一種基于固態(tài)雙凝膠的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析和種間通訊研究的微流控芯片。該芯片為雙層結(jié)構(gòu)，采用塑模法制備，下層主要由液體注入孔、用于第一次包裹的微管道和用于第二次包裹的寬管道構(gòu)成；上層含有微閥門，可以對(duì)位于下層的芯片管道進(jìn)行開閉控制。本發(fā)明通過兩種固態(tài)凝膠對(duì)三種不同的微生物進(jìn)行雙重包裹，形成固態(tài)微生物三維空間結(jié)構(gòu)。通過改變芯片進(jìn)液流速，可以對(duì)固態(tài)凝膠微球的堆積包裹方式進(jìn)行改變，從而能夠方便地對(duì)不同種微生物之間的三維空間距離進(jìn)行調(diào)節(jié)。
【專利說明】
一種基于固態(tài)雙凝膠的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境生物學(xué)分析領(lǐng)域，具體涉及一種通過兩種多孔固態(tài)凝膠對(duì)微生物進(jìn)行雙重包裹，從而建立固態(tài)微生物三維群落結(jié)構(gòu)的微流控芯片。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物在自然界中以群落的形式生存，群落內(nèi)的不同種微生物通過種間相互作用進(jìn)行信息的傳遞，并通過對(duì)不同底物的代謝過程行使生物學(xué)功能。環(huán)境微生物群落的種群結(jié)構(gòu)、多樣性和群落功能始終處于動(dòng)態(tài)變化中，對(duì)環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的平衡起著至關(guān)重要的作用。
[0003]近年來，利用生物相容性材料對(duì)微生物種群進(jìn)行三維培養(yǎng)成為環(huán)境微生物學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，該方法可以將多種具有不同代謝途徑、功能的微生物“組裝”在一起進(jìn)行培養(yǎng)，從而體現(xiàn)其協(xié)同代謝作用，模擬環(huán)境中真實(shí)的微生物協(xié)同生活、代謝作用。例如將幾種分泌不同酶和底物的微生物進(jìn)行三維培養(yǎng)，構(gòu)成模擬生物群落，其分泌物通過酶促反應(yīng)生產(chǎn)具有一定環(huán)境學(xué)功能的產(chǎn)物，這種三維模擬生物群落分析方法也成為很多藥物或環(huán)境毒理分析的新的研究平臺(tái)。但是，現(xiàn)有的微生物三維結(jié)構(gòu)建立方法存在很多問題，例如常用的水凝膠空間支持結(jié)構(gòu)的建立成本較高，步驟繁瑣，凝膠孔徑較小不利于微生物間信息傳遞，而且無(wú)法按照需要對(duì)微生物群落間的物理距離進(jìn)行改變，此外自動(dòng)化操作的缺失使得誤差極大，重復(fù)性差，這些缺陷都亟待新的技術(shù)方法加以解決。
[0004]微流控芯片技術(shù)在環(huán)境生物學(xué)領(lǐng)域發(fā)展迅速，利用已成熟的芯片加工制造方法，以及微液滴(Dropl et)技術(shù)，可以在芯片內(nèi)構(gòu)建微生物培養(yǎng)腔，并將單個(gè)微生物包裹在直徑為20-200μπι的微球內(nèi)，從而對(duì)單個(gè)微生物實(shí)現(xiàn)精確操控和生長(zhǎng)代謝分析。微生物在具有多孔結(jié)構(gòu)的微球內(nèi)部，仍可以接觸和吸收外界的環(huán)境刺激因子、細(xì)胞因子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)等。此外，固態(tài)凝膠為疏松多孔結(jié)構(gòu)，可以提供微生物生長(zhǎng)所需空間，因此該方法能夠保證微生物的正常生長(zhǎng)和代謝?；谠摷夹g(shù)原理的微流控芯片研究平臺(tái)能夠突破很多技術(shù)瓶頸，此外，在微流控芯片內(nèi)進(jìn)行微生物的培養(yǎng)和操控，可以有效避免外界污染，芯片的自動(dòng)化控制也使得對(duì)微小的微生物操控更加精確。
