一種格氏乳球菌和生物防腐保鮮劑及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種格氏乳球菌和生物防腐保鮮劑及其應(yīng)用，所述的格氏乳球菌命名為格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY?1，保藏號(hào)為CGMCC No.9485。所述的生物防腐保鮮劑含有所述的格氏乳球菌的發(fā)酵液。本發(fā)明格氏乳球菌SY?1的發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抗菌、抑菌活性，特別與菊芋葉提取物按一定比例混合協(xié)同使用，對(duì)山藥等塊根作物的黑斑病具有較好的防治作用，大大減少了其發(fā)病率、延長(zhǎng)了其貯藏時(shí)間，同時(shí)還具有一定的保鮮作用；本發(fā)明格氏乳球菌SY?1發(fā)酵液與菊芋葉提取物混合物具有安全、高效、無毒、無殘留、可食用等眾多優(yōu)點(diǎn)，具有較好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)價(jià)值。CGMCC No.948520140728
【專利說明】
一種格氏乳球菌和生物防腐保鮮劑及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種格氏乳球菌和生物防腐保鮮劑及其應(yīng) 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱，其在自然界 分布廣泛，具有豐富的物種多樣性。它們?cè)诠I(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等與人類生活密切相關(guān) 的領(lǐng)域具有極高的應(yīng)用價(jià)值，因此受到人們極大的關(guān)注和重視。細(xì)菌素是細(xì)菌在代謝過程 中通過核糖體合成機(jī)制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽。對(duì)同種近緣菌株呈現(xiàn) 狹窄的抑制譜，通過在靶細(xì)胞上穿孔、抑制肽聚糖合成，與核糖體或tRNA相互作用抑制蛋白 質(zhì)合成，直接降解靶細(xì)胞DNA，從而起到抑菌效果。乳酸菌通過分泌細(xì)菌素具有一定的抑菌 活性。目前細(xì)菌素已廣泛地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食品加工等領(lǐng)域。
[0003]山藥、土豆、紅薯等是頗具食用和藥用保健價(jià)值的糧食作物，深受廣大群眾的喜 愛，大有發(fā)展前途。近年來，隨著種植面積的不斷擴(kuò)大，其病害發(fā)生也隨之加重，其中包括真 菌病害、細(xì)菌病害以及病毒病害等，而這些病害的發(fā)生在雨水多的季節(jié)尤為突出，其為害程 度也隨之加重，嚴(yán)重制約著這些農(nóng)作物的發(fā)展。目前主要是使用化學(xué)藥劑對(duì)其進(jìn)行防治，化 學(xué)藥劑有毒、有殘留，對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量和人民健康產(chǎn)生重要影響。隨著對(duì)食品安全和健康問題 的普遍關(guān)注，消費(fèi)者對(duì)天然產(chǎn)物的興趣越來越高。由于化學(xué)防腐劑存在的問題和缺陷，天然 生物防腐劑引起了食品工業(yè)界的極大重視。采用天然防腐劑，可以賦予食品更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià) 值，減少或完全停用化學(xué)防腐劑，并且確保食品的微生物安全性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 發(fā)明目的：針對(duì)目前化學(xué)藥劑在山藥、土豆、紅薯等塊根農(nóng)作物黑斑病防治、保鮮 等方面存在的問題，本發(fā)明提出了具有優(yōu)異抑菌效果的一種格氏乳球菌，可將其應(yīng)用于農(nóng) 產(chǎn)品貯藏期間黑斑病防治中以及農(nóng)產(chǎn)品保鮮中。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0006] -種格氏乳球菌，命名為格氏乳球菌（Lactococcus garviea) SY-I，保藏號(hào)為 CGMCC No.9485〇
[0007] 本發(fā)明格氏乳球菌從山藥表皮分離，分類命名為格氏乳球菌Lactococcus garviea，革蘭氏陽性菌，單菌落為乳白色、圓形，表面光滑，邊緣完整，已經(jīng)保藏于中國(guó)微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心，菌種保藏號(hào)為CGMCC No.9485，保藏曰期 2014年 7 月28。
[0008] 本發(fā)明還提供了所述的格氏乳球菌在農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)存期黑斑病防治中的應(yīng)用。所述的 應(yīng)用包括:將所述的格氏乳球菌的發(fā)酵液施加與農(nóng)產(chǎn)品的表面。
