海洋來源芽孢桿菌抗菌蛋白md及其制備方法
【專利摘要】海洋來源芽孢桿菌抗菌蛋白MD及其制備方法，涉及一種微生物來源的抗菌蛋白。芽孢桿菌培養(yǎng)后取上清，加入硫酸銨至飽和度為60％，離心，取沉淀物重新溶于水中，經(jīng)透析、凍干、再溶解，得粗蛋白溶液，再在乙基氨基乙基陰離子交換色譜柱上分離純化，收集各組分，離心超濾濃縮后，以金黃色葡萄球菌為受試指示菌跟蹤活性組分；將濃縮后具有活性組分在季銨鹽強陰離子交換柱上分離純化，收集各洗脫組分，超濾濃縮并檢驗抑菌活性，確定活性成分后通過SDS?PAGE電泳判斷組分純度；割取SDS?PAGE電泳圖上的單一條帶，進行液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用檢測鑒定，并以全基因組編碼蛋白序列為數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得MD抗菌蛋白序列。CCTCC NO：M201621120160420
【專利說明】
海洋來源芽孢桿菌抗菌蛋白MD及其制備方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種微生物來源的抗菌蛋白，尤其是涉及一種海洋來源芽孢桿菌抗菌 蛋白MD及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 目前在全球范圍內(nèi)都面臨著嚴重的食品安全問題，特別是食品污染菌及致病菌對 食品安全的影響極大。食品污染菌主要有大腸桿菌、沙門氏菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球 菌等。無論在食品領域還是醫(yī)藥領域，對抗細菌藥物的需要量都在不斷地增長。然而，大量 使用防腐劑、抗生素等來抑制食品中的細菌的方法對人類健康造成了巨大的負面影響，因 此來源天然的抗菌物質(zhì)已經(jīng)引起了人們的廣泛關注。其中抗細菌蛋白不僅來源廣、具有獨 特的作用機制，而且基本不會使作用菌產(chǎn)生抗藥性的優(yōu)點為新型抗細菌活性物質(zhì)的研究提 供了重要信息。
[0003] 芽孢桿菌是一類好氧或兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，呈桿狀并能產(chǎn)生芽孢，其芽孢 具有很強的抗逆性，對熱、紫外線、電磁輻射和某些化學藥品有很強抗性，因此在自然界中 芽孢桿菌分布非常廣泛。另外芽孢桿菌屬菌株普遍具有較發(fā)達的分泌系統(tǒng)，能產(chǎn)生多種次 級代謝產(chǎn)物如脂肽、多肽、蛋白質(zhì)（酶）、非蛋白類產(chǎn)物等，而且有些代謝產(chǎn)物具有廣泛的抑 菌譜，所以它們被廣泛地應用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領域并取得了許多重要的成果（[l]Wang T， Liang Y，Wu M，Chen ZjLin JjYang L.2015.Natural products from Bacillus subtilis with antimicrobial properties.Chinese Journal of Chemical Engineering 23:744-754·)。
[0004] 目前已發(fā)現(xiàn)的芽孢桿菌抗菌肽主要由兩種途徑合成：非核糖體合成及核糖體合 成。非核糖體合成的抗菌肽主要有:伊枯草菌素、表面活性肽、Fengycin、Maltacines等;核 糖體合成的抗菌肽有:枯草菌素 、Er icin、Mersacidin、Sublancin等?？莶菥厥且环N硫醚 類抗菌肽，它由32個氨基酸組成五元環(huán)，分子量一般小于5kDa，其中它有60%的氨基酸序列 與目前應用廣泛的食品級抗生素 Nisin-致。由枯草芽孢桿菌菌株B.subtilisAl/3產(chǎn)生的 Ericin也是一種硫醚類抗菌肽。美殺菌素（Mersacidin)是由枯草芽孢桿菌菌株 B.subtilisHILY-85發(fā)酵產(chǎn)生的，它是一種含有羊毛硫氨酸的抗菌肽，由20個氨基酸構(gòu)成， 分子量為1825Da( [2]S· W.Fuchs，T .W. Jaskolla，S· Bochmann，P · K6Uei'，T .Wichelhaus， M-KarasjT-SteinjK-D-EntianjEntianin ja novel subtilin-like lantibiotic from Bacillus subtiIissubsp·spizizenii DSM 15029T with high antimicrobial activity,Appl.Environ.Microbiol .77(5)(2011)1698-1707；[3]T. Stein,S.Borchert, B. Conrad,J.FeeschejB.Hofemeister,J.Hofemeister,K.D.Entian , Two different lantibiotic-1ike peptides originate from the ericin gene cluster of Bacillus subtilis Al/3，J.Bacteriol.184(6)(2002)1703-1711;[4]M.S.Barrett，R.P·Wenzel， R.N.Jones , In vitro activity of mersacidin(M87-1551)，an investigational peptide antibiotic tested against gram-positive bloodstream isolates, Diagn.Microbiol. Infect.Dis.15(7)(1992)641-644)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種海洋芽孢桿菌(Bacillus sp.)MD-5。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供一種海洋芽孢桿菌抗菌蛋白MD及其制備方法。
[0007] 本發(fā)明的目的之三在于提供一種液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用結(jié)合海洋芽孢桿菌MD-5 (Baci I Ius sp. MD-5)基因組圖譜鑒定MD抗菌蛋白的方法。
[0008] 所述海洋芽孢桿菌(Bacillus sp.)MD-5已于2016年4月20日保藏于中國典型培養(yǎng) 物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO: M2016211，中國典型培養(yǎng)物保藏中心的地址是中國，武 漢，武漢大學。
[0009] 所述海洋芽孢桿菌(Bacillus sp.)MD-5是從中國第六次北極科學考察獲取的海 洋沉積物樣品中分離得到。將該菌株接種于L B培養(yǎng)基，在28°C、180rpm條件下培養(yǎng)48h。
[0010] 海洋芽孢桿菌蛋白MD是從海洋芽孢桿菌Bacillus sp.MD-5發(fā)酵液上清中分離純 化得到的一種抗菌蛋白，由93個氨基酸組成，序列如下：
[0011] MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKIT KNNNGTffTAYYEGRKYo
[0012] 所述海洋芽孢桿菌抗菌蛋白MD的制備方法，包括以下步驟：
[0013] 1)活化海洋芽孢桿菌(Bacillus sp.)MD-5并接種于L B培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)后， 收集發(fā)酵液上清；
[0014] 在步驟1)中，所述L B培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:每IOOmL液體培養(yǎng)基中含1% 氯化鈉，1 %蛋白胨，0.5 %酵母提取物，其余為去離子水；
[0015] 所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為28°C、180rpm，發(fā)酵培養(yǎng)時間為48h;所述收集發(fā)酵液上清 可通過8,000rpm離心的方法將所得發(fā)酵液中的菌體去除后獲得。
[0016] 2)在步驟1)所收集到的發(fā)酵液上清中加入硫酸銨至60%的飽和度靜置后得混合 溶液；
[0017] 在步驟2)中，所述靜置的條件可于4°C下靜置過夜。
[0018] 3)將步驟2)所得混合溶液離心，收集的沉淀用水重新溶解，獲得含鹽的粗蛋白溶 液；
[0019] 在步驟3)中，所述離心的條件可將混合溶液于10,000rpm、4°C條件下離心30min。
[0020] 4)將步驟3)所得含鹽的粗蛋白溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中進行透析，除去多余的鹽離 子，待硫fe錢除干凈后，收集除鹽后的粗蛋白洛液；
[0021] 在步驟4)中，所述透析可用ddH20,在4°C條件下進行;檢驗硫酸銨是否透析干凈用 奈氏試劑。
[0022] 5)將步驟4)所得除鹽后的粗蛋白溶液凍干濃縮，去除水相，得到固體的粗蛋白，再 用緩沖液將粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液；
