專利名稱：Pcdh17基因的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及ー種P⑶H17基因的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃腸腫瘤是人類最常見的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計胃腸腫瘤約占全世界總腫瘤的20%。胃癌和大腸癌在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率仍位居第三至四位，其在癌癥導(dǎo)致的死亡率中也占據(jù)第ニ到三位。盡管以手術(shù)、化療、放療為主體的腫瘤綜合治療已經(jīng)顯著改善和提高了胃腸道腫瘤患者的治愈率，但目前對于胃腸道腫瘤的早期診斷和早期治療還缺乏特異性的檢測手段和治療方法，因此尋找一種新的腫瘤標(biāo)志物顯得十分迫切。目前的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胃癌的發(fā)生經(jīng)歷萎縮一化生一非典型增生ー癌四個階段；結(jié)直腸癌的發(fā)生經(jīng)歷腺瘤一腺癌兩個階段。在胃腸道腫瘤的這種表型演變過程中，表觀遺傳修飾尤其是DNA甲基化扮演著ー個重要的角色。DNA甲基化常常導(dǎo)致選擇性基因的啟動子區(qū)域過度甲基化和某些抑癌基因的表達(dá)沉默。目前的研究認(rèn)為，腫瘤抑癌基因的表觀遺傳調(diào)控失調(diào)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用。新的甲基化基因的鑒定能夠?yàn)槟[瘤的監(jiān)測、預(yù)防、診斷和治療提供ー種新的策略。PO)Hs (protocadherins)是cadherins超家族中的新的亞群,但它們的功能卻與cadherins有明顯的不同。Cadherins是ー組與細(xì)胞粘附能力相關(guān)的膜蛋白，它們的主要功能是介導(dǎo)Ca2+依賴的細(xì)胞粘附。而目前越來越多的研究表明PCDHs的主要功能并不是介導(dǎo)細(xì)胞粘附而是促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞間的相互作用。到目前為止，在人類和動物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)70多種protocadherin基因。根據(jù)基因結(jié)構(gòu)不同，這些基因被分為成簇的protocadherins、非成族的protocadherins和其它類型的protocadherins三類。成族的protocadherins 主要包括 a-protocadherin、旦-protocadherin、Y-protocadherin 三型；非成族的 protocadherins 進(jìn)一步被分 S 1-protocadherin 和 S 2-protocadherin 兩個亞類。這些新發(fā)現(xiàn)的protocadherin基因被報道具有調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞生長和抑制腫瘤形成的作用，而且越來越多的研究顯示這些基因中的某些基因在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著抑癌基因的角色，它們的存在能夠抑制腫瘤的發(fā)生。表觀遺傳學(xué)作為腫瘤形成和發(fā)展過程中的一個決定因子在近年來受到了越來越多的關(guān)注。表觀遺傳修飾的機(jī)制有很多，其中DNA甲基化是最重要的ー種方式。DNA甲基化是指生物體在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases , DNMTs)的催化下，以S-腺苷甲硫氨酸(SAM)為甲基供體，將甲基轉(zhuǎn)移到特定的堿基上的過程。DNA甲基化可以發(fā)生在腺嘌呤的N-6位、胞嘧啶的N-4位、鳥嘌呤的N-7位或胞嘧啶的C-5位等，哺乳動物中DNA甲基化主要發(fā)生在5’ -CpG-3’的C上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG 二核苷酸在基因中的分布并不是均一的，一般分為兩種形式ー種是分散于DNA中，另ー種是CpG結(jié)構(gòu)高度聚集的CpG島。在人類基因組中，大約70%的基因啟動子區(qū)有CpG島存在，一般在0.5 3Kb不等，常位于基因的5’端啟動子區(qū)域，也可延伸至基因的外顯子區(qū)域。啟動子區(qū)中CpG島的未甲基化狀態(tài)是基因轉(zhuǎn)錄所必需的，而CpG序列中的C-5的甲基化可導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄被抑制。對于很多基因來說，基因內(nèi)部區(qū)域的甲基化與基因沉默沒有關(guān)聯(lián)，只有將啟動子CpG島區(qū)域甲基化才能導(dǎo)致其表達(dá)沉默。DNA甲基化在基因突變，基因表達(dá)調(diào)控，細(xì)胞増殖、分化和發(fā)育等方面起重要作用。盡管DNA甲基化的精確分子機(jī)制尚未闡明，但是腫瘤抑癌基因通過啟動子甲基化而導(dǎo)致的基因表達(dá)沉默已經(jīng)被證明在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中扮演著重要的作用。在腫瘤細(xì)胞中甲基化模式表現(xiàn)為全基因組廣泛的低甲基化伴隨某些基因(如腫瘤抑癌基因)啟動子CpG島區(qū)域的高度甲基化。低甲基化可誘導(dǎo)原癌基因和轉(zhuǎn)座子成分活化，基因印跡缺失以及增加染色體的不穩(wěn)定性；同時，在整體低甲基化的水平下，某些腫瘤抑癌基因發(fā)生高度甲基化，導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，最終誘發(fā)腫瘤。既往我們的研究顯示在胃腸道癌組織和癌旁組織中某些腫瘤抑癌基因的啟動子被甲基化，這提示DNA甲基化可能與腫瘤發(fā)生的多個階段相關(guān)。而且這些甲基化的基因在不同的腫瘤組織中表達(dá)不同，因此這些甲基化基因的鑒定將為腫瘤的預(yù)防、監(jiān)測和治療提供一種新的策略。 PCDHl7 (protocadherin 17)是 3 2-protocadherin 家族的一員，它已經(jīng)被報道在正常胃粘膜組織和胃癌組織以及正常腸粘膜組織和結(jié)直腸腸癌組織中的甲基化狀態(tài)呈明顯差異，但是其在胃癌和結(jié)直腸癌中的生物學(xué)功能以及其與胃癌和結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制目前還不清楚。此外，PCDH17也被報道在食管癌中高度甲基化且甲基化的PCDH17與食管癌的低分化有夫。在食管癌細(xì)胞株中重表達(dá)PCDH17后，食管癌細(xì)胞的増殖和遷移能力降低，這進(jìn)ー步說明TODH17可以抑制食管癌的發(fā)生。我們通過MSP (MethylmionSpecific PCR)也證實(shí)在胃腸腫瘤中KDH17的啟動子常常發(fā)生甲基化?；谏鲜鲅芯炕A(chǔ)，我們認(rèn)為PCDH17在胃腸腫瘤中可能扮演著抑癌基因的角色，但其在胃腸腫瘤中的生物學(xué)功能和可能的作用機(jī)制尚未闡明。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供PCDH17基因的新應(yīng)用，一方面該基因可作為胃癌和結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物，有利于胃癌和結(jié)直腸癌的早期監(jiān)測和預(yù)防，另一方該基因可作為胃癌和結(jié)直腸癌化學(xué)治療敏感性檢測的新靶點(diǎn)，有利于指導(dǎo)胃癌和結(jié)直腸癌的化學(xué)治療。所述的ー種PCDH17基因在制備診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。