[0009] 本發(fā)明還提供了所述的格氏乳球菌在農(nóng)產(chǎn)品保鮮中的應(yīng)用。所述的應(yīng)用包括:將 所述的格氏乳球菌的發(fā)酵液施加于農(nóng)產(chǎn)品的表面。
[0010] 在農(nóng)產(chǎn)品保鮮或黑斑病防治過程中，所述的格氏乳球菌的發(fā)酵液與菊芋葉提取物 聯(lián)合施加于農(nóng)產(chǎn)品的表面，能夠發(fā)揮更好的效果。聯(lián)合施用時(shí)，所述的發(fā)酵液與菊芋葉提取 物的質(zhì)量比為150-200:1，使用時(shí)稀釋0-7倍，較好的稀釋3-5倍。
[0011] 所述的發(fā)酵液的制備方法為:活化所述的格氏乳球菌，然后接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行 培養(yǎng)，獲得種子液;將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液。
[0012] 所述活化的方法為:取所述的格氏乳球菌菌種，劃線至ATB固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn) 行培養(yǎng);培養(yǎng)溫度為25-28°(：，培養(yǎng)時(shí)間為30-3611。
[0013] 制備種子液時(shí)，所述的培養(yǎng)基為ATB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28°C，培養(yǎng)時(shí)間為 24-30h。
[0014] 發(fā)酵時(shí)，接種量為5-10 %體積比，發(fā)酵培養(yǎng)基為ATB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度為25-28 。(：，培養(yǎng)時(shí)間為24-30h。
[0015] ATB液體培養(yǎng)基配方為：葡萄糖8g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨10g/L，MgS〇4 · 7H20 0.2g/L，MnS〇4 · 4H20 0.05g/L，番茄汁250mL/L，pH值4.5-4.8,溶劑為水，121°C滅菌20min。
[0016] 所述的菊芋葉提取物的制備方法包括:取菊芋葉，粉碎、打漿后置于50~60%乙醇 水溶液中進(jìn)行超聲提取，超聲提取結(jié)束后離心，取上清，上清濃縮干燥后得所述的菊芋葉提 取物。
[0017] 超聲提取的料液比為1:10~15。超聲提取的溫度為30-40°C，時(shí)間為60-80min，超 聲功率為600-800w。離心條件為離心力6000-8000g，離心時(shí)間30min。濃縮溫度為30-40°C。
[0018] 所述的農(nóng)產(chǎn)品為山藥、土豆等塊莖。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種生物防腐保鮮劑，含有所述格氏乳球菌的發(fā)酵液。
[0020] 進(jìn)一步的，所述的生物防腐保鮮劑還含有菊芋葉提取物。
[0021] 生物防腐保鮮劑中，所述發(fā)酵液與菊芋葉提取物的質(zhì)量比為150-200:1。
[0022] 所述的生物防腐保鮮劑可應(yīng)用于農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)存期黑斑病防治或農(nóng)產(chǎn)品保鮮中。具體 方法為:將所述的生物防腐保鮮劑用水稀釋0-7倍，較好的為3-5倍，利用噴灑或浸泡處理山 藥等塊根農(nóng)產(chǎn)品，晾干后進(jìn)行貯藏。
[0023] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：
[0024] 1)本發(fā)明從山藥表皮分離獲得了格氏乳球菌SY-I，該菌保藏于中國(guó)微生物菌種保 藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心（菌種保藏號(hào)為CGMCC No.9485,保藏日期2014年7 月28)，該菌株具有優(yōu)異的抑菌效果，特別是對(duì)山藥黑斑病菌具有強(qiáng)烈的抑制作用。
[0025] 2)本發(fā)明采用了格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液，其發(fā)酵液具有較強(qiáng)的抗菌功能，與菊芋 葉提取物按一定比例混合協(xié)同使用，對(duì)山藥等塊根作物貯藏期間的黑斑病具有較好的防治 效果，大大減少了其發(fā)病率、延長(zhǎng)了其貯藏時(shí)間。
[0026] 3)本發(fā)明格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋提取物混合物和普通化學(xué)藥劑相比，具有 安全、高效、無毒、無殘留、可食用、不會(huì)對(duì)環(huán)境和人體造成任何傷害等眾多優(yōu)點(diǎn)，