[0023] 在步驟5)中，所述粗蛋白溶液凍干，可先將除鹽后的粗蛋白溶液轉(zhuǎn)移到冷凍真空 干燥機中于-80°C凍上再放入凍干機中凍干;所述緩沖液采用20mM Tris-HCl，pH 8.1。
[0024] 6)將步驟5)所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換 色譜柱上進行第一步的分離純化，洗脫程序為:0%8、3%8、10%8、100%8，根據(jù)依次出現(xiàn)的 280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，利用瓊脂 平板擴散法在指示菌板上檢測各個組分的抑菌活性；
[0025] 在步驟6)中，所述洗脫液B組成為:20mM Tris-HCl+lM NaCl，pH 8.1;所述超濾濃 縮的條件為4,100rpm、4°C;所述指示菌板為含金黃色葡萄球菌LB固體培養(yǎng)平板，具體步驟 如下:指示菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，以1:100接種金黃色葡萄球菌于37°C搖至OD 6OO為1.0左右， 用LB培養(yǎng)基稀釋至OD6qq為0.5，以0.16yL/mL的濃度將稀釋好金黃色葡萄球菌接入到瓊脂濃 度為0.75 %滅過菌的LB培養(yǎng)基中，接入溫度約為45~50 °C為宜，充分混勻后倒板，凝固后用 封口膜封口并置于4°C冰箱冷藏備用;所述瓊脂平板擴散法檢驗抑菌活性的具體步驟如下： 用滅過菌的打孔器(直徑IOmm)在混菌板上打孔，并用滅過菌的牙簽挑出培養(yǎng)基塊，每孔加 入50yL待檢測的組分，并于超凈臺中吹干后置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h并觀察是否有抑菌圈。 [0026] 7)將步驟6)獲得的具有抗真菌活性的組分繼續(xù)在季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換 色譜柱上進行第二步分離純化，直線洗脫IOOmL至洗脫液B比例為13%，同樣根據(jù)依次出現(xiàn) 的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，利用瓊 脂擴散法追蹤各個組分的抑菌活性，同樣以金黃色葡萄球菌為指示菌，活性組分確定后，通 過SDS-PAGE電泳圖判斷組分中的蛋白純度。
[0027] 8)將步驟7)獲得的活性組分再一次用季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換柱進行分 離，變換平衡緩沖液A和洗脫液B(A:50mM MES，pH 6;B:50mM MES+1M NaCl，pH 6)，直線洗脫 50mL至洗脫液B比例為20%，同樣根據(jù)依次出現(xiàn)的280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用 超濾濃縮管對各洗脫組分進行離心超濾濃縮，利用瓊脂擴散法檢驗各個組分的抑菌活性， 活性組分確定后，通過SDS-PAGE電泳圖判斷組分中的蛋白純度。
[0028] 9)將步驟8)獲得的活性組分進行15 % SDS-PAGE電泳，在I OkDa以下得到單一條帶， 再用該組分進行小分子蛋白電泳，在4.6kDa附近得到單一條帶，將該組分命名為MD抗菌蛋 白。
[0029 ]所述海洋芽孢桿菌抗菌蛋白MD的鑒定包括以下步驟：
[0030] 1)將小分子蛋白電泳凝膠上的單一條帶切下，用無菌去離子水洗滌。
[0031] 2)用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行檢測。
[0032] 3)以芽孢桿菌Bacillus sp.MD-5全基因組編碼蛋白序列為數(shù)據(jù)庫，對檢測結(jié)果進 行數(shù)據(jù)比對；
[0033]在步驟3)中，比對到一條由93個氨基酸組成的多肽序列，其序列為： MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKIT KNNNGTffTAYYEGRKYo
[0034]本發(fā)明是從海洋芽孢桿菌Bacillus sp.MD-5發(fā)酵液上清中分離純化到一種抗菌 蛋白MD，該抗菌蛋白對食品污染菌金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌有明顯的抑制作用。該抗 菌蛋白氨基酸序列新穎，是一種新的抗菌蛋白。經(jīng)檢測，MD抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌的最 小抑菌濃度為7.33yg/mL，而且在pH為10的條件下該蛋白仍具有抗菌活性，顯示出其在食品 保藏等方面具有潛在的應用前景。
