歐美楊PdHARDY基因及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個歐美楊（Populus?deltoides×Populus?nigra）的逆境相關(guān)基因PdHARDY，該基因在植物抗鹽過程中有重要作用，本發(fā)明將提供的基因命名為PdHARDY，其具有與序列表中的SEQ?ID?NO：3所示的堿基序列。本發(fā)明的抗逆相關(guān)基因PdHARDY在構(gòu)建到表達(dá)載體pCAMBIA1304中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上啟動子，同時加入可選擇標(biāo)記GFP以便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定和篩選，攜帶有本發(fā)明的逆境相關(guān)基因PdHARDY的表達(dá)載體可以通過多種方法轉(zhuǎn)化植物宿主，用于培育抗鹽的植物品種；本發(fā)明所述的基因在培育抗鹽植物中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說明】歐美楊PdHARDY基因及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種來自歐美楊(Populusdeltoides XPopulus nigra)的 PdHARDY 基因及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]歐美楊(Populus deltoides XPopulus nigra)是中諱度地區(qū)最適合種植的短輪伐期工業(yè)用材集約經(jīng)營樹種之一。近年來我國引進(jìn)了許多優(yōu)良的歐美楊無性系用于營造大面積的速生豐產(chǎn)林并取得很好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。但高鹽等限制了其進(jìn)一步的推廣。因此，要將其引入高鹽缺水地區(qū)時，篩選和培育抗鹽的品系是前提。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，利用分子生物學(xué)技術(shù)研究歐美楊抗鹽分子機制已成為解決這一問題的重要途徑，目前已有多個基因被發(fā)現(xiàn)與提高楊樹的抗逆性有關(guān)。Karaba發(fā)現(xiàn)擬南芥抗旱相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子HARDY轉(zhuǎn)入水稻后，轉(zhuǎn)基因水稻光合速率增強，蒸騰速率下降，從而使得水分利用效率提高。轉(zhuǎn)基因水稻在水分條件合適的情況下，產(chǎn)量明顯提高(大約50%);干旱處理下，這種現(xiàn)象更為明顯，轉(zhuǎn)HARDY基因水稻產(chǎn)量相對于野生型提高了大約60%。因此該基因在其他植物上的研究與探討值得期待。但該基因在歐美楊的研究還未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問題，提供歐美楊中一種與逆境相關(guān)的bZIP基因，該基因在歐美楊中克隆，是HARDY基因家族的一員，命名為PdHARDY。其在抗鹽反應(yīng)中
具有重要作用。
[0004]本發(fā)明公開的歐美楊(Populus deltoides X Populus nigra)逆境相關(guān)基因PdHARDY，它具有如SEQ ID NO:3所示的堿基序列。其序列由627個堿基組成，自5’端第I到第627位殘基為該基因的開放閱讀框序列，其表達(dá)受到鹽脅迫的誘導(dǎo)。
[0005]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述基因，具有如SEQ ID NO:3所示的堿基序列經(jīng)過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:3編碼的蛋白具有相同活性的堿基序列；或者是與SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的堿基序列。
[0006]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述基因的擴增引物，具有如SEQ ID N0:1?2所不的喊基序列。
[0007]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述歐美楊(Populus deltoidesXPopulusnigra)的PdHARDY基因編碼的蛋白質(zhì)，具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸殘基序列，其是有208個氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)。
[0008]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述蛋白質(zhì)的衍生蛋白質(zhì)，其特征在于:具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:4編碼的蛋白具有相同活性的氨基酸殘基序列。
