11"聚苯乙締板中，37°(3、200巧111培養(yǎng)過(guò)夜，約14}1， 將過(guò)夜培養(yǎng)的產(chǎn)物用8通道的移液器W4%的接種量轉(zhuǎn)接至300化的新鮮LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、200巧m培養(yǎng)2.5 h，然后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG，30°C、200 rpm誘導(dǎo)8 h，得 到誘導(dǎo)后的菌液，備用； 步驟二、菌體的堿裂解:將步驟一所得誘導(dǎo)后的菌液置于8000 g離屯、1 min,去上清后， 將菌體重懸于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸鹽緩沖液，加入1化溶度為Img/mL的 Dnase水溶液后縱滿振蕩，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解細(xì)胞，振蕩30 S混勻后靜置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液進(jìn)行中和;混勻后置于11000 g離屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即為CPC乙酷化酶粗液； 步驟Ξ、7-ACA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作： 用0.1 mol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液配制終濃度為1.5 mg/mL的7-ACA，用1 mol/L的NaOH 調(diào)抑至8.0,分別取0、1、2、4、6、8、12、16、20化的7-4〔4于離屯、管中，再用0.111101/1、抑8.0 的憐酸緩沖液補(bǔ)足到20 yL，向管中加入20 μL 13°C預(yù)熱3 min的CPC，混勻，13°C水浴10 min后加入5倍體積的終止液，混勻后12000 rpm離屯、3 min,取200化的上清與40化的顯色 劑顯色，室溫靜置10 min后取200化測(cè)405皿的吸光值，W0號(hào)為空白對(duì)照，W7-ACA的含量 為縱坐標(biāo)、0D405為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，并求出回歸方程。
[0016]步驟四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸緩沖液配制20 g/L的CPC底 物，用1 mol/L的化0H調(diào)節(jié)pH至8.0,取20化底物與20化稀釋適當(dāng)倍數(shù)的粗酶液于96孔板 中混勻，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入體積為混合物B體積5倍的終止 液進(jìn)行終止反應(yīng)，12000 rpm離屯、3 min,取200化的上清與40化的顯色劑顯色，室溫反應(yīng) 10 min后取200化利用96孔板在酶標(biāo)儀上快速測(cè)定405 nm的吸光值，進(jìn)而用EXC化計(jì)算出 各個(gè)突變體在低溫下的酶活，從突變文庫(kù)中成功篩選到了兩個(gè)在13°C下催化活性明顯高于 原酶的突變體P-166和P-835,同時(shí)也篩選到了一個(gè)沒(méi)有活性的突變體P-254。利用改進(jìn)的酶 活檢測(cè)方法對(duì)P-166、P-254和P-835的活性重復(fù)測(cè)定了 6次，結(jié)果顯示6次測(cè)定的結(jié)果重復(fù)性 較好，每組試驗(yàn)的誤差均小于0.5%。
[0017]步驟五、將化 21/pET32a、化 21/pET32a-服 6、P-166、P-254及 P-835 的產(chǎn)物一并進(jìn)行 SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示。圖2顯示，重組子化21/pET3^i和未經(jīng)誘導(dǎo)的化21/pET32a- HG6未出現(xiàn)目的條帶；而經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)的化21/pET32a-HG6、P-166和P-835的產(chǎn)物均有可溶性表 達(dá)，且形成了明顯的大小亞基，Quantity One軟件估算出大亞基的表觀分子量為60 kDa，小 亞基的表觀分子量為40 kDa，同時(shí)還有部分表觀分子量為100 W)a的前體;而P-254的產(chǎn)物 只有表觀分子量為100 kDa的前體，運(yùn)也進(jìn)一步說(shuō)明了酶活測(cè)定方法的準(zhǔn)確性。