所述的ー種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR或甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品。所述的ー種P⑶H17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用RT-PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品至少含有ー對特異擴(kuò)增PCDHl7基因的引物。所述的ー種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品至少含有ー對特異擴(kuò)增PCDHl7基因的引物。所述的ー種P⑶H17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用RT-PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中特異擴(kuò)增TODH17基因的引物序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID N0:2所示。所述的ー種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中特異擴(kuò)增TODH17基因的引物如SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :6所示。所述的ー種PCDH17基因作為胃癌和結(jié)直腸癌化學(xué)治療敏感性檢測新靶點(diǎn)的應(yīng)用。
本發(fā)明證明P⑶H17在大多數(shù)腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中表達(dá)沉默或降低，而且在這些表達(dá)沉默或降低的腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織中P⑶H17均被檢測到高度甲基化，但在胃腸道正常粘膜組織中P⑶H17卻未被檢測到甲基化的發(fā)生。P⑶H17蛋白在胃腸道正常粘膜組織中呈高表達(dá)(正常胃粘膜組織中高表達(dá)率100% ;正常腸粘膜組織中高表達(dá)率90%)，而在大部分胃腸腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)缺失(僅16. 7%的胃癌樣本顯示低表達(dá)；16%的腸癌樣本顯示低表達(dá))。P⑶H17蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的低分期(P=O. 027)和較少的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=O. 039)顯著相關(guān)。細(xì)胞株轉(zhuǎn)染P⑶H17后，通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)P⑶H17能抑制腫瘤細(xì)胞的生長、促進(jìn)5-FU誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞凋亡、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)自噬現(xiàn)象。本發(fā)明PCDH17基因?yàn)槲改c腫瘤的早期診斷提供了ー種新的標(biāo)志物，同時為增強(qiáng)胃腸腫瘤化學(xué)治療的效果提供了ー個新的靶點(diǎn)。


圖IA是實(shí)施例I中P⑶H17在所有正常成人組織中均表達(dá)示意圖。圖IB是實(shí)施例I中P⑶H17在胃癌和腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)被沉默或下調(diào)表達(dá)示意圖。圖IC是實(shí)施例I中表示KDH17 CpG島的序列圖，其中共有37個CpG島位點(diǎn)被分析，甲基化特異性PCR (MSP)和亞硫酸鹽基因序列區(qū)域(BGS)也被包含在圖中。圖2是實(shí)施例5中P⑶H17蛋白在正常胃、結(jié)腸粘膜和和它們的原發(fā)腫瘤組織中的表達(dá)情況圖。其中(A) P⑶H17在正常胃粘膜(a)和原發(fā)胃癌組織(b、c)中的表達(dá)情況；(B)P⑶H17在正常結(jié)腸粘膜(d)和原發(fā)結(jié)直腸癌組織(e、f)中的表達(dá)情況；(C) P⑶H17在結(jié)直腸管狀腺瘤(g)、鋸齒狀腺瘤(h)和絨毛狀腺瘤(i)組織中的表達(dá)情況。放大倍數(shù)200X。圖3是實(shí)施例10中腫瘤細(xì)胞經(jīng)5-FU處理16h后，各組細(xì)胞熒光顯微鏡下形態(tài)觀察圖。圖4是實(shí)施例11中流式細(xì)胞儀檢測P⑶H17對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響分析圖。圖5A是實(shí)施例13中免疫熒光觀察分析圖。圖5B是實(shí)施例13中流式細(xì)胞儀檢測分析圖。圖6是實(shí)施例14代表性的GFP-LC3B轉(zhuǎn)染后細(xì)胞自噬的觀察結(jié)果圖。圖7是實(shí)施例15 Western-blot檢測P⑶H17對自噬相關(guān)通路關(guān)鍵蛋白的影響圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)ー步詳細(xì)的說明。以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例I P⑶H17的表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)檢測。I.組織分離
人胃腸組織標(biāo)本均取自浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院2004年2月至2006年6月未行新輔助治療而直接手術(shù)切除、病理證實(shí)為原發(fā)腺癌的患者，經(jīng)病人知情同意后獲得患者的手術(shù)標(biāo)本。每個手術(shù)標(biāo)本包括腫瘤組織、癌旁組織和對應(yīng)的遠(yuǎn)腫瘤的正常組織(距腫瘤5 cm以上)。從手術(shù)室獲取胃腸組織標(biāo)本后，每個部位的標(biāo)本立即分成3個部分，2個部分立即置于、液氮中進(jìn)行保存，其中I個部分用于提取RNA，另I部分用于提取蛋白。第3部分置入福爾馬林中固定24 h，然后送到病理科進(jìn)行石蠟包埋，以待后用。本研究選取術(shù)后原發(fā)胃癌標(biāo)本99例(任選36例行免疫組化)，正常胃粘膜標(biāo)本10例，原發(fā)結(jié)直腸癌標(biāo)本96例(任選50例行免疫組化)，結(jié)直腸腺瘤標(biāo)本30例管狀腺瘤10例(病理類型為輕度或中度非典型增生、鋸齒狀腺瘤10例(病理類型為低級別上皮內(nèi)瘤變)、絨毛狀腺瘤10例(病理類型為低級別上皮內(nèi)瘤變)，正常結(jié)腸粘膜標(biāo)本10例。2.提取總 RNA
采用Trizol抽提法提取細(xì)胞或組織總RNA。3.逆轉(zhuǎn)錄
RT-PCR采用美國Promega公司試劑，按試劑說明書進(jìn)行，得到cDNA產(chǎn)物保存于_20°C備用。4.聚合酶鏈反應(yīng)