【附圖說明】
[0035] 圖1為活性組分Ql再次使用季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換柱進行色譜分離的情 況。在圖1中，橫坐標表示洗脫運行時間(min)，縱坐標表示紫外吸收值(mAU); 1，表示組分1; 2表示活性組分2。
[0036] 圖2為組分2進行小分子蛋白膠電泳圖譜。在圖2中，泳道M為蛋白分子量標準，泳道 1和2為活性組分2。
[0037]圖3為Ql組分在季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換柱上分離后的各個組分對金黃色 葡萄球菌的抑制效果。1表示組分1，2表示組分2。
[0038]圖4為Ql組分在季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換柱上分離后的各個組分對單增李 斯特菌的抑制效果。1表示組分1，2表示組分2，CK表示洗脫緩沖液的空白對照。
[0039] 圖5為微量稀釋法檢驗最小抑菌濃度。通過二倍稀釋法，用0D_檢測敏感指示菌金 黃色葡萄球菌的生長，判斷MD抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度，拐點所對應的 濃度7.33yg/mL即為其最小抑菌濃度。
[0040] 圖6為pH對MD抗菌蛋白抑菌活性的影響。所用指示菌混菌板為金黃色葡萄球菌，通 過測量抑菌半徑，以PH為X軸，以抑菌半徑(mm)為y軸做柱狀圖。
[0041] 圖7為溫度對MD抗菌蛋白抑菌活性的影響。所用指示菌混菌板為金黃色葡萄球菌， 通過測量抑菌半徑，以溫度為X軸，以抑菌半徑(mm)為y軸做柱狀圖。
【具體實施方式】
[0042] 以下實施例將結(jié)合附圖對本發(fā)明作詳細說明。
[0043] 1.菌種
[0044] 本發(fā)明涉及菌株芽孢桿菌MD-5是從中國第六次北極科學考察獲取的海洋沉積物 樣品中分離得到，它的發(fā)酵上清對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、蘇云金芽孢桿菌、嗜水 氣單胞菌、哈維氏弧菌等具有明顯抑制活性。
[0045] 2.培養(yǎng)基
[0046] LB培養(yǎng)基:0.5 %酵母提取物，1 %蛋白胨，及1 % NaCl，用去離子水配制。
[0047] 實施例1:活性吸附組分Ql使用季銨鹽(Capto Q)強陰離子交換色譜柱再次進行色 譜分離
[0048] 平衡液A:50mM MES，pH 6,洗脫液B:50mM MES+1M NaCl，pH 6。先使用平衡緩沖液A 平衡Capto Q陰離子交換色譜柱，將濃縮至700yL左右的吸附組分Ql在Capto Q陰離子交換 色譜柱上樣，使用兩個柱體積的平衡緩沖液A沖洗層析柱，未獲得非吸附組分，再采用直線 洗脫方式洗50mL至洗脫液B為20 %，將吸附組分1、2洗脫下來(圖1)。
[0049] 實施例2:活性組分2跑小分子蛋白膠
[0050] 分離到的各活性組分2跑小分子蛋白電泳，硝酸銀染色后在電泳染色圖譜得到組 分2為一條單一條帶，并顯示該蛋白的分子量約為4.6kDa(圖2)，命名為MD抗菌蛋白。
[0051]實施例3:分離產(chǎn)物MD抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌的抑制效果
[0052]采用瓊脂平板擴散法檢驗抑菌活性具體步驟如下：用滅過菌的打孔器(直徑IOmm) 在金黃色葡萄球菌及李斯特菌混菌板上打孔，并用滅過菌的牙簽挑出培養(yǎng)基塊，每孔加入 50yL分離組分2(MD抗菌蛋白），并于超凈臺中吹干后置于37°C培養(yǎng)箱培養(yǎng)12h并觀察是抑菌 圈（圖3、圖4)。
[0053]實施例4:MD抗菌蛋白的鑒定及信號肽預測
[0054]對MD抗菌蛋白進行LC-MS鑒定，比對到一條由93個氨基酸組成的序列：
[0055] MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYLKKIT KNNNGTffTAYYEGRKYo
[0056] 實施例5:MD抗菌蛋白對金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度的測定
