歐美楊PdMYB2基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）的逆境相關基因PdMYB2，該基因在植物抗鹽抗旱過程中有重要作用，本發(fā)明將提供的bZIP基因命名為PdMYB2，其具有與序列表中的SEQ?ID?NO：3所示的堿基序列。本發(fā)明的抗逆相關基因PdMYB2在構建到表達載體pCAMBIA1304中時，在其轉錄起始核苷酸前加上啟動子，同時加入可選擇標記GFP以便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定和篩選，攜帶有本發(fā)明的逆境相關基因PdMYB2的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，用于培育抗鹽抗旱的植物品種；本發(fā)明所述的基因在培育抗鹽抗旱植物中具有廣泛的應用前景。
【專利說明】歐美楊PdMYB2基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術領域】，具體涉及一種來自歐美楊(Populusdel to ides X Populus nigra)的 PdMYB2 基因及其應用。
【背景技術】
[0002]歐美楊(Populus deltoidesXPopulus nigra)是中諱度地區(qū)最適合種植的短輪伐期工業(yè)用材集約經營樹種之一。近年來我國引進了許多優(yōu)良的歐美楊無性系用于營造大面積的速生豐產林并取得很好的經濟和社會效益。但高鹽等限制了其進一步的推廣。因此，要將其引入高鹽缺水地區(qū)時，篩選和培育抗鹽抗旱的品系是前提。隨著分子生物學的發(fā)展，利用分子生物學技術研究歐美楊抗鹽抗旱分子機制已成為解決這一問題的重要途徑，目前已有多個基因被發(fā)現與提聞楊樹的抗逆性有關。目如已有多個基因被發(fā)現與提聞楊樹的抗逆性有關，但關于抗逆轉錄因子MYB的研究還未見報道。

【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明為解決現有技術中存在的上述問題，提供歐美楊中一種與逆境相關的bZIP基因，該基因在歐美楊中克隆，是MYB基因家族的一員，命名為PdMYB2。其在抗鹽抗旱反應中具有重要作用。
[0004]本發(fā)明公開的歐美楊(Populus deltoidesXPopulus nigra)逆境相關基因PdMYB2，它具有如SEQ ID NO:3所示的堿基序列。其序列由2202個堿基組成，自5’端第I到第2202位殘基為該基因的開放閱讀框序列，其表達受到鹽脅迫的誘導。
[0005]本發(fā)明的另一方面在于公開`上文所述基因，具有如SEQ ID NO:3所示的堿基序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:3編碼的蛋白具有相同活性的堿基序列；或者是與SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的堿基序列。
[0006]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述基因的擴增引物，具有如SEQ ID N0:1-2所不的喊基序列。
[0007]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述歐美楊(Populus deltoidesXPopulusnigra)的PdMYB2基因編碼的蛋白質，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸殘基序列，其是有733個氨基酸殘基組成的蛋白質。
[0008]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述蛋白質的衍生蛋白質，其特征在于:具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有相同活性的氨基酸殘基序列。
[0009]本發(fā)明的另一方面在于公開含有上文所述基因的表達載體。本發(fā)明所提供的抗逆相關基因PdMYB2，使用一種可以引導外源基因在植物表達中的表達載體轉化植株，可獲得對干旱脅迫抗逆性增強的轉基因植株。優(yōu)選的情況下，所述表達載體為質粒PCAMBIA1304。本發(fā)明的抗逆相關基因PdMYB2在構建到表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導性啟動子均可，同時必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定和篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇標記，通?？墒褂玫臉擞浭菍股乜剐悦傅幕蚝蜕锇踩珮擞洠部梢允荊US、GFP等可以產生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因等。攜帶有本發(fā)明的逆境相關基因PdMYB2的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，用于培育抗鹽抗旱的植物品種。
[0010]本發(fā)明的另一方面在于公開一種含有本發(fā)明上文所述基因的細胞系。在優(yōu)選的技術方案中，上文所述細胞系為大腸桿菌ToplO細胞或農桿菌EH105細胞。
[0011]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述的基因在培育抗鹽抗旱植物中的應用。所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。本發(fā)明實施例中列舉了農桿菌介導的擬南芥轉化方法，并獲得了轉基因植株，試驗結果有力的證明了轉PdMYB2基因擬南芥具備更強的耐鹽能力。
[0012]本發(fā)明的創(chuàng)新特征是:本發(fā)明成功的擴增了轉錄因子PdMYB2基因，其可以顯著提高下游抗逆基因的表達進而可廣泛用于楊樹抗鹽抗旱品種的培育等領域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為PdMYB2基因的表達示意圖，其中:圖1A為鹽脅迫，其橫坐標為時間(0、2、