獲取檢測目的基因核苷酸序列，通過軟件設(shè)計PCR引物，經(jīng)Blast進(jìn)行同源性分析證實(shí)其特異性，設(shè)計合成 PO)H17 引物。PCDH17RT-F :CGGAGGTGATGTATCTCAAA (SEQ ID NO:I) ;PCDH17RT-R :CAGGAGCCTTTGTTAGTGTC (SEQ ID NO :2)。GAPDH 引物作為對照內(nèi)參引物:GAPDH-F TCCTGTGGCATCCACGAAACT (SEQ ID NO 3)；GAPDH-R GAAGCATTTGCGGTGGACGAT (SEQID NO :4)。取2 ill進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用25 U I反應(yīng)體系，如下無核酶水15. 875 u I ； 10 X buffer 2. 5u I ；MgC12 (25mM) 1. 5u I ；dNTP (2. 5mM) 2u I ;上游引物(IOiiM) 0. 5u I ;下游引物(IOiiM) 0. 5u I ；cDNA 2u I ;Taq 酶(5U/iU) :0. 125 yl。采用溫度梯度PCR，具體的循環(huán)參數(shù)為95°C變性IOmin ;94°C 30sec，60 50°C30sec,72°C 30sec, 10 個循環(huán)，94で 30sec,50°C 30sec,72°C 30sec, 30 個循環(huán)；末次延伸72°C 7min，之后進(jìn)入4°C維持。循環(huán)完成后，取IOiU PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像，分析結(jié)果。5.甲基化特異性PCR (MSP)
5. I提取組織基因組DNA
用全基因組DNA提取試劑盒(天根，中國)提取組織基因組DNA，按照說明書進(jìn)行操作。冷凍保存的組織標(biāo)本，約50 lOOmg，在液氮環(huán)境下用研缽迅速將其研磨成細(xì)小均勻之粉末，將粉末倒入含1.5ml的Eppendorf管中。加入20yl蛋白酶K混勻，然后加入200 yl緩沖液GB，充分顛倒混勻，70°C水浴lOmin，溶液變清亮，簡短離心去除內(nèi)壁水珠，加入200 Ul無水こ醇，充分震蕩混勻15秒，可出現(xiàn)絮狀沉淀，簡短離心去除內(nèi)壁水珠，將EP管中所有物都加到柱CB3中，12000rpm離心30秒，棄去離下的廢液，向柱CB3中加入500 y I⑶(已加入こ醇)，12000rpm離心30秒，棄去離下的廢液，向柱CB3中加入700 U I漂洗液PW(已加入こ醇)，12000rpm離心30秒，棄去離下的廢液，再向柱CB3中加入500 U I漂洗液PW(已加入こ醇)，12000rpm離心30秒,棄去離下的廢液，12000rpm空離2min。將柱CB3置于干凈EP管內(nèi)，向吸附膜中間部分加入50-200 u I洗脫液TE，室溫放置2_5min，2000rpm離心2min，收集所提取的DNA。
5. 2重亞硫酸鹽處理DNA
上述基因組DNA，用德國Qigen公司的甲基化試劑盒進(jìn)行重亞硫酸鹽處理，操作按照說明書進(jìn)行，得到DNA。5. 3甲基化引物
DNA經(jīng)重亞硫酸鹽處理后，已甲基化的胞嘧啶不變，而未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。利用這ー原理，我們在同一位點(diǎn)設(shè)計兩對引物，一對針對甲基化的序列，另ー對針對非甲基化的序列。PCDH17-mF GATTATCGGGTGTCGTAG TTC (SEQ ID NO :5) ;PCDH17_mR CCCTAACGCAACGTACGCGCSEQ ID NO :6)。PCDHl7_uF :AGATTATTGGGTGTTGTAGTTT(SEQ ID NO:7) ;PCDH17-uR :AACCCTAACACAACATACACA (SEQ ID NO :8)。5.4甲基化特異性PCR(MSP) 使用 25 u I 體系進(jìn)行擴(kuò)增無核酶水13. 375 u I ； 10 X buffer 2. 5u I ；MgC12 (25mM)2u I ；dNTP (2. 5mM) 2u I ;上游引物(IOyM) 1. 5u I ;下游引物(IOyM) 1. 5u I ；DNA 2u I ； Taq-Go Id (5U/u I) :0. 125 ii I。PCR 具體的循環(huán)參數(shù)為95°C IOmin ；94°C 30s，58°C 30s，72°C 30s，35 個循環(huán)；末次循環(huán)延伸時間為72°C lOmin，然后進(jìn)入4°C維持。循環(huán)完成后，取IOyl PCR產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳，成像，分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過半定量RT-PCR檢測了 21種正常成人組織、17株胃癌細(xì)胞株和9株腸癌細(xì)胞株中P⑶H17的表達(dá)水平。結(jié)果顯示P⑶H17在所有正常成人組織中均有不同程度的表達(dá)(21/21)(圖I A);但在17株胃癌細(xì)胞株中僅有2株表達(dá)P⑶H17，其余胃癌細(xì)胞株中PCDH17的表達(dá)被完全沉默；在9株腸癌細(xì)胞株中，僅DNMTs被敲除的細(xì)胞株HCTl 16/DKO表達(dá)KDH17，其余腸癌細(xì)胞株中P⑶H17的表達(dá)亦被完全沉默(圖I B)。這說明KDH17在絕大多數(shù)胃腸道腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)沉默或下調(diào)?；赑⑶H17的CpG島序列(圖I C)，我們設(shè)計了相應(yīng)的MSP引物來分析PCDH17 CpG島的甲基化狀態(tài)。所有PCDH17表達(dá)沉默或下調(diào)的腫瘤細(xì)胞株均檢測到CpG島被甲基化。這說明PCDH17在大多數(shù)胃腸道腫瘤細(xì)胞株中表達(dá)沉默或下調(diào)與該基因的CpG島發(fā)生甲基化相關(guān)。實(shí)施例2去甲基化試劑5-Aza和組蛋白去こ?；敢种苿㏕SA處理細(xì)胞。將P⑶H17表達(dá)沉默的細(xì)胞株接種于直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，每皿接種I X 106個細(xì)胞。待過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞被去甲基化試劑5-Aza (終濃度IOii mol/L)處理三天，再用組蛋白去こ?；敢种苿㏕SA (終濃度300nmol/L)處理24小吋。最后收集上述被處理的細(xì)胞，提取DNA和RNA備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，P⑶H17表達(dá)沉默的胃癌細(xì)胞株YCCEL1、SNU719和腸癌細(xì)胞株HCT116、SW480用5_Aza和TSA處理后，再次提取RNA和DNA檢測P⑶H17的表達(dá)水平和甲基化狀態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四株細(xì)胞中PCDH17的表達(dá)均被不同程度的修復(fù)，這說明DNA甲基化是導(dǎo)致胃腸道腫瘤細(xì)胞中P⑶H17表達(dá)沉默的原因。實(shí)施例3代表性的BGS結(jié)果。我們通過BGS檢測了 P⑶H17基因中37個CpG島位點(diǎn)的詳細(xì)甲基化圖譜，被檢測的37個CpG島位點(diǎn)也包括經(jīng)MSP分析的CpG島位點(diǎn)。結(jié)果顯示在正常胃粘膜組織和DNMTs被敲除的細(xì)胞株HCTl 16/DK0中，P⑶H17 CpG島的甲基化發(fā)生率非常低，而在不表達(dá)P⑶H17的胃癌細(xì)胞株YCCELl、SNU719和腸癌細(xì)胞株HCTl 16、SW480中濃密的甲基化CpG島位點(diǎn)被大量檢測到。而且使用5-Aza和TSA處理不表達(dá)P⑶H17的胃癌細(xì)胞株YCCELl、SNU719和腸癌細(xì)胞株HCTl 16、SW480后再次檢測CpG島的甲基化狀態(tài)，BGS結(jié)果顯示P⑶H17 CpG島位點(diǎn)明顯被去甲基化，這與實(shí)例I MSP結(jié)果相一致。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示P⑶H17 CpG島位點(diǎn)的甲基化與該基因的表達(dá)沉默明顯相關(guān)。實(shí)施例4 MSP檢測正常組織(N)和腫瘤組織(T)中P⑶H17的甲基化水平。我們通過MSP檢測了 10例正常胃粘膜組織、10例正常結(jié)腸粘膜組織、99例原發(fā)胃癌組織和96例原發(fā)結(jié)直腸腸癌組織中P⑶H17的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示正常胃和結(jié)腸粘膜組織中未檢測到P⑶H17基因的甲基化；而在所有癌組織中，P⑶H17均被檢測到發(fā)生甲基化，這說明PCDH17的甲基化狀態(tài)與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。
