一種基于dab顯色的cpc乙酰化酶高通量篩選的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶 (即頭抱菌素 C乙酷化酶)高通量篩選的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 所述7-ACA的化學(xué)名稱為3-乙酷氧甲基-5-硫-7-氨基-8-氧-1-氮雜二環(huán)辛-2-締- 2簇酸，是玉米漿通過頭抱菌發(fā)酵得到的頭抱菌素 C，頭抱菌素 C在酷胺鍵處水解得到7-AcA， 其結(jié)構(gòu)如右：
d7-ACA是合成頭抱類抗生素的重要中間體，其 傳統(tǒng)的制備途徑是將頭抱菌素 C(C邱halosporin C，CPC)通過化學(xué)方法的脫乙酷化處理而 成，化學(xué)法需要苛刻的反應(yīng)條件，并且會(huì)產(chǎn)生一些有毒的物質(zhì)。與傳統(tǒng)的化學(xué)方法相比，新 型的生物催化法具有安全性高、環(huán)境友好、選擇性強(qiáng)及設(shè)備投入低等優(yōu)勢(shì)。生物催化法常見 的主要有兩步酶法和一步酶法。兩步酶法所使用的關(guān)鍵酶是D-氨基酸氧化酶和戊二酷-7- 氨基頭抱燒酸乙酷化酶，CPC在兩個(gè)酶的先后作用下可W轉(zhuǎn)化成7-ACA。經(jīng)過多年的發(fā)展，兩 步酶法的工藝已經(jīng)日趨成熟，并在工業(yè)生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用，但是兩步酶法副產(chǎn)物多、酶 的制備及生產(chǎn)工藝相對(duì)復(fù)雜的缺陷依然存在。一步酶法是CPC在頭抱菌素 C(即CPC乙酷化 酶）的作用下可W直接轉(zhuǎn)化成7-ACA，運(yùn)種途徑更能簡(jiǎn)化生產(chǎn)工藝、降低生產(chǎn)成本，在工業(yè)生 產(chǎn)中更具吸引力。由于7-ACA在20°CW上極不穩(wěn)定、易產(chǎn)生其它副產(chǎn)物，為了獲得高質(zhì)量的 7-ACA，它的合成往往需要在低溫環(huán)境下進(jìn)行，工業(yè)上7-ACA的生產(chǎn)一般控制在13°C左右。而 現(xiàn)有的CPC乙酷化酶最適溫度較高、在低溫環(huán)境下催化活性較低，低溫環(huán)境下必須得提高加 酶量，增加了生產(chǎn)成本。目前，國(guó)內(nèi)外均還沒有成功開發(fā)出最適溫度低于20°C的低溫CPC乙 酷化酶的研究報(bào)道。
[0003] 目前，由于對(duì)酶適冷機(jī)制的認(rèn)識(shí)尚缺乏統(tǒng)一的定論，創(chuàng)制低溫酶常用的方法仍W 定向進(jìn)化或點(diǎn)飽和突變技術(shù)為主。目前，常用的CPC乙酷化酶活性的測(cè)定方法主要有堿滴定 法、P-DAB比色法和HPLC法，其中堿滴定法主要是用在工業(yè)生產(chǎn)中簡(jiǎn)單、粗糖、快速地評(píng)估頭 抱菌素 C乙酷化酶的活性。HPLC法能夠非常準(zhǔn)確地測(cè)定7-ACA的量進(jìn)而準(zhǔn)確地計(jì)算出頭抱菌 素 C乙酷化酶的活性，但受儀器所限，測(cè)定速度較慢而且很難實(shí)現(xiàn)高通量的測(cè)定。傳統(tǒng)的P- DAB比色法，由于前人所述的終止液對(duì)反應(yīng)的終止效果有限，也不太適合高通量的測(cè)定。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明目的是為解決上述技術(shù)問題的不足，提供一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷 化酶高通量篩選的方法，其可快速、準(zhǔn)確從海量的突變文庫(kù)中獲得低溫CPC乙酷化酶。
[000引本發(fā)明為解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種基于DAB顯色的低溫CPC乙 酷化酶高通量篩選的方法，該方法基于對(duì)二甲氨基苯甲醒 （P- dimethylaminobenzaldehyde, p-DAB)與7-ACA的復(fù)合物在405nm有最大吸收峰的原理，采 用無菌的96孔板對(duì)重組菌進(jìn)行低溫低濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，W稀堿溶液進(jìn)行菌體裂解后利 用憐酸二氨鋼中和，然后再W96孔板進(jìn)行底物的水解，經(jīng)P-DAB顯色后利用酶標(biāo)儀進(jìn)行產(chǎn)物 的快速定量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CPC乙酷化酶突變體的高通量篩選。