[001引所述終止液，由質(zhì)量百分比濃度為20%的乙酸水溶液與0.05 mol/L的NaOH水溶液 按體積比2:1的比例混勻； 所述顯色劑，用甲醇配制的質(zhì)量百分比濃度為0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[0019] 實(shí)施例2 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法，包括如下步驟： 步驟一、CPC乙酷化酶的高通量表達(dá):從抱菌素 C乙酷化酶飽和突變的突變文庫(kù)中挑選 單菌落的突變子接種至裝有含有濃度為100 yg/mL氨節(jié)青霉素的200化LB培養(yǎng)基的無(wú)菌 聚苯乙締板中，置于37°C下、200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜;將過(guò)夜培養(yǎng)的產(chǎn)物用移液器接種到300 μL 的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為300化的LB液體培養(yǎng)基體積的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培養(yǎng)2.5 h，最后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200巧m培養(yǎng)8 h，得 到誘導(dǎo)后的菌液，備用； 步驟二、菌體的堿裂解:將步驟一所得誘導(dǎo)后的菌液置于8000 g離屯、1 min,去上清后， 將菌體重懸于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸鹽緩沖液，加入1化溶度為Img/mL的 Dnase水溶液后縱滿振蕩，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解細(xì)胞，振蕩30 S混勻后靜置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液進(jìn)行中和;混勻后置于11000 g離屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即為CPC乙酷化酶粗液； 步驟S、7-ACA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用0.1 mol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液配制終濃度為 1.5 mg/血的7-ACA，用1 mo 1/L的化0H水溶液調(diào)抑值至8.0，分別取0、1、2、4、6、8、12、16和20 化的7-ACA于離屯、管中，再用0.1mol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液補(bǔ)足到20化，向離屯、管中加入 20 μL 13°C預(yù)熱3 min的CPC乙酷化酶，混勻，得到混合物A，將混合物A置于13°C水浴10 min 后，加入體積為混合物A體積5倍的終止液，混勻后12000巧m離屯、3 min,取200 yL的上清與 40化的顯色劑顯色，室溫靜置10 min后取200化測(cè)405皿的吸光值，W0號(hào)為空白對(duì)照，W 7-ACA的含量為縱坐標(biāo)、405 nm的吸光值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程； 步驟四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸緩沖液配制20 g/L的頭抱菌素 C 作為底物，用1 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)抑至8.0,取20化底物與20化稀釋后的CPC乙酷化 酶粗液于96孔板中混勻，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入體積為混合物B 體積5倍的終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，12000 rpm離屯、3 min,取200化的上清與40化的顯色劑 顯色，室溫反應(yīng)10 min后取200化利用96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)405 nm的吸光值； 步驟五、CPC乙酷化酶活性的計(jì)算在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定義為一個(gè)酶活單位(IU);進(jìn)而用EXCEL計(jì)算出各個(gè)突變體在低溫下的酶活； 所述終止液，由質(zhì)量百分比濃度為20%的乙酸水溶液與0.05 mol/L的化0H水溶液按體 積比2:1的比例混勻； 所述顯色劑，用甲醇配制的質(zhì)量百分比濃度為0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[0020] 所述移液器為16通道的移液器。
[0021] 所述聚苯乙締板為96孔透明聚苯乙締微孔板。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酰化酶高通量篩選的方法，其特征在于：基于對(duì)二甲 氨基苯甲醛與7-ACA的復(fù)合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用無(wú)菌的96孔板對(duì)重組菌進(jìn) 行低溫低濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，以稀堿溶液進(jìn)行菌體裂解后利用磷酸二氫鈉中和，然后再 以96孔板進(jìn)行底物的水解，經(jīng)二甲氨基苯甲醛顯色后利用酶標(biāo)儀進(jìn)行產(chǎn)物的快速定量，進(jìn) 而實(shí)現(xiàn)CPC乙酰化酶突變體的高通量篩選。2. 權(quán)利要求1所述的基于DAB顯色的低溫CPC乙?；父咄亢Y選的方法，其特征在于： 包括以下步驟： 步驟一、CPC乙?；傅母咄勘磉_(dá):從孢菌素 C乙?