實(shí)施例5免疫組化檢測P⑶H17的表達(dá)水平并分析與胃腸道腫瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性。I脫蠟和水化、2抗原修復(fù)暴露抗原決定族、3阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、4去除其他非特異性背景、5 —抗孵育、6 ニ抗孵育、7顯色、8復(fù)染、脫水、透明、封片。統(tǒng)計學(xué)分析
本研究的統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS16. 0完成。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差(SD)或均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)描述，組間比較采用方差分析完成。P⑶H17表達(dá)水平與腫瘤樣本臨床特征相關(guān)性分析用two-tailed Chi-squaretest完成。對于PO)H17表達(dá)水平與腫瘤患者生存相關(guān)性分析，各組間差異通過log-rank tset比較,并通過Kaplan-Meier繪制生存曲線。P〈0. 05時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。我們通過免疫組化檢測了 10例正常胃粘膜組織，10例正常結(jié)腸粘膜組織，36例原發(fā)胃癌組織，30例結(jié)直腸腺瘤組織管狀腺瘤10例(病理類型為輕度或中度非典型增生、鋸齒狀腺瘤10例(病理類型為低級別上皮內(nèi)瘤變)、絨毛狀腺瘤10例(病理類型為低級別上皮內(nèi)瘤變)和50例原發(fā)結(jié)直腸癌組織中P⑶H17蛋白的表達(dá)水平。代表性的免疫組化染色結(jié)果見圖2。研究發(fā)現(xiàn)，P⑶H17在正常胃、結(jié)腸粘膜的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)以及ー些間質(zhì)細(xì)胞中高表達(dá)，反而在大部分原發(fā)胃癌和腸癌組織中表達(dá)缺失。與所有正常胃、結(jié)腸粘膜中P⑶H17的高表達(dá)相比較，胃癌中僅有16. 7% (6/36)顯示P⑶H17低表達(dá)，腸癌中僅有16% (8/50)顯示PCDH17低表達(dá)。有意思的是，在結(jié)直腸管狀腺瘤和結(jié)直腸鋸齒狀腺瘤中P⑶H17的陽性表達(dá)率與正常結(jié)腸粘膜中P⑶H17的陽性表達(dá)率相仿，而在結(jié)直腸絨毛狀腺瘤中P⑶H17的陽性表達(dá)率與原發(fā)結(jié)直腸癌組織中P⑶H17的陽性表達(dá)率相仿。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果給我們提示PCDH17甲基化可能發(fā)生在腫瘤發(fā)生的早期，其表達(dá)水平愈高，腫瘤的惡性程度愈低。其次我們分析了 PCDH17蛋白的表達(dá)水平與胃腸道腫瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在結(jié)直腸癌組織中，P⑶H17蛋白的表達(dá)與結(jié)直腸癌的低分期(P =0. 027)和較少的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P =0. 039)具有明顯相關(guān)性，但在胃癌中，統(tǒng)計結(jié)果并未顯示P⑶H17的表達(dá)水平與胃癌樣本的臨床特征相關(guān)(P > 0. 05)，這可能與樣本量較小有夫。根據(jù)上述實(shí)施例1-5結(jié)果，表明P⑶H17在胃腸道腫瘤中扮演抑癌基因的角色，該基因的表達(dá)能夠抑制腫瘤細(xì)胞的増殖；而且PCDH17甲基化在胃腸道腫瘤中是ー個經(jīng)常發(fā)生的、腫瘤特異的分子事件。正常結(jié)直腸粘膜組織中P⑶H17蛋白的陽性表達(dá)率與結(jié)直腸管狀腺瘤和鋸齒狀腺瘤組織中PCDH17蛋白的陽性表達(dá)率相仿；而在結(jié)直腸癌組織中PCDH17蛋白的陽性表達(dá)率與結(jié)直腸絨毛狀腺瘤組織中PCDH17蛋白的陽性表達(dá)率相仿。這說明，P⑶H17表達(dá)沉默可能主要發(fā)生在結(jié)直腸癌形成的早期，其表達(dá)水平愈高腫瘤的惡性程度愈低。因此PCDH17具有作為ー個腫瘤標(biāo)志物用于結(jié)直腸癌的早期診斷和癌變風(fēng)險評估的潛倉^:。實(shí)施例6 P⑶H17轉(zhuǎn)染后對腫瘤細(xì)胞增殖能力的影響 脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及克隆篩選
(OG418篩選濃度的確定將5X IO4個生長良好的MKN45和HCTl 16細(xì)胞接種于24孔板，分別在含10% FBS的RPML1640培養(yǎng)液和McCOY’ s 5A培養(yǎng)液中培養(yǎng)24小時后，按不同濃度加入 G418，共設(shè) 8 個濃度梯度，分別為 0,31. 25ii g/ml、62. g/ml、125ii g/ml、250ii g/ml>500 v- g/ml>1000 u g/ml和2000 u g/ml,姆個濃度設(shè)3個復(fù)孔,培養(yǎng)液姆3天更換一次，并于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況。培養(yǎng)10天后，取同一濃度的三個復(fù)孔內(nèi)細(xì)胞全部死亡的最低濃度作為以后篩選的G418工作濃度。若選取的濃度與相鄰較低濃度跨度較大，則在兩個濃度間再取多個濃度重復(fù)篩選。
(2)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染脂質(zhì)體介導(dǎo)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染采用美國OriGene公司Mega tranl. 0系統(tǒng)完成，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染前I天，取處于對數(shù)期生長的MKN45和HCT116細(xì)胞5. 0 X IO5個細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)過夜，使轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞的融合度達(dá)到50-70%左右。轉(zhuǎn)染時，在0.6ml的Eppendorf管中加入IOOiU 0PTI-MEM和3 y g的質(zhì)粒，混勻，然后加入9iil的Mega tranl. 0，渦旋振蕩10秒，室溫靜置10分鐘，然后逐滴加入培養(yǎng)孔內(nèi)并輕輕搖動使其盡量混勻，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。(3)克隆篩選轉(zhuǎn)染24小時后，轉(zhuǎn)染細(xì)胞按一定比例稀釋接種于直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，用含篩選工作濃度G418的培養(yǎng)液進(jìn)行篩選培養(yǎng)，培養(yǎng)液3天更換一次，一般10天左右，未轉(zhuǎn)染的對照組細(xì)胞在G418作用下全部被殺死，而轉(zhuǎn)染組細(xì)胞可以看到部分耐藥克隆開始形成集落。在集落的細(xì)胞個數(shù)達(dá)到50個左右時，選擇相對孤立的克隆，在無菌操作臺上將克隆挑至新的培養(yǎng)器皿內(nèi)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中應(yīng)用含較低濃度(通常為篩選工作濃度的1/2左右)G418的培養(yǎng)液，以防止喪失G418抗性的細(xì)胞的聚集。通過培養(yǎng)和傳代，獲得足夠的克隆細(xì)胞，提取相應(yīng)的RNA和蛋白，分析轉(zhuǎn)染效果，選擇PCDH17高表達(dá)的細(xì)胞作為研究對象?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)