[0057]最小抑菌濃度測定通過微孔稀釋法在96孔板中測定，抗菌蛋白采用二倍梯度稀釋 法。用50mM MES緩沖液(pH = 6)進行梯度稀釋。指示菌金黃色葡萄球菌用LB培養(yǎng)基搖培至 OD6(X) = O.5,梯度稀釋至105CFU/mL，分別取90yL該菌液于96孔板的2~10孔中，每孔加入10μ L各個梯度稀釋過的抑菌蛋白。第一孔加入90yL LB和IOyL的MES作為陰性空白對照，第十二 孔加90yL指示菌菌液和IOyLMES緩沖液陽性空白對照，上述過程15min內(nèi)做完，每株指示菌 做三個平行。把96孔板置于37°C培養(yǎng)12~18h，取出后用滅過菌的槍頭打勻，用酶標儀測定 OD6Q0。以抗菌蛋白濃度為橫坐標，以OD6qq值為縱坐標做曲線，拐點為最小抑菌濃度。通過二 倍稀釋法，檢測到MD抗菌蛋白金黃色葡萄球菌的最低抑制濃度為7.33yg/mL(圖5)。
[0058]實施例6: pH對抗菌蛋白MD抗菌活性的影響
[0059] 純化出來的抗菌蛋白保存在50mM MES-NaOH緩沖液中（pH = 6)。取250yL的抗菌蛋 白分別于滅過菌的2mL EP管中，分別加入pH為2(50mM甘氨酸-HCl緩沖液）、4(5〇11^他八(：-HAC)、6(50mM MES-NaOH)、7(50mM NaH2P〇4-NaHP〇4)、8(50mMTris-HCl)、9(50mM甘氨酸-NaOH)、10 (50mM甘氨酸-NaOH)、11 (50mM甘氨酸-NaOH-NaCl)的緩沖液各1.5mL，混勻后室溫 下作用4h，13 ,OOOrpm離心15min，把上清轉(zhuǎn)到3kDa超濾管中，4, IOOrpm離心至每管250yL，以 各個梯度緩沖液為對照用瓊脂擴散法在金黃色葡萄球菌混菌板上檢驗抑菌效果，結(jié)果表明 MD抗菌蛋白在pH 6~10基本保持穩(wěn)定且活性好，pH為4和11時雖然有所降低但仍保持一定 的活性（圖6)。
[0060]實施例7:溫度對抗菌蛋白MD抗菌活性的影響
[0061 ] 將MD抗菌蛋白溶液于40 °C、60 °C、80 °C、100 °C條件下分別處理30min以及121°C高 壓滅菌條件下處理20min;處理后的MD抗菌蛋白溶液冷卻后后離心，以未處理的MD蛋白溶液 為陽性對照，檢測各樣品對金黃色葡萄球菌的抑菌活性;結(jié)果表明MD抗菌蛋白受熱處理程 度的影響較大，當溫度小于40 °C活性蛋白的抑菌效果基本保持不變，當溫度達到60°C抑菌 性有略微的降低但仍不明顯，當溫度升高到80°C以上抑菌效果有明顯的降低直至120°C完 全失活，說明MD蛋白可耐受一定程度的高溫條件(圖7)。
【主權(quán)項】
1. 海洋芽孢桿菌(Baci 1 lus sp. )MD-5，已于2016年4月20日保藏于中國典型培養(yǎng)物保 藏中心，保藏編號為CCTCC N0:M2016211。2. 海洋芽孢桿菌蛋白MD，其特征在于其是從海洋芽孢桿菌(Bacillus sp. )MD-5發(fā)酵液 上清中分離純化得到的一種抗菌蛋白，由93個氨基酸組成，序列如下： MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYL KKITKNNNGTffTAYYEGRKY 〇3. 如權(quán)利要求2所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于包括以下步驟： 1) 活化海洋芽孢桿菌(Bacillus sp.)MD-5并接種于L B培養(yǎng)基進行發(fā)酵培養(yǎng)后，收集 發(fā)酵液上清； 2) 在步驟1)所收集到的發(fā)酵液上清中加入硫酸銨至60%的飽和度靜置后得混合溶液； 3) 將步驟2)所得混合溶液離心，收集的沉淀用水重新溶解，獲得含鹽的粗蛋白溶液； 4) 將步驟3)所得含鹽的粗蛋白溶液轉(zhuǎn)移到透析袋中進行透析，除去多余的鹽離子，待 硫酉支錢除干凈后，收集除鹽后的粗蛋白洛液； 5) 將步驟4)所得除鹽后的粗蛋白溶液凍干濃縮，去除水相，得到固體的粗蛋白，再用緩 沖液將粗蛋白溶解，得重新溶解后的粗蛋白溶液； 6) 將步驟5)所得重新溶解后的粗蛋白溶液在二乙基氨基乙基(DEAE)陰離子交換色譜 柱上進行第一步的分離純化，洗脫程序為：〇%B、3%B、10%B、100%B，根據(jù)依次出現(xiàn)的 280nm紫外吸收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，利用瓊脂 平板擴散法在指示菌板上檢測各個組分的抑菌活性； 7) 將步驟6)獲得的具有抗真菌活性的組分繼續(xù)在季銨鹽強陰離子交換色譜柱上進行 第二步分離純化，直線洗脫l〇〇mL至洗脫液B比例為13%，同樣根據(jù)依次出現(xiàn)的280nm紫外吸 收峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行超濾濃縮，利用瓊脂擴散法追蹤 