[0027] 4)本發(fā)明格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋提取物混合物主要用于山藥等塊根作物 在貯藏期間黑斑病的防治，同時(shí)其還可以減少塊根水分的散失、抑制其呼吸強(qiáng)度，具有一定 的保鮮作用。
【附圖說明】
[0028] 圖1為格氏乳球菌SY-I抑菌圖；
[0029] 圖2為格氏乳球菌SY-I在ATB培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)；
[0030] 圖3為格氏乳球菌SY-I革蘭氏染色圖；
[0031] 圖4為格氏乳球菌SY-I 16S rRNA基因序列；
[0032]圖5為格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋提取物混合物對(duì)山藥黑斑病防治作用；
[0033]圖6為格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋提取物混合物對(duì)土豆保鮮作用。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明所涉及的格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY_l，已于2014年7月28保藏 于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物菌種保藏中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址北京市朝陽 區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)，分類命名為格氏乳球 菌Lactococcus garviea，菌種保藏號(hào)為CGMCC No·9485。本發(fā)明格氏乳球菌(Lactococcus garvi ea) SY-I是從山藥表皮分離獲得。
[0035] 以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但并不限定于本發(fā)明。若無特別說明，下述實(shí)施例中 所用技術(shù)方法均為常規(guī)方法;若無特別說明，下述實(shí)施例中所用實(shí)驗(yàn)材料均為常規(guī)化學(xué)試 劑和生化試劑。
[0036]以下所述的ATB培養(yǎng)基配方為:葡萄糖8g/L，酵母浸粉4g/L，蛋白胨10g/L,MgSO4 · 7H20 0.2g/L，MnS〇4 · 4H20 0.05g/L，番茄汁250mL/L，pH值4.5-4.8，121°C滅菌SOmiruATB固 體培養(yǎng)基:ATB液體培養(yǎng)基中加入2 %瓊脂。
[0037]實(shí)施例1格氏乳球菌SY-I的分離鑒定 [0038] 1、分離
[0039]取新鮮山藥皮(帶泥土)50g，打碎，混合均勻，取IOg處理過的山藥皮倒入含有20粒 細(xì)玻璃珠和IOOmL滅菌去離子水的250mL三角瓶中，在搖床上150r/min、25°C條件下震蕩lh， 靜止30min后，取上清lmL，用滅菌去離子水10倍梯度稀釋，分別得到10' 10' 10-3、10-4、10 一5、10-6、10- 77個(gè)梯度，分別吸取100yL，不同梯度稀釋液涂于ATB固體平板培養(yǎng)基上，25-28 °C，靜止培養(yǎng)30-36h。利用接種環(huán)挑取單菌落在ATB固體培養(yǎng)基平板上劃線純化2-3次，將純 化的不同形態(tài)的單菌落編號(hào)轉(zhuǎn)接到ATB固體平板上，25-28Γ，靜止培養(yǎng)30-36h，然后保存于 4°C待用。
[0040] 2、抑菌試驗(yàn)
[0041]將保存于ATB固體培養(yǎng)基上的純化了的菌株在ATB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 25°C，靜止培養(yǎng)36h。另外將山藥表皮黑斑上的菌體接種到ATB固體培養(yǎng)基平板上，均勻涂 布，在30°C培養(yǎng)48h。然后利用滅菌打孔器在固體平板上打孔，孔徑為4mm，每個(gè)平板均勻打6 個(gè)孔。然后將40yL培養(yǎng)好的待測(cè)定分離純化菌液滴加到孔內(nèi)，在28°C靜止培養(yǎng)36h，通過抑 菌圈評(píng)估待測(cè)菌株對(duì)山藥黑斑病菌的抑制活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)有三株菌株對(duì)山藥黑斑病菌有明 顯抑制作用，但SY-I抑制活性最強(qiáng)，抑菌圈直徑為24.3mm，結(jié)果見圖1。因此后面對(duì)這株菌進(jìn) 行了進(jìn)一步的鑒定。
[0042] 3、形態(tài)觀察
[0043]將抑菌活性最強(qiáng)的菌株SY-I接種到IOOmL ATB液體培養(yǎng)基中，25°C靜止培養(yǎng)30h， 然后在無菌條件下用無菌接種環(huán)在ATB固體培養(yǎng)基上劃線，之后在25°C靜止培養(yǎng)36h，觀察 菌落形態(tài)，單菌落為乳白色、圓形，表面光滑，邊緣完整，結(jié)果見圖2所示。挑取單菌落，進(jìn)行 革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察，此菌為革蘭氏染色陽性球菌，結(jié)果見圖3所示。由圖2和圖3 結(jié)果基本鑒定SY-I為乳酸球菌。