[0009]本發(fā)明的另一方面在于公開含有上文所述基因的表達(dá)載體。本發(fā)明所提供的抗逆相關(guān)基因PdHARDY，使用一種可以引導(dǎo)外源基因在植物表達(dá)中的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株，可獲得對干旱脅迫抗逆性增強的轉(zhuǎn)基因植株。優(yōu)選的情況下，所述表達(dá)載體為質(zhì)粒PCAMBIA1304。本發(fā)明的抗逆相關(guān)基因PdHARDY在構(gòu)建到表達(dá)載體中時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導(dǎo)性啟動子均可，同時必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植株進(jìn)行鑒定和篩選，可以在構(gòu)建載體時對載體進(jìn)行加工，例如加入可選擇標(biāo)記，通常可使用的標(biāo)記是對抗生素抗性酶的基因和生物安全標(biāo)記，也可以是GUS、GFP等可以產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因等。攜帶有本發(fā)明的逆境相關(guān)基因PdHARDY的表達(dá)載體可以通過多種方法轉(zhuǎn)化植物宿主，用于培育抗鹽的植物品種。
[0010]本發(fā)明的另一方面在于公開一種含有本發(fā)明上文所述基因的細(xì)胞系。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，上文所述細(xì)胞系為大腸桿菌ToplO細(xì)胞或農(nóng)桿菌EH105細(xì)胞。
[0011]本發(fā)明的另一方面在于公開上文所述的基因在培育抗鹽植物中的應(yīng)用。所轉(zhuǎn)化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。本發(fā)明實施例中列舉了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的擬南芥轉(zhuǎn)化方法，并獲得了轉(zhuǎn)基因植株，試驗結(jié)果有力的證明了轉(zhuǎn)PdHARDY基因擬南芥具備更強的耐鹽能力。
[0012]本發(fā)明的創(chuàng)新特征是:本發(fā)明成功的擴增了轉(zhuǎn)錄因子PdHARDY基因，其可以顯著提高下游抗逆基因的表達(dá)進(jìn)而 可廣泛用于楊樹抗鹽品種的培育等領(lǐng)域。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為PdHARDY基因的表達(dá)示意圖，其中:橫坐標(biāo)為時間(0、2、4、6、12h)，縱坐標(biāo)為相對表達(dá)量，從圖示結(jié)果可以看到PdHARDY基因在鹽脅迫下表達(dá)量顯著提高，且在不同時間點表達(dá)量不一致。此結(jié)果證明PdHARDY基因在鹽脅迫被誘導(dǎo)表達(dá)。
[0014]圖2為PdHARDY基因電泳圖，其中:1是PdHARDY基因的電泳條帶"是0嫩markerDL2000，從圖示結(jié)果顯示通過PCR擴增，可以得到歐美楊PdHARDY基因的全長(對照DNAmarker,電泳條帶大小為627bp)，此結(jié)果證明PdHARDY基因片段長度是正確的。
[0015]圖3為菌液PCR法篩選重組質(zhì)粒，泳道1-6是用PdHARDY基因陽性克隆的結(jié)果；M是DNA marker DL2000，從圖示結(jié)果顯示1，3，4，5泳道PdHARDY基因已成功連接到pCAMBIA1304表達(dá)載體上(對照DNA marker,電泳條帶大小為627bp)。
[0016]圖4為測定葉片的葉綠素含量結(jié)果圖。在200mmol -L-1NaCl處理24h后，野生型和轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量都降低了，但轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量相對野生型降低較少。其中葉綠素含量野生型降低了 77%，T2-3降低了 57%，Τ2-6降低了 37%，Τ2_14降低了 45.7%。
【具體實施方式】
[0017]下述非限制性實施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
[0018]試驗中使用試劑如T4-DNA連接酶、大腸桿菌感受態(tài)ToplO、pGEM-T克隆載體以及DNA凝膠回收試劑盒均購自天根生物公司，ExTaq酶及RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)工程公司，常用試劑購自拜爾迪公司。PCR儀購自Biometra，離心機購自SIGMA公司，紫外凝膠成像儀購自Bio-rad公司，超低溫冰箱購自三洋公司，引物合成和測序由北京六合華大基因公司完成。
