中的 含量；
[0036] 圖2顯示利用QPCR檢測miR-4753-化在正常人和骨肉瘤患者血液中的含量。
【具體實施方式】
[0037] 下面通過實施例對本發(fā)明進行具體的描述，有必要在此指出的是W下實施例只用 于對本發(fā)明進行進一步說明，不能理解為對本發(fā)明保護范圍的限制，該領(lǐng)域的技術(shù)人員可 W根據(jù)上述本
【發(fā)明內(nèi)容】
對本發(fā)明作出一些非本質(zhì)的改進和調(diào)整。下述實施例中，若非特意 表明，所用的試劑均為分析純，所用試劑均可從商業(yè)渠道獲得。文中未注明具體條件的實驗 方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等編著的科學出版社2002年出版的《分子克隆實 驗指南》一書中所述的條件，或按照制造商所建議的條件。除非另行定義，文中所使用的所 有專業(yè)與科學用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或 均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明中。
[0038] 實施例1高通量測序篩選與骨肉瘤相關(guān)的miRNA
[0039] 1、樣本收集
[0040] 6例原發(fā)性骨肉瘤患者及6名正常人。受試者要求空腹至少12h，于次日清晨7:00~ 8 :00室溫下，抽取10ml靜脈血于乙二胺四乙酸化DTA)抗凝管，提取外周血單個核細胞 PBMCs，加入1ml Trizol試劑（Invitrogen公司），充分混勻，-80°C保存標本，W用于RNA提 取。所有的血樣和病理結(jié)果應(yīng)真實可靠，研究經(jīng)倫理委員會批準，患者知情同意。
[0041 ] 2、血液單核細胞RNA提取
[0042]將步驟（1)中的細胞融化，加入約1/5體積的氯仿，上下顛倒充分混勻1分鐘左右， 室溫下靜置5分鐘。4°C，12,0(K)rpm離屯、15分鐘后小屯、轉(zhuǎn)移上清液入新的1.5ml離屯、管，加入 等體積的異丙醇，輕輕顛倒混勻，室溫靜置10分鐘。4°C，12000rpm離屯、10分鐘后，去上清，向 沉淀中加入2/5體積的70%乙醇，4°C，12000rpm離屯、洗涂沉淀5分鐘。去上清，將沉淀室溫驚 干后加入適量無 RNA酶的水充分溶解，測定0D260和0D280值。采用無 RNA酶的DNA酶I處理， QIAGEN RNeasy試劑盒純化總RNA，詳細操作原理和方法見試劑盒說明書。
[00創(chuàng) 3、RNA樣品的純度分析
[0044] NanoDroplOOO分光光度計檢測RNA樣品，樣品純度要求:00260/280^1.8。
[0045] 4、RNA樣品的質(zhì)量分析(Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer)
[0046] Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和 18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達到要求的符合RNA-seq測序cDNA文 庫構(gòu)建的要求，可W用于文庫構(gòu)建及測序。28S/18S含1; RNA完整性:RIN值含7.0。
[0047] 5、sRNA文庫構(gòu)建
[004引實驗采用Illumina TruSeq Small RNA試劑盒構(gòu)建文庫，在總RNA中回收長度18-30nt RNA，通過RT-PCR逆轉(zhuǎn)錄成單鍵cDNA，cDNA擴增后，回收cDNA產(chǎn)物，建成小RNAs文庫。 [0049] 6、測序
[(K)加]運用llumina Hiseq2500/Miseq第二代高通量測序技術(shù)對miRNA進行測序，通過去 接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)的處理，得到最終數(shù)據(jù)。
[0化1] 7、結(jié)果分析
[0052]通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析軟件對miRNA原始數(shù)據(jù)進行背景校正后進行t-test得到P值， 然后利用Fisher檢驗合并P值，篩選差異表達miRNA。設(shè)定P值<0.01，篩選出miR-4753-3p在 正常人和骨肉瘤患者中存在差異表達，在骨肉瘤患者血液中miR-4753-3p的水平明顯下降 (P<0.05)(圖 1)。
[0化3] 實施例2 QPCR驗證差異表達的miR-4753-3p
[0054] 1、根據(jù)實施例1中高通量測序結(jié)果選擇miR-4753-3p進行大樣本QPCR驗證。按照實 施例1中的樣本收集方式選擇正常人和骨肉瘤患者各40例，進行血液單核細胞的分離與保 存。
[0化5] 2、RNA提取過程同實施例1。
[0056] 3、逆轉(zhuǎn)錄：將lOpg-lyg的總RNA模板與化1 10*緩沖液、2μ1 dATP(l〇mM)、0.扣1 polyA多聚酶、0.5μ1核糖核酸酶(RNase)抑制劑和無核糖核酸酶水(RNase打ee water)混 合，體積最后為20yl，37°C解育化。然后反應(yīng)管中加入化1 0.扣g/μL Oligo(dT)特異性RT引 物，70°C解育5min后立刻冰上解育至少2min，打斷RNA和引物的二級結(jié)構(gòu)。最后，將上述20μ1 反應(yīng)混合物與4μ1 5*緩沖液、1μ1 dNTP(l〇mM)，0.化1 M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，0.5μ1核糖核酸酶 (RNase)抑制劑，1化1 polyA反應(yīng)混合液和4μ1無核糖核酸酶水(RNase打ee water)混合， 42°C解育化。