[0005]目前，利用固態(tài)凝膠對(duì)環(huán)境微生物進(jìn)行二次固態(tài)包裹從而構(gòu)建芯片內(nèi)的三維微生物群落的研究尚處于空白。本發(fā)明的微流控芯片可以自動(dòng)化控制微生物的包裹、培養(yǎng)以及芯片內(nèi)三維群落的形成和分析，能夠模擬自然環(huán)境中真實(shí)的微生物三維群落狀態(tài)，對(duì)環(huán)境生物學(xué)研究具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種可以對(duì)三種微生物進(jìn)行兩次固態(tài)凝膠包裹，形成固態(tài)三維空間結(jié)構(gòu)，可用于微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析和微生物種間通訊研究的微流控芯片。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:
[0008]一種基于固態(tài)雙凝膠的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片，該微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片為雙層結(jié)構(gòu)，包括管道流通層12和微閥門層11;在功能上分為凝膠微球包裹單元、凝膠微球堆積單元和固態(tài)凝膠二次包裹單元。
[0009]所述的微閥門層11包括含有氣壓控制的微閥門5和閥門管道，微閥門5對(duì)芯片管道流通層中的管道進(jìn)行開啟或閉合控制。
[0010]所述的管道流通層12包括三種微生物與低熔點(diǎn)液態(tài)瓊脂糖凝膠的混合液注入孔1、2、3，硅與表面活性劑的注入孔4，液態(tài)海藻糖凝膠的注入孔6，氯化鈣溶液的注入孔7，硅油及表面活性劑的注入孔8，固態(tài)微生物三維群落凝膠的收集孔9，用于液體流通和凝膠微球包裹的微管道，以及用于凝膠微球堆積和固態(tài)凝膠二次包裹的寬管道。所述的芯片內(nèi)的微管道深度為40?60.Ομπι，寬度為40?50μηι，為光滑平直的凹槽;寬管道的深度為40?60.0Mi，寬度為600 ?800μηι。
[0011]所述的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片的材料為光學(xué)透性良好且具有彈性的聚二甲基硅氧烷聚合物(PDMS)。
[0012]所述的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片的液體流通層12和微閥門層11分別經(jīng)過365nm紫外光照射10?20分鐘，等離子體處理2?5分鐘后，再通過對(duì)接實(shí)現(xiàn)不可逆的封接鍵入口 ο
[0013]采用上述微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片構(gòu)建并收集微生物固態(tài)三維凝膠結(jié)構(gòu)，具體包括以下步驟:
[0014](I)將三種不同的微生物分別與加熱至41°C的液態(tài)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及液體培養(yǎng)基混合后，分別通過混合液注入孔1、2、3注入微管道，同時(shí)以與混合液相同的進(jìn)液速度將硅及表面活性劑的混合液通過注入孔4注入微管道，在硅及表面活性劑混合液的作用下形成包含三種微生物的瓊脂糖凝膠微液滴。閉合微閥門5使寬管道處于關(guān)閉狀態(tài)，位于寬管道內(nèi)的瓊脂糖凝膠微液滴被微閥門阻擋、截留；堆積的瓊脂糖凝膠微液滴經(jīng)室溫靜置后凝固為瓊脂糖凝膠微球，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的一次固態(tài)包裹。所述的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠在高溫時(shí)為液態(tài)，在溫度降至室溫時(shí)凝固成多孔凝膠態(tài)。
[0015](2)開啟微閥門5，通過注入孔6注入海藻糖凝膠溶液，使其充滿瓊脂糖凝膠微球之間的間隙空間。通過注入孔7注入氯化鈣溶液，在氯化鈣溶液的作用下使海藻糖凝膠固化并形成多孔膠狀固態(tài)結(jié)構(gòu)，從而將含有微生物的瓊脂糖凝膠微球固定于所在的三維空間位置，形成海藻糖凝膠包裹形成三維堆積結(jié)構(gòu)的固態(tài)微生物凝膠微球10，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的二次固態(tài)包裹。
[0016](3)通過收集孔9收集固態(tài)微生物凝膠微球，并置于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液可通過兩種固態(tài)凝膠的多孔結(jié)構(gòu)滲透進(jìn)入三維凝膠內(nèi)部，對(duì)包裹其中的微生物進(jìn)行三維培養(yǎng)，通過添加熒光染料可以用于微生物三維群落結(jié)構(gòu)和群落種間通訊研究。
