò)增；引物池 ID N0:5至引 物池 ID NO:8使用LA Taq酶進(jìn)行擴(kuò)增。
[0026] 為了區(qū)別不同樣本，所有引物均在5'端帶有樣本標(biāo)簽序列，不同樣本使用不同的 標(biāo)簽序列。樣本標(biāo)簽序列為6~12個堿基的核苷酸序列，優(yōu)選8個堿基，如表3中的16個標(biāo)簽 序列。
[0027]所述標(biāo)簽只是為了區(qū)別每個樣品，以便用于同時檢測多個樣品，本領(lǐng)域技術(shù)人員 可以根據(jù)需要以及通常的引物設(shè)計原則選擇使用不同的標(biāo)簽，而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。因此， 在一些實(shí)施方案中可以使用任何可以達(dá)到上述目的，且不會與檢測目的物相互作用的標(biāo)簽 序列。
[0028] 表3樣本標(biāo)簽序列表
[0030] 一種檢測耳聾基因的試劑盒，包含序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 170所示的引 物序列。
[0031] 所述引物序列的5'端帶有一個樣本標(biāo)簽序列
[0032] 所述樣本標(biāo)簽序列為6~12個堿基的核苷酸序列，優(yōu)選表3中的一個或多個核苷酸 序列。
[0033] 所述檢測耳聾基因的試劑盒，還包括rTaq酶(5U/ul)、10XPCR反應(yīng)緩沖液、d NTP 混合液(2.5mM)、LA Taq酶、2 X GC反應(yīng)緩沖液和滅菌蒸餾水。
[0034] 本發(fā)明還提供了一種檢測耳聾基因的方法，使用序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID 如.170所示的核苷酸序列同時檢測樣本的6貝2基因、6邛3基因、123冰嫩基因和3^26六4基 因的全外顯子序列并對測序結(jié)果進(jìn)行信息分析。
[0035]所述方法包括以下步驟：
[0036]步驟1，用標(biāo)簽引物對目的樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，標(biāo)簽引物是序列表SEQ ID No. 1 至SEQ ID No.170所示的引物序列，在5'端連接表3所示的標(biāo)簽序列組成，得到多重PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物；
[0037] 步驟2，混合步驟1得到的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到混合產(chǎn)物；
[0038] 步驟3，對混合產(chǎn)物依次進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接，得到帶接頭的產(chǎn)物；
[0039] 步驟4,采用通用引物對接頭連接的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增子文庫；
[0040] 步驟5,對得到的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行高通量測序，得到樣品測序結(jié)果；
[0041]步驟6,對樣品的測序結(jié)果進(jìn)行信息分析，得到樣品的檢測結(jié)果。
[0042] 進(jìn)一步地，在步驟1后，以及步驟2之前，還包括對多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測的步 驟；
[0043] 進(jìn)一步地，步驟3在末端修復(fù)之后還包括對多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，優(yōu)選采 用磁珠對末端修復(fù)產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0044] 進(jìn)一步地，步驟3接頭連接后還包括對多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，優(yōu)選采用磁 珠對接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0045] 進(jìn)一步地，步驟4所述通用引物由LIFE technology公司提供；
[0046]進(jìn)一步地，在步驟4之后，以及步驟5之前，還包括對擴(kuò)增子文庫的純化，優(yōu)選采用 磁珠對接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行純化；
[0047] 進(jìn)一步地，純化反應(yīng)后，還包括對擴(kuò)增子文庫進(jìn)行定量的步驟，優(yōu)選采用QUBIT2.0 熒光計對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量；