各個組分的抑菌活性，同樣以金黃色葡萄球菌為指示菌，活性組分確定后，通過SDS-PAGE電 泳圖判斷組分中的蛋白純度； 8) 將步驟7)獲得的活性組分再一次用季銨鹽強陰離子交換柱進行分離，變換平衡緩沖 液A和洗脫液B，直線洗脫50mL至洗脫液B比例為20 %，同樣根據(jù)依次出現(xiàn)的280nm紫外吸收 峰收集各洗脫組分，使用超濾濃縮管對各洗脫組分進行離心超濾濃縮，利用瓊脂擴散法檢 驗各個組分的抑菌活性，活性組分確定后，通過SDS-PAGE電泳圖判斷組分中的蛋白純度;所 述平衡緩沖液A的組成為50mM MES，pH 6;所述洗脫液B的組成為50mM MES+1M NaCl，pH 6; 9) 將步驟8)獲得的活性組分進行15 % SDS-PAGE電泳，在1 OkDa以下得到單一條帶，再用 該組分進行小分子蛋白電泳，在4.6kDa附近得到單一條帶，將該組分命名為MD抗菌蛋白。4. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟1)中，所述L B培養(yǎng)基按質(zhì)量百分比的組成為:每1 OOmL液體培養(yǎng)基中含1 %氯化鈉，1 %蛋白胨，0.5 %酵 母提取物，其余為去離子水； 所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件為28°C、180rpm，發(fā)酵培養(yǎng)時間為48h;所述收集發(fā)酵液上清可通 過8，OOOrpm離心的方法將所得發(fā)酵液中的菌體去除后獲得。5. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟2)中，所述靜 置的條件是于4°C下靜置過夜;在步驟3)中，所述離心的條件可將混合溶液于10,000rpm、4 °C條件下離心30min。6. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟4)中，所述透 析是用ddH20,在4°C條件下進行;檢驗硫酸銨是否透析干凈用奈氏試劑。7. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟5)中，所述粗 蛋白溶液凍干，是先將除鹽后的粗蛋白溶液轉(zhuǎn)移到冷凍真空干燥機中于_80°C凍上再放入 凍干機中凍干;所述緩沖液采用20mM Tris-HCl，pH 8.1。8. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述洗 脫液B組成為:20mM Tris-HCl+lM NaCl，pH 8.1;所述超濾濃縮的條件為4，100rpm、4°Cj；f 述指示菌板為含金黃色葡萄球菌LB固體培養(yǎng)平板，具體步驟如下：指示菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng) 基，以1:100接種金黃色葡萄球菌于37 °C搖至OD600為1.0左右，用LB培養(yǎng)基稀釋至OD6q〇為 0.5，以0.16yL/mL的濃度將稀釋好金黃色葡萄球菌接入到瓊脂濃度為0.75%滅過菌的LB培 養(yǎng)基中，接入溫度約為45~50°C為宜，充分混勻后倒板，凝固后用封口膜封口并置于4°C冰 箱冷減備用。9. 如權(quán)利要求3所述海洋芽孢桿菌蛋白MD的制備方法，其特征在于在步驟6)中，所述瓊 脂平板擴散法檢驗抑菌活性的具體步驟如下：用滅過菌的打孔器在混菌板上打孔，并用滅 過菌的牙簽挑出培養(yǎng)基塊，每孔加入50yL待檢測的組分，并于超凈臺中吹干后置于37°C培 養(yǎng)箱培養(yǎng)12h并觀察是否有抑菌圈。10. 如權(quán)利要求1所述海洋芽孢桿菌抗菌蛋白MD的鑒定，其特征在于包括以下步驟： 1) 將小分子蛋白電泳凝膠上的單一條帶切下，用無菌去離子水洗滌； 2) 用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法進行檢測； 3) 以芽孢桿菌Bacillus sp.MD-5全基因組編碼蛋白序列為數(shù)據(jù)庫，對檢測結(jié)果進行數(shù) 據(jù)比對;比對到一條由93個氨基酸組成的多肽序列，其序列為： MKLKKVLTGSALSLALLVSAAPAFAANPDGTHSEQTSVASSDFKANIYTKTETNDTGIFINSYTDADGITWYL KKITKNNNGTffTAYYEGRKY 〇
【文檔編號】C12P21/02GK105861396SQ201610421332
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年6月13日
【發(fā)明人】陳新華, 吳雅萍, 郭文斌
【申請人】國家海洋局第三海洋研究所