[0006] 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法，更具體的操作方法，優(yōu) 選為W下方案;包括如下步驟： 步驟一、CPC乙酷化酶的高通量表達(dá):從抱菌素 C乙酷化酶飽和突變的突變文庫(kù)中挑選 單菌落的突變子接種至裝有含有濃度為100 yg/mL氨節(jié)青霉素的200化LB培養(yǎng)基的無菌 聚苯乙締板中，置于37°C下、200 rpm培養(yǎng)過夜;將過夜培養(yǎng)的產(chǎn)物用移液器接種到300 μL 的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為300化的LB液體培養(yǎng)基體積的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培養(yǎng)2.5 h，最后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200巧m培養(yǎng)8 h，得 到誘導(dǎo)后的菌液，備用； 步驟二、菌體的堿裂解:將步驟一所得誘導(dǎo)后的菌液置于8000 g離屯、1 min,去上清后， 將菌體重懸于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸鹽緩沖液，加入1化溶度為Img/mL的 Dnase水溶液后縱滿振蕩，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解細(xì)胞，振蕩30 S混勻后靜置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液進(jìn)行中和;混勻后置于11000 g離屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即為CPC乙酷化酶粗液； 步驟S、7-ACA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用0.1 mol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液配制終濃度為 1.5 mg/血的7-ACA，用1 mol/L的化0H調(diào)抑值至8.0,分別取0、1、2、4、6、8、12、16和20化的 7-ACA于離屯、管中，再用0. lmol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液補(bǔ)足到20 yL，向離屯、管中加入20 μL 13°C預(yù)熱3 min的CPC乙酷化酶，混勻，得到混合物A，將混合物A置于13°C水浴10 min后，加 入體積為混合物A體積5倍的終止液，混勻后12000巧m離屯、3 min,取200 yL的上清與40 μL 的顯色劑顯色，室溫靜置10 min后取200化測(cè)405 nm的吸光值，W〇號(hào)為空白對(duì)照，W7-ACA 的含量為縱坐標(biāo)、405 nm的吸光值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程； 步驟四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸緩沖液配制20 g/L的頭抱菌素 C 作為底物，用1 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)抑至8.0,取20化底物與20化稀釋后的CPC乙酷化 酶粗液于96孔板中混勻，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入體積為混合物B 體積5倍的終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，取200化的上清與40化的顯色劑顯色，室溫反應(yīng)10 min 后取200化利用96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)405 nm的吸光值； 步驟五、CPC乙酷化酶活性的計(jì)算在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定義為一個(gè)酶活單位(IU);進(jìn)而用EXCEL計(jì)算出各個(gè)突變體在低溫下的酶活； 所述終止液，由質(zhì)量百分比濃度為20%的乙酸水溶液與0.05 mol/L的化0H水溶液按體 積比2:1的比例混勻； 所述顯色劑，用甲醇配制的質(zhì)量百分比濃度為0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[0007] 所述聚苯乙締板優(yōu)選為伽11(3"96〇669胖611"聚苯乙締板。
[0008] 所述移液器優(yōu)選為8通道的移液器。
[0009] 有益效果是： 本發(fā)明基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法對(duì)傳統(tǒng)的P-DAB比色法做了 的改進(jìn)，利于后續(xù)高通量的測(cè)定。利用傳統(tǒng)的表達(dá)及篩選策略從海量的突變文庫(kù)中篩選目 標(biāo)低溫酶注定是一項(xiàng)費(fèi)時(shí)費(fèi)力的工作，傳統(tǒng)的CPC乙酷化酶表達(dá)及活性測(cè)定的方法也不能 滿足快速篩選的需求。因此，建立快速、準(zhǔn)確的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法是從海 量的突變文庫(kù)中獲得低溫酶的重要保障，具有十分重要的意義;該方法具有篩選快速、操作 簡(jiǎn)便、篩選通量大及準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)，能夠加快CPC乙酷化酶改造的速度，有巨大的應(yīng)用潛 力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【附圖說明】