[0048] 進(jìn)一步地，定量之后，需要對樣本進(jìn)行油包水的PCR反應(yīng)；
[0049] 進(jìn)一步地，在步驟5之后，以及步驟6之前，還包括對測序結(jié)果的轉(zhuǎn)化。
[0050] 本方法所提到的多重PCR是指:一個混合多種成分在單個孔內(nèi)的擴(kuò)增反應(yīng)體系;來 源于對樣本提取的基因組DNA作為模板。
[0051 ] 得特別說明的是，本方法可以同時檢測GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和 SLC26A4基因的全外顯子。通過使用本方法進(jìn)行檢測，可以檢測已知突變位點(diǎn)和新發(fā)突變位 點(diǎn)。
[0052]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是:本發(fā)明設(shè)計了一套全新的同時檢測4個耳聾基因的全外顯子共 計9497bp的特異性多重PCR引物及使用該引物進(jìn)行檢測的方法。與現(xiàn)有技術(shù)相比，上述技術(shù) 方案應(yīng)用高通量測序技術(shù)進(jìn)行耳聾基因檢測，可以快速準(zhǔn)確的檢測所有位于4個耳聾基因 上的突變位點(diǎn)，包括一直熱點(diǎn)突變和新發(fā)突變。具有高通量、低成本、檢出率高等特點(diǎn)。
[0053]下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，并非對本發(fā)明的限制。凡依照本 發(fā)明公開內(nèi)容所進(jìn)行的本領(lǐng)域等同替換，均屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。
【具體實(shí)施方式】
[0054]在本發(fā)明的實(shí)施例中，采用本發(fā)明的特異性引物及高通量測序方法，對從血液從 提取的DNA樣本進(jìn)行檢測，獲得樣本的耳聾基因檢測結(jié)果。
[0055]以下實(shí)施例的試劑及來源如下：
[0056] DNA提取試劑:購自天根生化科技(北京)有限公司。
[0057] PCR反應(yīng)試劑:合成16組樣品標(biāo)簽序列不同的擴(kuò)增引物;每一組擴(kuò)增引物包括序列 表SEQ ID No. 1-SEQ ID No. 170的核苷酸序列，每條引物的5'端連接表3中的一個樣品標(biāo)簽 序列，同組擴(kuò)增引物的標(biāo)簽序列相同；每一組擴(kuò)增引物均按表2分成8個引物池，引物池 ID No. 1 -引物池 ID No. 8;由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成；
[0058] PCR反應(yīng)試劑:購自寶生物工程(大連)有限公司。
[0059]純化試劑:無水乙醇購自上海西巴斯生物技術(shù)開發(fā)有限公司；
[0060] Nuclease-Free Water購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；
[0061] Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒購自貝克曼庫爾特公司；
[0062] 文庫制備試劑:購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；
[0063] 測序試劑:0ne Touch試劑購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司；
[0064] 測序試劑購自英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司。
[0065]臨床標(biāo)本:遵循知情同意的原則，由連云港市婦幼保健院收集13個家系，43例耳聾 患者的臨床資料及血液樣本，對所有患者進(jìn)行詳細(xì)的病史調(diào)查、全身檢查及聽力學(xué)檢查，并 抽取5mml靜脈血用于基因組DNA的提取。
[0066] 實(shí)施例1:提取全血標(biāo)本中的DNA
[0067] 1)從-20°C冰箱中取出樣品，置于室溫下溶解，同時打開水浴鍋設(shè)為56°C。
[0068] 2)在1.5ml離心管中加入20ul蛋白酶K，加入200ul充分溶解的全血(使用前顛倒混 勻），振蕩混勻，短時離心以去除管內(nèi)壁的液滴。
[0069] 3)加入200ul緩沖液GB，振蕩混勻，短時離心以去除管內(nèi)壁的液滴將離心管放入56 °C中水浴10m i η，并不時輕搖樣品。
[0070] 4)將離心管從水浴鍋中取出，稍冷，加入200ul無水乙醇，振蕩混勻，短時離心后于 室溫靜置3分鐘。
[0071 ] 5)將上述混合液轉(zhuǎn)入吸附柱CR2中，應(yīng)謹(jǐn)慎操作以避免污染提取柱管口，12000rpm 離心30sec，棄廢液液，將吸附柱CR2放回收集管中。