克隆形成實(shí)驗(yàn)是測定單個細(xì)胞增殖能力的有效方法之一。其基本原理是細(xì)胞在體外持續(xù)增殖6代以上，其后代組成的細(xì)胞群體，稱為克隆或集落，這時每個克隆含50個以上的細(xì)胞，直徑在0. 3-1_之間。通過計數(shù)克隆形成率，對單個細(xì)胞的増殖潛力作定量分析，了解細(xì)胞的増殖力和對環(huán)境的適應(yīng)性?？寺⌒纬赡芰Ω哒擢?dú)立生存能力強(qiáng)。常用的方法有平皿克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)。(I)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)
取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，計數(shù)。取1000個細(xì)胞接種至直徑IOcm的培養(yǎng)皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細(xì)胞分散均勻，然后置于37°C、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周。當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心清洗2次。用1%戊ニ醛固定15分鐘。然后去除固定液，加適量0. 25%結(jié)晶紫染色液，染色15 20分鐘，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加ー張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于50個細(xì)胞的克隆數(shù)。每株細(xì)胞重復(fù)實(shí)驗(yàn)三次。(2)軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)
取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，計數(shù)，并調(diào)細(xì)胞濃度為30，000個/ml，備用。將2. 5%低熔點(diǎn)瓊脂糖與2X細(xì)胞培養(yǎng)基以1:1的體積比混合制備0.5%的底層瓊脂，6孔板中每個孔2ml，溫室凝固。將0.5%的底層瓊脂與IX細(xì)胞培養(yǎng)基以2:3的體積比混合，制備0. 3%的上層瓊脂，每孔加Iml上層瓊脂和100 ill單細(xì)胞懸液(約3000個細(xì)胞/孔)，混勻，室溫凝固。每孔加入Iml培養(yǎng)液，置于37°C、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 3周。低倍鏡下計數(shù)含50個細(xì)胞以上的克隆，每株細(xì)胞選取5個視野。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。通過平皿單克隆形成實(shí)驗(yàn)和軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)與野生細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株對比，轉(zhuǎn)染PCDHl7的腫瘤細(xì)胞株的增殖能力明顯下降，這提示PCDHl7可以抑制胃癌和腸癌細(xì)胞株的増殖，同時也進(jìn)一步說明了 PCDH17是ー個抑癌基因。實(shí)施例7 P⑶H17轉(zhuǎn)染后對細(xì)胞周期的影響 流式流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期
流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期采用PI染色試劑盒(中國凱基公司)進(jìn)行。操作按試劑盒說明書進(jìn)行。將原細(xì)胞培養(yǎng)液去除，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細(xì)胞，2000rpm離心5分鐘。棄去上清，用I XBufTer A洗滌細(xì)胞一次，收集并調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO6個/mL。細(xì)胞加9倍體積的70%こ醇，于_20°C固定至少12小吋。離心收集細(xì)胞后，用IXBuffer A洗滌細(xì)胞除去こ醇，然后用500 的Buf f er A重懸細(xì)胞。往細(xì)胞懸液中加入RNaseA，使RNaseA終濃度為0. 25mg/ml，輕輕彈動管底使混勻，37°C，反應(yīng)30分鐘。加入5 ill的PI，輕輕彈動管底使混勻，室溫避光染色30分鐘。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長選擇488nm。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。我們通過流式細(xì)胞儀進(jìn)ー步分析了 P⑶H17對細(xì)胞周期的影響，在HCT116細(xì)胞株中，與野生型細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株比較，PCDHl7轉(zhuǎn)染后G1期細(xì)胞數(shù)増加、S期細(xì)胞數(shù)明顯減少(P < 0. 05)，說明P⑶H17阻止了 HCT116細(xì)胞的G1-S期轉(zhuǎn)換，抑制了 HCT116細(xì)胞的增殖；但在MKN45細(xì)胞中，PCDH17轉(zhuǎn)染后G1期和S期細(xì)胞數(shù)與其對照組野生型細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P > 0. 05)。實(shí)施例8 P⑶H17轉(zhuǎn)染后對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，計數(shù)，以每孔I X IO6個細(xì)胞接種在6孔板中。待培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿底面，用無菌槍頭在底面沿直徑劃動，劃出兩條基本垂直的直線劃痕，用PBS洗細(xì)胞3次，以去除劃下的細(xì)胞，加入10%基礎(chǔ)培養(yǎng)基2ml，置于37°C、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔12小時取樣一次，拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)