；革柡屯蛔兊耐蛔兾膸?kù)中挑選 單菌落的突變子接種至裝有含有濃度為100 yg/mL氨芐青霉素的200 yL LB培養(yǎng)基的無(wú)菌 聚苯乙烯板中，置于37°C下、200 rpm培養(yǎng)過(guò)夜;將過(guò)夜培養(yǎng)的產(chǎn)物用移液器接種到300 yL 的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為300 yL的LB液體培養(yǎng)基體積的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培養(yǎng)2.5 h，最后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200 rpm培養(yǎng)8 h，得 到誘導(dǎo)后的菌液，備用； 步驟二、菌體的堿裂解:將步驟一所得誘導(dǎo)后的菌液置于8000 g離心1 min，去上清后， 將菌體重懸于300以1^的100 111111〇1/1、？!18.0的磷酸鹽緩沖液，加入1以1^溶度為111^/1^的 Dnase水溶液后漩渦振蕩，加入50 yL lmol/L的NaOH水溶液裂解細(xì)胞，振蕩30 s混勻后靜置 2 min，然后加入50 yL lmol/L KH2PO4水溶液進(jìn)行中和;混勾后置于11000 g離心10 min，收 集上清液，收集到的上清液即為CPC乙酰化酶粗液； 步驟三、7-ACA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用0.1 mol/L、pH8.0的磷酸緩沖液配制終濃度為 1.5 mg/mL的7-ACA，用 1 mol/L的NaOH調(diào)pH值至8.0,分別取0、1、2、4、6、8、12、16和20以1^勺 7-ACA于離心管中，再用0. lmol/L、pH8.0的磷酸緩沖液補(bǔ)足到20 yL，向離心管中加入20 yL 13°C預(yù)熱3 min的CPC乙?；福靹?，得到混合物A，將混合物A置于13°C水浴10 min后，加 入體積為混合物A體積5倍的終止液，混勻后12000 rpm離心3 min，取200 yL的上清與40 yL 的顯色劑顯色，室溫靜置10 min后取200 yU則405 nm的吸光值，以0號(hào)為空白對(duì)照，以7-ACA 的含量為縱坐標(biāo)、40 5 nm的吸光值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程； 步驟四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制20 g/L的頭孢菌素 C 作為底物，用1 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)pH至8.0,取20 yL底物與20 yL稀釋后的CPC乙?；?酶粗液于96孔板中混勻，13°C孵育10 min，得到混合物B;向混合物B中加入體積為混合物B 體積5倍的終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，12000 rpm離心3 min，取200 yL的上清與40 yL的顯色劑 顯色，室溫反應(yīng)10 min后取200 yL，利用96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)405 nm的吸光值； 步驟五、CPC乙?；富钚缘挠?jì)算：以在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定義為一個(gè)酶活單位;進(jìn)而計(jì)算出各個(gè)突變體在低溫下的酶活； 所述終止液，由質(zhì)量百分比濃度為20%的乙酸水溶液與0.05 mol/L的NaOH水溶液按體 積比2:1的比例混勻； 所述顯色劑，用甲醇配制的質(zhì)量百分比濃度為0.5%的二甲氨基苯甲醛。3. 如權(quán)利要求2所述的基于DAB顯色的低溫CPC乙?；父咄亢Y選的方法，其特征在 于:所述聚苯乙稀板為Nunc TM 96 DeepWellTM聚苯乙稀板。4. 如權(quán)利要求2所述的基于DAB顯色的低溫CPC乙?；父咄亢Y選的方法，其特征在 于:所述移液器為8通道的移液器。
【專利摘要】一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酰化酶高通量篩選的方法，該方法基于對(duì)二甲氨基苯甲醛與7-ACA的復(fù)合物在405nm有最大吸收峰的原理，采用無(wú)菌的96孔板對(duì)重組菌進(jìn)行低溫低濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，以稀堿溶液進(jìn)行菌體裂解后利用磷酸二氫鈉中和，然后再以96孔板進(jìn)行底物的水解，經(jīng)p-DAB顯色后利用酶標(biāo)儀進(jìn)行產(chǎn)物的快速定量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CPC乙?；竿蛔凅w的高通量篩選。該方法具有篩選快速、操作簡(jiǎn)便、篩選通量大及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠加快CPC乙?；父脑斓乃俣?，有巨大的應(yīng)用潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【IPC分類】C12Q1/32
【公開(kāi)號(hào)】CN105543332
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610002076
【發(fā)明人】唐存多, 史紅玲, 闞云超, 姚倫廣, 唐青海, 焦鑄錦, 史鴻飛, 周軍事, 馬晨露
【申請(qǐng)人】南陽(yáng)師范學(xué)院
【公開(kāi)日】2016年5月4日
【申請(qǐng)日】2016年1月6日