[0072] 6)向吸附柱中加入500ul緩沖液GD(使用前先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。
[0073] 7)向洗脫柱中加入600ul漂洗液PW(使用前先檢查是否已加入無水乙醇）， 12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放回收集管中。
[0074] 8)向洗脫柱中加入600ul漂洗液PW，12000rpm離心30sec，棄廢液，將吸附柱CR2放 回收集管中。
[0075] 9) 12000rpm離心2min，將吸附柱放在新的1.5ml離心管上瞭干3min至乙醇充分揮 發(fā)。
[0076] 10)加入50ul洗脫緩沖液TB，室溫溶解5min，12000rpm離心2min。
[0077] 11)在離心管上貼好相應(yīng)的條形碼，取UU樣品，用于DNA定量分析。
[0078] 12)保存核酸標(biāo)本至-20攝氏度冰箱。
[0079] 實(shí)施例2:多重PCR擴(kuò)增
[0080] 使用實(shí)施例1得到的DNA為模板，進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增。
[0081] 其中所述的多重PCR反應(yīng)體系為25ul體系，具體反應(yīng)體系及反應(yīng)程序如表4和表5 所示。其中"多重PCR引物"為引物池，見表1和表2。
[0082] 表4:引物池 ID No:1_引物池 ID No:4的反應(yīng)體系

[0088] 結(jié)果:每個樣本得到8個多重PCR產(chǎn)物。
[0089]實(shí)施例3:文庫制備
[0090] 將實(shí)施例2得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行混合后使用Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑 盒進(jìn)行純化。純化后的產(chǎn)物進(jìn)行文庫制備，文庫制備步驟如下：
[0091] 1、末端修復(fù)
[0092]表7:末端修復(fù)反應(yīng)體系
[0094]將反應(yīng)體系震蕩混勻并離心后，室溫孵育20min。孵育結(jié)束后使用Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒進(jìn)行純化，最后溶解在27ul無核酶水中。
[0095] 2、接頭連接
[0096]表8:接頭連接反應(yīng)體系
[0098] 將接頭連接反應(yīng)混合震蕩混勻并離心后，置于PCR儀上，25攝氏度孵育15min，72攝 氏度孵育5min。孵育結(jié)束后，使用Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒進(jìn)行純化，最后溶 解在30ul無核酶水中。
[0099] 3、PCR 反應(yīng)
[0100] 表9:PCR反應(yīng)體系：
[0102] 將接頭連接反應(yīng)MIX震蕩混勻并離心后，置于PCR儀上，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體反應(yīng)程 序如下：
[0103] 表10:PCR反應(yīng)程序
[0105] PCR反應(yīng)在ABI公司的VERITI PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)結(jié)束后，使用Agencourt AMPure XP-核酸純化試劑盒進(jìn)行純化，最后溶解在25ul無核酶水中，使用QUBIT熒光計對純 化后的產(chǎn)物進(jìn)行定量，得到擴(kuò)增文庫。
[0106] 實(shí)施例4:高通量測序反應(yīng)
[0107] 將實(shí)施例3得到的制備好的擴(kuò)增文庫，經(jīng)過one Touch試劑(英濰捷基(上海）貿(mào)易 有限公司）進(jìn)行油包水反應(yīng)，而后將油包水反應(yīng)產(chǎn)物上樣至測序反應(yīng)芯片上，最后使用LIFE TECHNOLOGY公司測序儀PGM進(jìn)行測序。具體操作步驟如下：
[0108] 1、將實(shí)施例3制備好的文庫稀釋成100pM;
[0109] 2、按照LIFE TECHNOLOGY公司One Touch 2儀器操作說明，安裝好0T2儀器相關(guān)耗 材；
[0110] 3、按照表11配制0T2擴(kuò)增反應(yīng)液
[0111] 表11
[0113] 4、將制備好的0T2擴(kuò)增反應(yīng)液及油相反應(yīng)液按照操作說明加入至適配器中，啟動 0T2儀器開始進(jìn)行油包水反應(yīng)；
[0114] 5、油包水反應(yīng)完成后，使用0T2ES系統(tǒng)對油包水?dāng)U增反應(yīng)完成的產(chǎn)物進(jìn)行回收富 集；