[0017]本發(fā)明通過改變芯片進(jìn)液流速以及對(duì)凝膠微球的堆積包裹方式進(jìn)行改變，可以調(diào)節(jié)不同種微生物之間的三維空間距離。
[0018]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明提供的微流控芯片可以顯著降低微生物、試劑和培養(yǎng)液的消耗量;芯片內(nèi)的微閥門可由電腦控制系統(tǒng)進(jìn)行精確操控。在芯片內(nèi)通過兩種不同的多孔固態(tài)凝膠對(duì)三種微生物進(jìn)行雙重包裹，可以模擬自然界中微生物三維結(jié)構(gòu)生長(zhǎng)的真實(shí)狀態(tài)，可用于對(duì)微生物三維群落結(jié)構(gòu)和種間通訊的研究。
【附圖說明】
[0019]圖1為本發(fā)明的微流控芯片設(shè)計(jì)圖。
[0020]圖2為芯片內(nèi)固態(tài)凝膠包裹形成微生物三維群落示意圖。
[0021 ]圖3為芯片管道橫截面示意圖。
[0022]圖中:1-3混合液注入孔;4注入孔;5微閥門；6注入孔;7注入孔;8注入孔;9收集孔；1固態(tài)微生物凝膠微球;11閥門層;12管道流通層。
【具體實(shí)施方式】
[0023]圖1所示為用于微生物三維群落結(jié)構(gòu)及種間通訊分析的微流控芯片結(jié)構(gòu)圖。通過向I號(hào)、2號(hào)和3號(hào)微孔內(nèi)分別向微流控芯片的微管道內(nèi)注入含有三種不同微生物的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠混合液，同時(shí)以等速通過4號(hào)微孔注入硅油及表面活性劑，可在微管道內(nèi)形成分別包裹三種微生物的液態(tài)瓊脂糖凝膠微液滴。而后，向5號(hào)微孔中增加氣壓(不超過15psi)，使芯片閥門層中的微閥門處于閉合狀態(tài)，位于寬管道內(nèi)的瓊脂糖凝膠微液滴被微閥門所阻擋、截留。堆積的瓊脂糖凝膠微液滴經(jīng)室溫靜置后，固化為疏松的多孔固態(tài)瓊脂糖凝膠微球，將微生物包裹在微球內(nèi)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的一次固態(tài)包裹。重新開啟微閥門，經(jīng)由6號(hào)孔向芯片內(nèi)注入液態(tài)海藻糖凝膠溶液，使其充滿瓊脂糖凝膠微球之間的間隙空間。再通過7號(hào)孔注入氯化鈣溶液與寬管道內(nèi)的液態(tài)海藻糖凝膠溶液相混合，同時(shí)通過8號(hào)孔注入硅及表面活性劑混合液，在芯片寬管道內(nèi)形成液態(tài)海藻糖凝膠液段，在氯化鈣作用下包裹瓊脂糖凝膠微球的海藻糖凝膠將固化為疏松多孔的固態(tài)結(jié)構(gòu)，形成固態(tài)維結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的二次固態(tài)包裹。
[0024]通過9號(hào)孔收集含有三種微生物的固態(tài)凝膠并置于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液可通過兩種固態(tài)凝膠的多孔結(jié)構(gòu)滲透進(jìn)入三維凝膠的內(nèi)部，對(duì)包裹其中的微生物進(jìn)行三維培養(yǎng)，通過添加熒光染料可進(jìn)行微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析和群落種間通訊的研究。
[0025]芯片管道和微閥門均采用PDMS為材料制備，制備方法為:
[0026](丨)硅片制備:利用Prianha溶液煮沸清洗單晶硅片30?60分鐘，經(jīng)氮?dú)獯蹈珊?，將?fù)光刻膠傾倒在硅片表面，在旋涂機(jī)上進(jìn)行甩涂，80°C烘焙40?60分鐘固化；
[0027](2)微閥門模具制備:將正光刻膠傾倒在硅片表面，在旋涂機(jī)上甩涂，轉(zhuǎn)速為2000轉(zhuǎn)/分鐘，115°C烘焙10?20分鐘固化后緩慢冷卻至室溫；
[0028](3)紫外曝光:在甩涂后的硅片表面放置帶有液體流通管道和微閥門結(jié)構(gòu)的掩膜板，利用紫外曝光機(jī)進(jìn)行365nm紫外照射處理3?5分鐘；
[0029](4)硅片顯影:利用顯影液對(duì)曝光后的單晶硅片進(jìn)行清洗顯影10?30分鐘，利用異丙醇溶液清洗硅片表面，氮?dú)獯蹈桑?br>[0030](5)芯片澆注:將聚二甲基硅氧烷的單體和固化劑按體積比5:1和20:1混合，分別傾倒在管道流通層和微閥門層硅片模具上，80°C烘焙40?60分鐘使其固化；