[0044] 4、分子生物學(xué)鑒定
[0045]利用滅菌牙簽挑取SY-I單菌落于含有50mL ATB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，在 25 °C靜止培養(yǎng)24h，然后利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取此菌的基因組DNA。利用16S rRNA通用引物fd2 (5 ' -AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3 '）和rpI (5 ' -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3 '） PCR擴(kuò)增DNA片段，將PCR產(chǎn)物送基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。此菌16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果如圖4 所示。根據(jù)獲得的16S rRNA基因序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中利用genebank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，得出 其與格氏乳球菌基因相似度最高達(dá)99.5%，因此鑒定此菌為格氏乳球菌（Lactococcus garviea)，并命名此菌為格氏乳球菌SY-I。
[0046]實(shí)施例2菌株的應(yīng)用 [0047] 1、抑菌試驗(yàn)
[0048] 格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液的制備:取格氏乳球菌SY-I保藏菌種，無菌操作下劃線至 ATB固體培養(yǎng)基平板上，進(jìn)行活化培養(yǎng);活化培養(yǎng)后，在無菌條件下挑取單菌落接種至裝有 50mL ATB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，進(jìn)行培養(yǎng)，獲得種子液;將種子液按5 %體積比接種 至新的ATB培養(yǎng)基中，在28 °C條件下靜止培養(yǎng)24h，得發(fā)酵液；
[0049] 菊芋葉提取物的制備:取新鮮菊芋葉，粉碎、打漿，按照1:10料液比(g/L)混合后置 于50%乙醇水溶液中進(jìn)行超聲提取，提取溫度40°C，提取時(shí)間60min，超聲波功率800w;提取 后在8000g離心力下，離心30min，除去沉淀取上清;將上清在30°C真空濃縮，然后冷凍干燥 得菊芋葉提取物。
[0050] 將格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋葉提取物按一定比例混合后稀釋不同比例，噴灑 到新鮮山藥表面，放置30天后，檢測(cè)山藥黑斑病的發(fā)病率。以噴灑清水、格氏乳球菌SY-I發(fā) 酵液和菊芋液提取物為對(duì)照，結(jié)果如表1所示。
[0051 ]實(shí)驗(yàn)組1:發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比200:1配制使用；
[0052]實(shí)驗(yàn)組2:發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比200:1配制后用水稀釋3倍使用；
[0053]實(shí)驗(yàn)組3:發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比200:1配制后用水稀釋5倍使用；
[0054]實(shí)驗(yàn)組4:發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比200:1配制后用水稀釋7倍使用；
[0055] 對(duì)照組1:清水；
[0056] 對(duì)照組2:格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液；
[0057] 對(duì)照組3:菊芋葉提取物，用水稀釋為濃度0.5 %使用。
[0058]表1
[0060]由表1可知，格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液和菊芋葉提取物對(duì)山藥黑斑病都具有一定的 抑制效果，但低于兩者混合物的抑制效果。兩者混合質(zhì)量比為200:1時(shí)，稀釋1倍到5倍，抑制 效果基本一樣，稀釋7倍時(shí)抑制效果明顯減弱。根據(jù)此結(jié)果最終確定發(fā)酵液與菊芋葉提取物 按質(zhì)量比150-200:1進(jìn)行混合，然后稀釋3-5倍使用。
[0061] 2、在防治山藥黑斑病中的應(yīng)用