[0115] 6、將回收富集好的油包水PCR反應(yīng)產(chǎn)物中加5ul Control Ion Sphere Particles (質(zhì)控離子球顆粒，ISP)，然后再加 lOOul Annealing Buffer(退火緩沖液），用吸頭吹打混 勾，15500g離心2min (注意離心管方向）。小心去除上清至剩余3ul，往管里面加3ul Sequencing Primer(測序引物），用移液器吹打混勻，使ISPs懸浮。將離心管放在PCR儀上運(yùn) 行以下程序：95 °C，2min; 37 °C，2min; 15°C，①。從PCR儀上取出樣品，往里面加入lul PGM 200Sequencing Polymerase (測序反應(yīng)聚合酶），使總體積為7ul，吹打混勾后室溫孵育 5min〇
[0116] 7、準(zhǔn)備好PGM測序儀初始化試劑，將PGM測序儀進(jìn)行初始化，初始化試劑如表12:
[0117]表12
[0120] 8、孵育好的油包水反應(yīng)產(chǎn)物上樣至PGM測序儀配套314芯片上，上樣完成后直接置 于初始化完成的測序儀上開始測序反應(yīng)。
[0121] 實(shí)施例5:信息分析檢測耳聾基因突變
[0122] 將本發(fā)明檢測方法用于43例臨床標(biāo)本檢測，得到4個基因所有SNP結(jié)果，經(jīng)過過濾 得到每個樣本的基因突變結(jié)果，檢測結(jié)果與sanger測序結(jié)果進(jìn)行比對，比對結(jié)果如下：
[0123] 表13

[0126] 綜上所述，使用本發(fā)明所述引物及檢測方法，可以準(zhǔn)確快速的檢測非綜合征型耳 聾基因多態(tài)性，且準(zhǔn)確性與sanger測序法進(jìn)行比較，一致性達(dá)到100%。因此，本發(fā)明可用于 耳聾基因檢測，在臨床上具有較大的應(yīng)用及推廣價值。
[0127] 實(shí)施例6:檢測耳聾基因的試劑盒
[0128] -、試劑組成
[0129] l、rTaq 酶，5U/ul
[0130] 2、10X PCR反應(yīng)緩沖液，市售
[0131] 3、dNTP 混合液，2.5mM
[0132] 4、LA Taq酶，5U/ul
[0133] 5、2XGC反應(yīng)緩沖液，市售
[0134] 6、滅菌蒸餾水
[0135] 7、引物混合液（lOOuM):引物混合液分為引物池 1，引物池 2,引物池 3,引物池 4,引 物池5,引物池6,引物池7,引物池8。引物的序列和引物池分組情況見表1和表2。
[0136] 二、耳聾基因檢測試劑盒的使用方法：
[0137] 1、使用市場通用DNA提取試劑盒提取出待測樣本DNA，方法同實(shí)施例1;
[0138] 2、使用本試劑盒對提取好的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法同實(shí)施例2;
[0139] 3、而后使用LIFE TECHNOLOGY公司通用建庫及測序試劑進(jìn)行二代測序，方法同實(shí) 施例3和4;
[0140] 4、測序結(jié)果使用計算機(jī)進(jìn)行自動分析，根據(jù)分析結(jié)果判定是否存在突變，方法同 實(shí)施例5。
[0141] 實(shí)施例7:檢測耳聾基因的試劑盒
[0142] 一、試劑組成
[0143] l、rTaq 酶，5U/ul
[0144] 2、10X PCR反應(yīng)緩沖液，市售
[0145] 3、dNTP 混合液，2.5mM
[0146] 4、LA Taq酶，5U/ul
[0147] 5、2XGC反應(yīng)緩沖液，市售
[0148] 6、滅菌蒸餾水
[0149] 7、引物混合液（lOOuM): 16組引物混合液，每組引物混合液分為引物池1，引物池2， 弓丨物池3,引物池4,引物池5,引物池6,引物池7,引物池8。引物的序列和引物池分組情況見 表1和表2。每條引物的5'端連接表3中的一個樣品標(biāo)簽序列，同組擴(kuò)增引物的樣品標(biāo)簽序列 相同。
[0150] 二、耳聾基因檢測試劑盒的使用方法：
[0151] 1、使用市場通用DNA提取試劑盒提取出待測樣本DNA，方法同實(shí)施例1;
[0152] 2、使用本試劑盒對提取好的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，方法同實(shí)施例2;
[0153] 3、而后使用LIFE TECHNOLOGY公司通用建庫及測序試劑進(jìn)行二代測序，方法同實(shí) 施例3和4;
[0154] 4、測序結(jié)果使用計算機(jī)進(jìn)行自動分析，根據(jù)分析結(jié)果判定是否存在突變，方法同 實(shí)施例5。
【主權(quán)項】