[0010] 圖1是本發(fā)明中7-ACA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖2是本發(fā)明中CPC乙酷化酶及其突變體的SDS-PAGE分析圖； 圖中標(biāo)記是：1、BL21/陽T32a，2、BL21/陽T32a-HG6 (0 mmol/L IPTG)，3、BL21/陽了32曰- 服6,4、P-254,5、P-166,6、P-835。
【具體實(shí)施方式】
[0011] 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法，該方法基于對(duì)二甲氨基 苯甲醒（p-dimeth}daminobenzaldehyde, p-DAB)與7-ACA的復(fù)合物在405nm有最大吸收峰 的原理，采用無菌的96孔板對(duì)重組菌進(jìn)行低溫低濃度誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)，W稀堿溶液進(jìn)行菌 體裂解后利用憐酸二氨鋼中和，然后再W96孔板進(jìn)行底物的水解，經(jīng)P-DAB顯色后利用酶標(biāo) 儀進(jìn)行產(chǎn)物的快速定量，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)CPC乙酷化酶突變體的高通量篩選。
[0012] 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法，更具體的操作方法，優(yōu) 選為W下方案;包括如下步驟： 步驟一、CPC乙酷化酶的高通量表達(dá):從抱菌素 C乙酷化酶飽和突變的突變文庫(kù)中挑選 單菌落的突變子接種至裝有含有濃度為100 yg/mL氨節(jié)青霉素的200化LB培養(yǎng)基的無菌 聚苯乙締板中，置于37°C下、200 rpm培養(yǎng)過夜;將過夜培養(yǎng)的產(chǎn)物用移液器接種到300 μL 的LB液體培養(yǎng)基中，接種量為300化的LB液體培養(yǎng)基體積的4%;然后，置于37°C下、200 rpm 培養(yǎng)2.5 h，最后加入終濃度為0.1 mmol/L的IPTG水溶液，置于30°C下、200巧m培養(yǎng)8 h，得 到誘導(dǎo)后的菌液，備用； 步驟二、菌體的堿裂解:將步驟一所得誘導(dǎo)后的菌液置于8000 g離屯、1 min,去上清后， 將菌體重懸于300化的100 mmol/L、pH8.0的憐酸鹽緩沖液，加入1化溶度為Img/mL的 Dnase水溶液后縱滿振蕩，加入50化Imol/L的化0H水溶液裂解細(xì)胞，振蕩30 S混勻后靜置 2 min,然后加入50 μL Imol/L K出P化水溶液進(jìn)行中和;混勻后置于11000 g離屯、10 min,收 集上清液，收集到的上清液即為CPC乙酷化酶粗液； 步驟S、7-ACA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：用0.1 mol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液配制終濃度為 1.5 mg/血的7-ACA，用1 mol/L的化0H調(diào)抑值至8.0,分別取0、1、2、4、6、8、12、16和20化的 7-ACA于離屯、管中，再用0. lmol/L、p冊(cè).0的憐酸緩沖液補(bǔ)足到20 yL，向離屯、管中加入20 μL 13°C預(yù)熱3 min的CPC乙酷化酶，混勻，得到混合物A，將混合物A置于13°C水浴10 min后，加 入體積為混合物A體積5倍的終止液，混勻后12000巧m離屯、3 min,取200 yL的上清與40 μL 的顯色劑顯色，室溫靜置10 min后取200化測(cè)405 nm的吸光值，W〇號(hào)為空白對(duì)照，W7-ACA 的含量為縱坐標(biāo)、405 nm的吸光值為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出回歸方程； 步驟四、7-ACA高通量的快速定量:用0.1 mol/L的憐酸緩沖液配制20 g/L的頭抱菌素 C 作為底物，用1 mol/L的NaOH水溶液調(diào)節(jié)抑至8.0,取20化底物與20化稀釋后的CPC乙酷化 酶粗液于96孔板中混勻，13°C解育10 min,得到混合物B;向混合物B中加入體積為混合物B 體積5倍的終止液進(jìn)行終止反應(yīng)，取200化的上清與40化的顯色劑顯色，室溫反應(yīng)10 min 后取200化利用96孔板在酶標(biāo)儀上測(cè)405 nm的吸光值； 步驟五、CPC乙酷化酶活性的計(jì)算在測(cè)定條件下每分鐘產(chǎn)生1 μπιο? 7-ACA所需的酶 量定義為一個(gè)酶活單位(IU);進(jìn)而用EXCEL計(jì)算出各個(gè)突變體在低溫下的酶活； 所述終止液，由質(zhì)量百分比濃度為20%的乙酸水溶液與0.05 mol/L的化0H水溶液按體 積比2:1的比例混勻； 所述顯色劑，用甲醇配制的質(zhì)量百分比濃度為0.5%的二甲氨基苯甲醒。
[001引所述聚苯乙締板優(yōu)選為Nunc? 96 De邱Well?聚苯乙締板。
[0014]所述移液器優(yōu)選為8通道的移液器。
[001引實(shí)施例1 一種基于DAB顯色的低溫CPC乙酷化酶高通量篩選的方法，包括如下步驟： 步驟一、CPC乙酷化酶的高通量表達(dá):從突變文庫(kù)中分別用移液器挑取P-^P-1000 號(hào)單 菌落的突變子W及原酶菌株化21/pET32a-HG6接種至裝有200化LB(100 yg/mL的氨節(jié)青 霉素)培養(yǎng)基的無菌伽11(3"9606邱胖6