細(xì)胞遷移能力測定采用PET膜8 iim孔徑24孔小室系統(tǒng)(美國Corning公司)。取對數(shù)、生長期無血清培養(yǎng)48h的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在1%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為IXlO6個/ml，備用。下室加入含2.5%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基600iil，取IOOiU上述細(xì)胞懸液加入上室，放入37°C、5% CO2及飽和濕度的的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時后，甲醇固定10分鐘，用0. 25%的結(jié)晶紫溶液染色15 20分鐘，用棉簽輕輕擦去膜上室面尚存留的細(xì)胞，然后用手術(shù)刀片將膜完整切下。在低倍光鏡下計數(shù)膜下室面的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
通過劃痕實(shí)驗(yàn)我們分析了 PCDH17對腫瘤細(xì)胞遷移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在同樣培養(yǎng)條件下，野生型細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染PCDH17的細(xì)胞株在48小時時同樣完全覆蓋約2mm寬的劃痕，這提示PCDH17對腫瘤細(xì)胞的遷移能力可能無明顯影響。通過transwell cell migration assay實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，接種同樣細(xì)胞個數(shù)在transwell膜上方48小時后，轉(zhuǎn)染PCDH17的細(xì)胞株穿過膜上方進(jìn)入膜下方的細(xì)胞個數(shù)與其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株相比無明顯統(tǒng)計學(xué)差異，這進(jìn)一步說明了 PCDH17對腫瘤細(xì)胞遷移能力無明顯影響。實(shí)施例9 P⑶H17轉(zhuǎn)染后對腫瘤細(xì)胞自發(fā)凋亡的影響 流式流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡
將原細(xì)胞培養(yǎng)液全部轉(zhuǎn)入15ml離心管中(含全部懸浮細(xì)胞)，PBS洗滌貼壁細(xì)胞一次，用含EDTA的0. 25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，達(dá)到合適消化狀態(tài)后，加入上ー步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化，將細(xì)胞輕輕吹打下來后，一起轉(zhuǎn)到離心管中，IOOOg離心5分鐘，去除上清。收集來的細(xì)胞用PBS重懸,再次IOOOg離心5分鐘,去除上清,用I Xbinding bufferIml重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至I X IO6個/ml。取100 ill細(xì)胞懸液加入5ml的上樣管中，并將細(xì)胞凋亡較多的細(xì)胞株中剰余的細(xì)胞懸液等分到3個校正上樣管中(空白，F(xiàn)ITC單陽，PI單陽)，每個樣本的上樣管中均加入5iU FITC-Annexin V和5yl PI ;校正上樣管按需要加(空白管不加，F(xiàn)ITC單陽加5iUFITC，PI單陽加5 ill PI )，輕彈上樣管底部使之混勻，室溫下避光孵育15分鐘。最后在各個上樣管中再各加入IXbinding buffer 400 U I,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。結(jié)果顯示P⑶H17轉(zhuǎn)染株中凋亡細(xì)胞的比例與其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株中凋亡細(xì)胞的比例相比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，這說明PCDH17轉(zhuǎn)染后并不影響腫瘤細(xì)胞的自發(fā)凋亡。實(shí)施例10-12 P⑶H17與腫瘤細(xì)胞對5-FU敏感性的相關(guān)性研究 MTT法檢測5-FU的細(xì)胞毒作用
MTT比色分析法ー種檢測細(xì)胞活力和生長的方法。主要原理是活的増殖細(xì)胞可通過線粒體能量代謝過程中產(chǎn)生的琥珀酸脫氫酶將MTT (四甲基偶氮唑鹽)還原成不溶于水的藍(lán)紫色甲臜產(chǎn)物，并沉淀在細(xì)胞中，而死細(xì)胞沒有這種功能。ニ甲基亞砜(DMSO)能溶解沉積在細(xì)胞中的藍(lán)紫色結(jié)晶物，在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶物的形成量與細(xì)胞數(shù)目成正比，通過酶標(biāo)儀測定OD值來反映細(xì)胞數(shù)目或細(xì)胞活力。取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，計數(shù)，以每孔4000個細(xì)胞接種到96孔板中，每孔體積IOOii I。培養(yǎng)I天后加入IOOii I含5-FU的培養(yǎng)液(MKN-45 :80 y g/ml ； HCTl 16 :20 y g/ml)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育16小時。孵育16小時后每孔加MTT溶液(5mg/ml的PBS溶液)20 U 1，繼續(xù)孵育4小吋。4小時后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液。每孔加DMSO150 yl，振蕩10分鐘，使結(jié)晶物充分融解。選擇570nm波長，在酶標(biāo)儀(美國BIO-TEK公司)上測定各孔吸光度值，記錄吸光度值結(jié)果。流式流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡(具體步驟同實(shí)施例9)
Western-blot檢測P⑶H17對凋亡相關(guān)通路的影響(具體步驟同實(shí)施例6)
5-FU是胃腸道腫瘤基礎(chǔ)的化療藥物之一?？鼓[瘤藥物的ー個最大缺點(diǎn)是易產(chǎn)生耐藥性而使化療療效降低。腫瘤細(xì)胞耐藥表現(xiàn)為原藥耐藥和多藥耐藥兩種形式前者只對誘導(dǎo)藥耐藥，對其他藥物不生產(chǎn)交叉耐藥。這類抗腫瘤藥多是抗代謝藥，如MTX、5-FU、Ara-c及部分DDP和CTX等；多藥耐藥(MDR)是指不但對誘導(dǎo)它的藥物產(chǎn)生耐藥，而且對其他結(jié)構(gòu)不同、作用機(jī)制各異的藥物也產(chǎn)生交叉耐藥。這類藥物多數(shù)是天然生物堿類和抗生素類，分子量較大，親脂性高，又稱MDR藥，如ADM、MTT、VP-16、VM-26、VLB、VCR等。目前的研究也提示 化療耐藥與某些基因的過度表達(dá)有夫。為了研究P⑶H17是否會影響5-FU對腫瘤細(xì)胞的殺傷效果，我們根據(jù)既往HCTl 16和MKN45細(xì)胞株的藥敏曲線，確定了 16小時的5-Fu半數(shù)致死量(IC5tl), HCTl 16細(xì)胞IC5tl為20 u g/ml ；MKN45細(xì)胞IC5tl為80 u g/ml。按上述濃度的5-FU分別處理野生型細(xì)胞株、轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染PCDH17的細(xì)胞株16小時后，通過MTT法檢測了各組細(xì)胞株的細(xì)胞活力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染P⑶H17的細(xì)胞株的細(xì)胞活力明顯低于其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，這說明PCDH17轉(zhuǎn)染后增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對5-FU的敏感性(圖3)。