[0031](6)芯片封接:將固化后的PDMS與硅片模具剝離并打孔后，利用氧離子體處理管道流通層和微閥門層PDMS芯片的表面2?5分鐘后，將兩層芯片對(duì)接鍵合，80 °C烘焙8?12小時(shí)，完成芯片構(gòu)建。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種基于固態(tài)雙凝膠的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片，其特征在于，該微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片為雙層結(jié)構(gòu)，包括微閥門層(11)和管道流通層(12);功能上微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片分為凝膠微球包裹單元、凝膠微球堆積單元和固態(tài)凝膠二次包裹單元； 所述的微閥門層(11)包括含有氣壓控制的微閥門(5)和閥門管道，微閥門(5)對(duì)芯片管道流通層中的管道進(jìn)行開啟或閉合控制； 所述的管道流通層(12)包括三種微生物與低熔點(diǎn)液態(tài)瓊脂糖凝膠的混合液注入孔(1、2、3)，硅與表面活性劑的注入孔(4)，液態(tài)海藻糖凝膠的注入孔(6)，氯化鈣溶液的注入孔(7)，硅油及表面活性劑的注入孔(8)，固態(tài)微生物三維群落凝膠的收集孔(9)，用于液體流通和凝膠微球包裹的微管道，以及用于凝膠微球堆積和固態(tài)凝膠二次包裹的寬管道;所述的芯片內(nèi)的微管道為光滑平直的凹槽，深度為40?60.Ομπι，寬度為40?50μηι;寬管道的深度為 40 ?60.0ym，寬度為600 ?800μηι ； 所述的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片的材料為聚二甲基硅氧烷聚合物toms;所述的液體流通層(12)和微閥門層(11)分別經(jīng)過365nm紫外光照射10?20分鐘，等離子體處理2?5分鐘后，通過對(duì)接實(shí)現(xiàn)不可逆的封接鍵合。2.應(yīng)用權(quán)利要求1所述的微生物三維群落結(jié)構(gòu)分析芯片構(gòu)建并收集微生物固態(tài)三維凝膠結(jié)構(gòu)，其特征在于，包括以下步驟: 第一步，將三種不同的微生物分別與加熱至41°C的液態(tài)的低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠及液體培養(yǎng)基混合后，分別通過混合液注入孔(1、2、3)注入微管道，同時(shí)以與混合液相同的進(jìn)液速度將硅及表面活性劑的混合液通過注入孔(4)注入微管道，在硅及表面活性劑混合液的作用下形成包含三種微生物的瓊脂糖凝膠微液滴;閉合微閥門(5)使寬管道處于關(guān)閉狀態(tài)，位于寬管道內(nèi)的瓊脂糖凝膠微液滴被微閥門阻擋、截留；堆積的瓊脂糖凝膠微液滴經(jīng)室溫靜置后凝固為瓊脂糖凝膠微球，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的一次固態(tài)包裹； 第二步，開啟微閥門(5)，通過注入孔(6)注入海藻糖凝膠溶液，海藻糖凝膠溶液充滿瓊脂糖凝膠微球之間的間隙空間;通過注入孔(7)注入氯化鈣溶液，將含有微生物的瓊脂糖凝膠微球固定于所在的三維空間位置，形成海藻糖凝膠包裹形成三維堆積結(jié)構(gòu)的固態(tài)微生物凝膠微球(10)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三種微生物的二次固態(tài)包裹； 第三步，通過收集孔(9)收集固態(tài)微生物凝膠微球，并置于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)液通過兩種固態(tài)凝膠的多孔結(jié)構(gòu)滲透進(jìn)入三維凝膠內(nèi)部，對(duì)包裹其中的微生物進(jìn)行三維培養(yǎng)，通過添加熒光染料研究微生物三維群落結(jié)構(gòu)和群落種間通訊。
【文檔編號(hào)】C12M1/00GK105907601SQ201610316963
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】蔣西然, 王妮, 李淑晶, 孫真, 覃開蓉, 李文利, 鄒燕
【申請(qǐng)人】大連理工大學(xué)