1. 一組檢測耳聾基因的特異性引物，其特征在于：具有序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 170所示的核苷酸序列。2. -種檢測耳聾基因的試劑盒，其特征在于：包含序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 170所示的引物序列。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種檢測耳聾基因的試劑盒，其特征在于:所述引物序列的5' 端帶有一個樣本標(biāo)簽序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種檢測耳聾基因的試劑盒，其特征在于:所述樣本標(biāo)簽序列 為6~12個堿基的核苷酸序列。5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的一種檢測耳聾基因的試劑盒，其特征在于所述樣本標(biāo)簽序 列選自下述核苷酸序列中的一個或多個： (1) CTGCGACT； (2) TGTAGATA； (3) TGATATCT； ⑷CGATGCTA; (5) AGACTAGA； (6) TGTCTGTG； (7) CATACTGA； (8) TGCTCGCA； (9) ATGAGTAG； (10) CTCACTAT； (11) GTACTACT； (12) TAGACTAG； (13) TATGCTAC； (14) ACTCGCTG； (15) ATCACGCA； (16) GCATGTGA。6. 根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項所述的一種檢測耳聾基因的試劑盒，其特征在于:所述 檢測耳聾基因的試劑盒，還包括^&9酶（51]/111)、10\?01?反應(yīng)緩沖液、(11^?混合液 (2 · 5mM)、LA Taq酶、2 X GC反應(yīng)緩沖液和滅菌蒸餾水。7. -種檢測耳聾基因的方法，其特征在于:使用序列表SEQ ID No. 1至SEQ ID No. 170 所示的核苷酸序列同時檢測樣本的GJB2基因、GJB3基因、12S rRNA基因和SLC26A4基因的全 外顯子序列并對測序結(jié)果進(jìn)行信息分析。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的一種檢測耳聾基因的方法，其特征在于包括以下步驟： 步驟1，用標(biāo)簽引物對目的樣品進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，標(biāo)簽引物是序列表SEQ ID No.1至 SEQ ID No. 170所示的引物序列，在5'端連接權(quán)利要求5的標(biāo)簽序列組成，得到多重PCR擴(kuò)增 產(chǎn)物； 步驟2，混合步驟1得到的多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到混合產(chǎn)物； 步驟3，對混合產(chǎn)物依次進(jìn)行末端修復(fù)和接頭連接，得到帶接頭的產(chǎn)物； 步驟4,采用通用引物對接頭連接的產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，得到擴(kuò)增子文庫； 步驟5,對得到的擴(kuò)增子文庫進(jìn)行高通量測序，得到樣品測序結(jié)果； 步驟6，對樣品的測序結(jié)果進(jìn)行信息分析，得到樣品的檢測結(jié)果。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種用于檢測耳聾基因檢測的方法，其特征在于:所述步驟1 后、步驟2之前，還包括對多重PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測的步驟； 步驟3在末端修復(fù)之后還包括對多個擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟，優(yōu)選采用磁珠對末端 修復(fù)產(chǎn)物進(jìn)行純化； 步驟4所述通用引物由LIFE technology公司提供； 步驟4之后，以及步驟5之前，還包括對擴(kuò)增子文庫的純化，優(yōu)選采用磁珠對接頭連接產(chǎn) 物進(jìn)行純化； 所述純化反應(yīng)后，還包括對擴(kuò)增子文庫進(jìn)行定量的步驟，優(yōu)選采用QUBIT2.0熒光計對 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定量； 定量之后，需要對樣本進(jìn)行油包水的PCR反應(yīng)； 步驟5之后，以及步驟6之前，還包括對測序結(jié)果的轉(zhuǎn)化。10. 權(quán)利要求1所述的特異性引物用于制備檢測耳聾的診斷試劑的用途。
【文檔編號】C12N15/11GK105936940SQ201610510290
【公開日】2016年9月14日
【申請日】2016年6月30日
【發(fā)明人】楊光輝, 岑忠, 崔書建
【申請人】上海凡迪生物科技有限公司