進(jìn)ー步通過熒光顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染P⑶H17的細(xì)胞株在5-FU處理后出現(xiàn)較多的皺縮凋亡細(xì)胞，而野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株中的皺縮凋亡細(xì)胞數(shù)較少，這進(jìn)一步說明了PCDHl7能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對5-FU的敏感性。同時通過流式細(xì)胞儀我們分析了 PCDH17對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示經(jīng)5-FU處理后，轉(zhuǎn)染P⑶H17的細(xì)胞株中凋亡細(xì)胞的比例明顯高于其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，這亦說明P⑶H17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡(圖4)。最后我們通過Western-blot分析了 P⑶H17對腫瘤細(xì)胞凋亡相關(guān)通路的影響。結(jié)果顯示P⑶H17誘導(dǎo)了活化的RARP和caspase-3的表達(dá)、促進(jìn)了促凋亡相關(guān)蛋白Bax的表達(dá)、抑制了抗凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2的表達(dá)，這些結(jié)果表明P⑶H17的表達(dá)對胃腸道腫瘤細(xì)胞的凋亡起到了促進(jìn)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明P⑶H17增強(qiáng)了 HCT116和MKN45細(xì)胞株對化療藥物5_FU的敏感性，明顯促進(jìn)了 5-FU誘導(dǎo)下的細(xì)胞凋亡。實(shí)施例13-15 P⑶H17轉(zhuǎn)染后對腫瘤細(xì)胞自噬的影響 細(xì)胞自噬實(shí)驗(yàn)
(I) ロ丫唳澄(Acridine Orange, A0)染色
吖啶橙是ー種熒光色素，其檢測激發(fā)濾光片波長488nm，阻斷濾光片波長515nm。它與細(xì)胞中DNA和RNA的結(jié)合量存在差別，由此可發(fā)出不同顏色的熒光，與DNA結(jié)合量少發(fā)綠色熒光，與RNA結(jié)合量多發(fā)桔黃色或桔紅色熒光。該染料具有膜通透性，能透過細(xì)胞膜，使核DNA和RNA染色。因此，在熒光顯微鏡下觀察，吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞核呈綠色或黃緑色均勻熒光；而在凋亡細(xì)胞中，因染色質(zhì)固縮或斷裂為大小不等的片斷，形成凋亡小體，吖啶橙使其染上致密濃染的黃緑色熒光，或黃緑色碎片顆粒；而壞死細(xì)胞黃熒光減弱甚至消失。吖啶橙也可作為ー種非極性反膠態(tài)分子團(tuán)的分子探針，當(dāng)酸性磷酸酶活性增強(qiáng)時其在自噬溶酶體內(nèi)發(fā)紅色熒光。取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0. 25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，計數(shù)，備用。載玻片用75%的酒精浸后，在酒精燈上過火烘干，放入6孔板內(nèi)，每孔接種2X IO5個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2ml。同時取IXlO6個細(xì)胞接種于6cm培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2ml。過夜培養(yǎng)后，PBS洗滌兩次，更換無血清培養(yǎng)基饑餓24小吋。然后去除培養(yǎng)液，加入含I U g/ml吖啶橙的PBS溶液2ml，置于37°C、5% CO2孵箱中孵育15分鐘。細(xì)胞爬片經(jīng)PBS洗滌、DAPI染色、50%甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察。產(chǎn) 生自噬的細(xì)胞其細(xì)胞核被染成棕紅色。6cm培養(yǎng)皿中細(xì)胞經(jīng)消化后取I X IO5個細(xì)胞重懸于含I y g/ml吖啶橙的PBS溶液Iml中，置于37°C、5% CO2孵箱中孵育15分鐘。然后流式細(xì)胞儀檢測自噬細(xì)胞所占比例。(2) GFP-LC3B 瞬時轉(zhuǎn)染
自噬小體形成是細(xì)胞發(fā)生自噬現(xiàn)象的重要特征，自噬小體的檢測可以通過分析細(xì)胞內(nèi)源性LC3或合并自噬泡的GFP - LC3B顆粒來證實(shí)。取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，用含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化井吹打成單個細(xì)胞，離心后把細(xì)胞懸浮在10%基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，計數(shù)，備用。載玻片用75%的酒精浸泡然后，在酒精燈上過火烘干,放入6孔板內(nèi)，每孔接種5X105個細(xì)胞，加入含10%胎牛血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基2ml。過夜培養(yǎng)后，PBS洗滌兩次，更換無血清培養(yǎng)基饑餓24小吋。然后去除培養(yǎng)液，按照OriGene公司Mega tranl. 0試劑盒說明書進(jìn)行GFP - LC3B質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染，瞬轉(zhuǎn)32小時。32小時后去除培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS溶液洗滌兩次，再用4%甲醛(pH 7.4)室溫固定20分鐘。最后細(xì)胞爬片經(jīng)PBS洗滌、DAPI染色、50%甘油封片后置于熒光顯微鏡下觀察。產(chǎn)生自噬的細(xì)胞其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)點(diǎn)狀濃聚的GFP - LC3B顆粒。(3)自噬相關(guān)抗體檢測
取對數(shù)生長期的野生組、空載對照組、P⑶H17轉(zhuǎn)染組細(xì)胞提取總蛋白，通過Western-blot檢測自卩遼相關(guān)抗體BCL-1、Atg_5、Atg-12和LC3B的表達(dá)情況。吖啶橙是ー種熒光染料，可作為非極性反膠態(tài)分子團(tuán)的分子探針，在自噬溶酶體內(nèi)酸性磷酸酶活性增強(qiáng)下發(fā)紅色熒光。熒光顯微鏡觀察顯示轉(zhuǎn)染PCDH17的細(xì)胞株中著色細(xì)胞的比例明顯高于其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，這說明PCDH17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖5A)。進(jìn)ー步我們收獲所有細(xì)胞(包括懸浮細(xì)胞)通過流式細(xì)胞儀檢測了自噬細(xì)胞在各組細(xì)胞中所占的比例，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染PCDH17的細(xì)胞株中自噬細(xì)胞的比例明顯高于其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，這同樣說明PCDH17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖5B)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCDH17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生，我們將各組細(xì)胞去血清饑餓24小時后，瞬時轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒32小時。