[0062] 將保存的格氏乳球菌SY-I種子液按10 %體積比接種到ATB液體培養(yǎng)基中，25 °C靜 止培養(yǎng)30h得發(fā)酵液。取新鮮菊芋葉，粉碎、打漿，按照1:10料液比（g/L)混合后置于50%乙 醇溶液中進(jìn)行超聲提取，提取溫度40°C，提取時(shí)間60min，超聲波功率800w;提取后在8000g 離心力下，離心30min，除去沉淀取上清;將上清在30°C真空濃縮，然后冷凍干燥得菊芋葉提 取物。將格氏乳球菌SY-I發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比150:1進(jìn)行混合，然后加水稀釋3 倍、5倍，然后噴灑到新鮮山藥表面，噴灑完后進(jìn)行常溫儲(chǔ)藏，分別在貯藏20天、30天和40天 后檢測(cè)山藥發(fā)病率，結(jié)果如圖5所示。噴灑3倍稀釋液的山藥貯藏20天、30天和40天后山藥發(fā) 病率分別為3%、7 %和13%，噴灑5倍稀釋液的山藥貯藏20天、30天和40天后山藥發(fā)病率分 別為 4%、11% 和 18%。
[0063] 3、在土豆保鮮中的應(yīng)用
[0064]將保存的格氏乳球菌SY-I種子液按10 %體積比接種到ATB液體培養(yǎng)基中，25 °C靜 止培養(yǎng)30h得發(fā)酵液。取新鮮菊芋葉，粉碎、打漿，按照1:15料液比（g/L)混合后置于60%乙 醇溶液中進(jìn)行超聲提取，提取溫度30°C，提取時(shí)間80min，超聲波功率600w;提取后在6000g 離心力下，離心30min，除去沉淀取上清;將上清在40°C真空濃縮，然后冷凍干燥得菊芋葉提 取物。將發(fā)酵液與菊芋葉提取物按質(zhì)量比200:1進(jìn)行混合，然后加水稀釋5倍，然后噴灑到新 鮮土豆表面，噴灑完后進(jìn)行常溫儲(chǔ)藏，每隔5天測(cè)定一次重量，得出失重率，結(jié)果如圖6所示。 由圖6可知噴灑本發(fā)明液體的土豆失重率明顯低于對(duì)照失重率，說明本發(fā)明格氏乳球菌SY-1發(fā)酵液與菊芋葉提取物混合物具有較好的保鮮效果。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種格氏乳球菌，其特征在于，命名為格氏乳球菌(Lactococcus garviea)SY_l，保 藏號(hào)為CGMCC No.9485。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的格氏乳球菌在農(nóng)產(chǎn)品保鮮或農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)存期黑斑病防治中的應(yīng) 用。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用包括:將所述的格氏乳球菌的 發(fā)酵液施加于農(nóng)產(chǎn)品的表面。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，將所述的格氏乳球菌的發(fā)酵液與菊芋葉提 取物聯(lián)合施加于農(nóng)產(chǎn)品的表面。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，聯(lián)合施用時(shí)，所述的發(fā)酵液與菊芋葉提取 物的質(zhì)量比為150-200:1，稀釋0-7倍使用。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵液的制備方法為:活化所述 的格氏乳球菌，然后接種于培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，獲得種子液;將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中 進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后獲得發(fā)酵液。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的菊芋葉提取物的制備方法包括:取 菊芋葉，粉碎、打漿后置于50~60%乙醇水溶液中進(jìn)行超聲提取，超聲提取結(jié)束后離心，取 上清，上清濃縮干燥后得所述的菊芋葉提取物。8. -種生物防腐保鮮劑，其特征在于，含有所述格氏乳球菌的發(fā)酵液。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的生物防腐保鮮劑，其特征在于，所述的生物防腐保鮮劑還含有 菊芋葉提取物，所述發(fā)酵液與菊芋葉提取物的質(zhì)量比為150-200:1。10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的生物防腐保鮮劑在農(nóng)產(chǎn)品保鮮或農(nóng)產(chǎn)品儲(chǔ)存期黑斑病防 治中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK105861400SQ201610438452
【公開日】2016年8月17日
【申請(qǐng)日】2016年6月17日
【發(fā)明人】馬艷弘, 李亞輝, 殷劍美, 張宏志, 張培通, 黃開紅
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院