4、6、12h)，圖1B為干旱脅迫，其橫坐標為(0、2、4、6、8h)，圖1A和圖1B的縱坐標為相對表達量，從圖示結果可以看到PdMYB2基因在鹽和干旱脅迫下表達量顯著提高，且在不同時間點表達量不一致。此結果證明PdMYB2基因在鹽和干旱脅迫被誘導表達。
[0014]圖2為PdMYB2基因電泳圖，其中:I是PdMYB2基因的電泳條帶；M是DNA markerDL2000，從圖示結果顯示通過PCR擴增，可以得到歐美楊PdMYB2基因的全長(對照DNAmarker,電泳條帶大小為2202bp)，此結果證明PdMYB2基因片段長度是正確的。
[0015]圖3為菌液PCR法篩選重組質粒，泳道1-9是用PdMYB2基因陽性克隆的結果⑷是DNA marker DL2000,從圖示結果顯示PdMYB2基因已成功連接到pCAMBIA1304表達載體上(對照DNA marker,電泳條帶大小為2202bp)。
[0016]圖4為測定葉片的葉綠素含量結果圖。在200mmol.T1NaCl以及干旱處理48h后，野生型和轉基因株系的葉綠素含量都降低了，但轉基因株系的葉綠素含量相對野生型降低較少。其中在干旱處理下野生型的葉綠素含量降低了 77%，T2-3降低了 60%，T2-6降低了48%，T2-7降低了 52%。在鹽處理下，野生型的葉綠素含量降低了 86%，T2-3降低了 68%，T2-6降低了 54%, T2-7 降低了 62%。
【具體實施方式】
[0017]下述非限制性實施例可以使本領域的普通技術人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0018]試驗中使用試劑如T4-DNA連接酶、大腸桿菌感受態(tài)ToplO、pGEM-T克隆載體以及DNA凝膠回收試劑盒均購自天根生物公司，ExTaq酶及RNA反轉錄試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)工程公司，常用試劑購自拜爾迪公司。PCR儀購自Biometra，離心機購自SIGMA公司，紫外凝膠成像儀購自Bio-rad公司，超低溫冰箱購自三洋公司，引物合成和測序由北京六合華大基因公司完成。
[0019]本發(fā)明使用的試驗方法中，如無特殊說明，均為本領域技術人員的公知常識，各種緩沖溶液，檢測試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得或者由常規(guī)實驗方法制備獲得。
[0020]實施例1總RNA的提取
[0021]一.本發(fā)明所用歐美楊107材料取自河北保定，是一年生插條扦插于北京林業(yè)大學苗圃培養(yǎng)，扦插后為保持土壤濕潤每三天澆一次透水，待長出新葉后，將長勢類似的(生長3個月)歐美楊苗用250mM NaCl噴灑處理，并分別在0、2、4、6h摘取頂端葉置于液氮中，然后在_80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｓ糜谶M行總RNA的提取和cDNA的合成。
[0022]二.利用CTAB方法從250mM NaCl脅迫的歐美楊葉片中提取總RNA的流程:
[0023](I)提取RNA前在2XCTAB緩沖液中加入0.1mM終濃度的DTT，65°C預熱。
[0024](2)將0.5g液氮研磨好的材料置于2mL的Eppendorf管中，加入900 μ L預熱的提取緩沖液，充分搖勻，65°C水浴15min，期間震蕩2_3次。
[0025](3)將Eppendorf管取出冷卻至室溫，加三氯甲烷900 μ L，振蕩lOmin。4°C，12000r.mirf1 離心 15min。
[0026](4)取約600 μ L上清，加等體積的三氯甲燒振蕩6min。4°C, 12000r.mirT1離心15min。
[0027](5)取約400 μ L上清`，加1/4體積即100 μ L的LiCl溶液，輕輕混勻，_20°C放置3h0 取出，4°C，12000r.mirT1 離心 15min。
[0028](6)棄上清，然后加70%乙醇700 μ L、500 μ L分別洗滌2次。完全吸掉乙醇，室溫吹干后溶于20-30 μ LddH2O中備用。
[0029]三.以上述方法獲得的葉片總RNA為模板,使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒，按照試劑盒使用說明書的操作進行反轉錄，合成cDNA第I鏈，作為模板用于熒光定量PCR或PCR擴增的分析。
[0030]實施例2利用熒光定量PCR法檢測歐美楊PdMYB2基因在逆境中的表達
[0031]根據歐美楊PdMYB2基因的保守序列，設計特異引物上游引物:PdMYB21 (SEQ IDN0.1)和下游引物:PdMYB22 (SEQ ID N0.2)。
[0032]
【權利要求】
1.歐美楊(PopulusdeltoidesXPopulus nigra)的PdMYB2基因，其特征在于:具有如SEQ ID NO:3所不的喊基序列。
2.根據權利要求1所述基因，其特征在于:具有如SEQID NO:3所示的堿基序列經過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:3編碼的蛋白具有相同活性的堿基序列；或者是與SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質的堿基序列。
3.—種擴增權利要求1所述基因的引物，具有如SEQ ID NO:1-2所示的堿基序列。
4.如權利要求1所述基因編碼的蛋白質，其具有如SEQID NO:4所不的氣基酸殘基序列。
5.根據權利要求4所述蛋白質的衍生蛋白質，其特征在于:具有如SEQID N0:4所示的氨基酸殘基序列經過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0:4編碼的蛋白具有相同活性的氨基酸殘基序列。
6.含有權利要求1所述基因的表達載體。
7.根據權利要求6所述的表達載體，其特征在于:所述表達載體為質粒PCAMBIA1304。
8.含有權利要求1所述基因的細胞系。
9.根據權利要求8所述的細胞系，其特征在于:所述細胞系為大腸桿菌ToplO細胞或農桿菌H1105細胞。
10.權利要求1所述的基因`在培育抗鹽抗旱植物中的應用。
【文檔編號】C07K14/415GK103451192SQ201310441282
【公開日】2013年12月18日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權日:2013年9月25日
【發(fā)明者】郭鵬, 董燕 申請人:大連民族學院