[0019]本發(fā)明使用的試驗方法中，如無特殊說明，均為本領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識，各種緩沖溶液，檢測試劑等，如無特殊說明，均可由商業(yè)途徑獲得或者由常規(guī)實驗方法制備獲得。
[0020]實施例1總RNA的提取
[0021]一.本發(fā)明所用歐美楊107材料取自河北保定，是一年生插條扦插于北京林業(yè)大學(xué)苗圃培養(yǎng)，扦插后為保持土壤濕潤每三天澆一次透水，待長出新葉后，將長勢類似的(生長3個月)歐美楊苗用250mM NaCl噴灑處理，并分別在0、2、4、6、12h摘取頂端葉置于液氮中，然后在-80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆?。用于進(jìn)行總RNA的提取和cDNA的合成。
[0022]二.利用CTAB方法從250mM NaCl脅迫的歐美楊葉片中提取總RNA的流程:
[0023](I)提取RNA前在2XCTAB緩沖液中加入0.1mM終濃度的DTT，65°C預(yù)熱。
[0024](2)將0.5g液氮研磨好的材料置于2mL的Eppendorf管中，加入900 μ L預(yù)熱的提取緩沖液，充分搖勻，65°C水浴15min，期間震蕩2-3次。
[0025](3)將Eppendorf管取出冷卻至室溫，加三氯甲烷900 μ L，振蕩lOmin。4°C，12000r.mirf1 離心 15min。
[0026](4)取約600 μ L上清，加等體積的三氯甲燒振蕩6min。4°C, 12000r.mirT1離心15min。
[0027](5)取約400 μ L上清，加1/4體積即100 μ L的LiCl溶液，輕輕混勻，-20°C放置3h0 取出，4°C，12000r.mirT1 離心 15min。
[0028](6)棄上清，然后加70%乙醇700 μ L、500 μ L分別洗滌2次。完全吸掉乙醇，室溫吹干后溶于20-30 μ LddH2O中備用。
[0029]三.以上述方法獲得的葉片總RNA為模板,使用M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒，按照試劑盒使用說明書的操作進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第I鏈，作為模板用于熒光定量PCR或PCR擴增的分析。
[0030]實施例2利用熒光定量PCR法檢測歐美楊PdHARDY基因在逆境中的表達(dá)
[0031]根據(jù)歐美楊PdHARDY基因的保守序列，設(shè)計特異引物上游引物=PdHARDYl (SEQ IDN0.1)和下游引物:PdHARDY2 (SEQ ID N0.2)。
[0032]
【權(quán)利要求】
1.歐美楊(Populusdeltoides XPopulus nigra)的 PdHARDY 基因，其特征在于:具有如SEQ ID NO:3所不的喊基序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述基因，其特征在于:具有如SEQID NO:3所示的堿基序列經(jīng)過一個或幾個堿基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID NO:3編碼的蛋白具有相同活性的堿基序列；或者是與SEQ ID NO:3具有90%以上的同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的堿基序列。
3.—種擴增權(quán)利要求1所述基因的引物，具有如SEQ ID NO:1?2所示的堿基序列。
4.如權(quán)利要求1所述基因編碼的蛋白質(zhì)，其具有如SEQID NO:4所不的氣基酸殘基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述蛋白質(zhì)的衍生蛋白質(zhì)，其特征在于:具有如SEQID N0:4所示的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID N0:4編碼的蛋白具有相同活性的氨基酸殘基序列。
6.含有權(quán)利要求1所述基因的表達(dá)載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，其特征在于:所述表達(dá)載體為質(zhì)粒PCAMBIA1304。
8.含有權(quán)利要求1所述基因的細(xì)胞系。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的細(xì)胞系，其特征在于:所述細(xì)胞系為大腸桿菌ToplO細(xì)胞或農(nóng)桿菌H1105細(xì)胞。
10.權(quán)利要求1所述的基因 在培育抗鹽植物中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K14/415GK103436541SQ201310442177
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】郭鵬, 董燕 申請人:大連民族學(xué)院