當(dāng)自噬被誘導(dǎo)時，轉(zhuǎn)染GFP-LC3B質(zhì)粒的細(xì)胞其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)會出現(xiàn)點(diǎn)狀濃聚的GFP - LC3B顆粒。熒光顯微鏡觀察顯示，轉(zhuǎn)染P⑶H17的細(xì)胞株中點(diǎn)狀濃聚的GFP - LC3B顆粒的比例明顯高于其對照組野生型細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞株，這更進(jìn)一步說明P⑶H17轉(zhuǎn)染后促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞自噬的發(fā)生(圖6)。最后我們通過Western-blot分析了 P⑶H17對腫瘤細(xì)胞自噬相關(guān)通路的影響。結(jié)果顯示P⑶H17誘導(dǎo)了活化的LC3B II的表達(dá)、促進(jìn)了促自噬相關(guān)蛋白Atg-5和Atg-12的表達(dá)(圖7)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明P⑶H17增強(qiáng)了饑餓條件下HCTl 16和MKN45細(xì)胞株自噬的發(fā)生。實(shí)施例16 P⑶H17轉(zhuǎn)染對腫瘤細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響。
人大腸癌裸鼠皮下種植瘤模型
為了研究PCDH17對胃腸道腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)成瘤能力是否存在影響，我們在BALB/c胸腺缺失的裸鼠體內(nèi)進(jìn)行了轉(zhuǎn)染KDH17的HCT116細(xì)胞(HCT116/P⑶H17)及轉(zhuǎn)染空載體的HCTl 16細(xì)胞(HCT116/Vector)的成瘤比較實(shí)驗(yàn)。取對數(shù)生長期的單層培養(yǎng)的HCT116/PCDH17細(xì)胞及HCT116/Vector細(xì)胞，用移液器將細(xì)胞直接吹下，并吹成單個細(xì)胞懸液，收集到離心管中，800g離心5分鐘，棄去上清，用無菌的PBS洗滌一次，然后將收集的細(xì)胞后用無菌的PBS液重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為
3.5X106個/0. 1ml，置于碎冰中，在盡可能短的時間內(nèi)接種。將BALB/C裸鼠隨機(jī)分為兩組，用0號注射器將上述0. Iml細(xì)胞懸液接種于裸鼠背部皮下。接種起兩天觀察一次，重點(diǎn)觀察接種點(diǎn)有無感染，區(qū)別早期出現(xiàn)的炎癥性腫塊與腫瘤。從接種后第7天開始記錄數(shù)據(jù)，每兩天用游標(biāo)卡尺記錄一次腫瘤的長徑及短徑，腫瘤體積用下述公式計算體積=(最短徑)2x最長徑X0. 5。在接種后第21天時將用頸椎脫白法處死。以時間為橫坐標(biāo)，腫瘤體積為縱坐標(biāo)，作生長曲線。我們建立了轉(zhuǎn)染空載體的HCT116細(xì)胞株和轉(zhuǎn)染P⑶H17的HCT116細(xì)胞株的裸鼠皮下種植瘤模型，進(jìn)行了體內(nèi)成瘤能力的比較研究。結(jié)果顯示接種HCTl 16/Vector細(xì)胞組和接種HCT116/ P⑶H17細(xì)胞組的裸鼠均有腫瘤生長。比較兩株細(xì)胞的腫瘤體積曲線發(fā)現(xiàn)，接種HCT116/PCDH17細(xì)胞的裸鼠，腫瘤生長速率顯著慢于對照組細(xì)胞接種第16天是腫瘤體積為HCT116/Vector 細(xì)胞組 1134±558mm3，HCTl 16/ PCDH17 細(xì)胞組 135± 105mm3 ;細(xì)胞接種第18天時的腫瘤體積為HCT116/Vector細(xì)胞組1437±698mm3，HCTl 16/ PCDH17細(xì)胞組173±85mm3 ;實(shí)驗(yàn)終止點(diǎn)(第22天)的腫瘤體積為HCT116/Vector細(xì)胞組2080±733mm3，HCTl 16/ PCDHl7細(xì)胞組266± 158mm3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示P⑶H17明顯抑制了體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長。根據(jù)上述實(shí)施例6-16結(jié)果，P⑶H17能夠增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對5_FU的敏感性而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的凋亡并能誘導(dǎo)饑餓條件下腫瘤細(xì)胞自噬的產(chǎn)生而起到抑癌基因的作用。
權(quán)利要求
1.一種PCDH17基因在制備診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求I所述的一種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品包括用RT-PCR或甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品。
3.如權(quán)利要求2所述的一種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用RT-PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品至少含有一對特異擴(kuò)增PCDHl7基因的引物。
4.如權(quán)利要求2所述的一種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品至少含有一對特異擴(kuò)增PCDH17基因的引物。
5.如權(quán)利要求3所述的一種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用RT-PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中特異擴(kuò)增POTH17基因的引物序列如SEQ ID NO :1和SEQ ID NO 2所示。
6.如權(quán)利要求4所述的一種PCDH17基因的應(yīng)用，其特征在于所述的用甲基化特異性PCR診斷胃癌和結(jié)直腸癌的產(chǎn)品中特異擴(kuò)增KDH17基因的引物如SEQ ID NO :5和SEQ IDNO 6所示。
7.—種PCDH17基因作為胃癌和結(jié)直腸癌化學(xué)治療敏感性檢測新靶點(diǎn)的應(yīng)用。
全文摘要
PCDH17基因的應(yīng)用，屬于基因技術(shù)領(lǐng)域。一方面該基因可作為胃癌和結(jié)直腸癌早期診斷的標(biāo)志物，有利于胃癌和結(jié)直腸癌的早期監(jiān)測和預(yù)防；另一方該基因可作為胃癌和結(jié)直腸癌化學(xué)治療敏感性檢測的新靶點(diǎn)，有利于指導(dǎo)胃癌和結(jié)直腸癌的化學(xué)治療。
文檔編號C12Q1/68GK102628080SQ201210094789
公開日2012年8月8日 申請日期2012年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月31日
發(fā)明者何超, 胡曉彤, 陶謙, 隋新兵 申請人:浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院