[0057] 4、QPCR反應(yīng):采用25μ1反應(yīng)體系，每個樣本設(shè)置3個平行管，所有擴增反應(yīng)均重復 Ξ次W上W保證結(jié)果的可靠性。配制W下反應(yīng)體系：SYBR Green聚合酶鏈式反應(yīng)體系12.5μ 1，正向引物（5μΜ/μ1 ΗμL，反向引物（5μΜ/μ1 ΗμL，模板cDNA2.0μ1，無酶水8 .化1。各項操作 均于冰上進行。擴增程序為:95°(310111111，（95°(3153,60°〇553)*45個循環(huán)。^5￥81?0'日日11作為 巧光標記物，在Li曲t切cler巧光實時定量PCR儀上進行PCR反應(yīng)。擴增miR-4753-化的正向 引物序列為：5 '-TTCTCTTTCTTTAGCCTTGTGT-3'（SEQ ID NO. 1)，反向引物為通用反向引物 (購自北京曠博生物技術(shù)有限公司KWsnRNA U6作為參照基因，其上游引物序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 '（沈Q ID NO. 2);下游引物序列為：5 ' -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3 ' (SEQ ID N0.3)。通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，Δ ACT法進行相對定量。
[005引日、結(jié)果
[0化9] 如圖2所示，與正常人相比，骨肉瘤患者血液中miR-4753-化的表達水平顯著下降， 與高通量測序結(jié)果一致(P<〇. 05)。
[0060]上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可W對本發(fā)明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 微小RNA在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用，其特征在于，所述微小RNA選自以下組:初 始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟miRNA;前體 miRNA能在人細胞內(nèi)被剪切并表達成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-4753-3p。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述微小RNA是成熟miR-4753-3p。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷工具包括檢測樣本中權(quán)利要求1 所述的微小RNA表達水平的試劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述樣本的來源包括血液、尿液、淚液、唾 液、組織液、腦脊液、汗液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，所述診斷工具包括試劑盒、芯 片、試紙、或高通量測序平臺。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述試劑盒包括針對權(quán)利要求1所述的微 小RNA的引物和/或探針;所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核苷酸 探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于權(quán)利要求1所述的微小RNA的部分或全部序 列;所述試紙包括針對權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針;所述高通量測序平臺包 括針對權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針。7. -種骨肉瘤的診斷工具，其特征在于，所述診斷工具包括檢測樣本中權(quán)利要求1所述 的微小RNA表達水平的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷工具，其特征在于，所述樣本的來源包括血液、尿液、淚 液、唾液、組織液、腦脊液、汗液。9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的診斷工具，其特征在于，所述診斷工具包括試劑盒、芯片、試 紙、或高通量測序平臺。10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的診斷工具，其特征在于，所述試劑盒包括針對權(quán)利要求1所述 的微小RNA的引物和/或探針;所述芯片包括固相載體，以及固定在所述固相載體上的寡核 苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括特異性地對應(yīng)于權(quán)利要求1所述的微小RNA的部分或全部 序列;所述試紙包括針對權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針;所述高通量測序平臺 包括針對權(quán)利要求1所述的微小RNA的引物和/或探針。
【專利摘要】本發(fā)明公開了miR-4753-3p作為骨肉瘤診斷標志物的用途。本發(fā)明通過高通量測序和QPCR實驗證明miR-4753-3p在骨肉瘤患者血液中的含量比正常人的明顯降低，因此認為miR-4753-3p可以作為診斷骨肉瘤的分子標志物。根據(jù)本發(fā)明的上述研究成果，開發(fā)了用于診斷骨肉瘤的診斷產(chǎn)品，該診斷產(chǎn)品在臨床上具有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類】C12Q1/68
【公開號】CN105506156
【申請?zhí)枴緾N201610065893
【發(fā)明人】楊承剛, 任靜
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2016年1月29日