診斷骨肉瘤的分子標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，設(shè)及miR-4753-化在骨肉瘤中的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] miRNA是天然存在于體內(nèi)的21-2化t的非編碼RNA分子，是一類通過轉(zhuǎn)錄后基因沉 默對祀基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)的RNA。據(jù)估計，生物體內(nèi)約有1 /^3的基因受11111?^4的調(diào)控Diiii RNA與 RISC的復(fù)合體通過堿基配對可與祀基因 mRNA5 ' -UTR或者3 ' -UTR中的互補(bǔ)序列相結(jié)合，抑制 蛋白質(zhì)翻譯，或是引發(fā)mRNA降解，從而負(fù)調(diào)控祀基因的表達(dá)。
[0003] 檢測miRNA的表達(dá)水平可W為疾病的臨床診斷提供參考。而miRNA的異常表達(dá)直接 導(dǎo)致一些與疾病發(fā)生相關(guān)基因的表達(dá)異常，誘發(fā)疾病的發(fā)生。已有報道證明miRNA可W通過 調(diào)控祀基因 mRNA的表達(dá)，在疾病發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。在未來臨床治療中， miRNA不僅可W成為新的疾病早期診斷和疾病進(jìn)程相關(guān)的標(biāo)記物，而且也有望通過改變 miRNA的表達(dá)或者其祀基因的表達(dá)治療疾病。尋找和鑒定與疾病發(fā)生相關(guān)的miRNA及其祀基 因為miRNA的臨床治療提供基礎(chǔ)。
[0004] 骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性腫瘤，其主要致病特征為體內(nèi)增殖的腫瘤細(xì)胞直 接形成未成熟骨或骨樣組織。是一種人類骨骼系統(tǒng)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。典型的骨肉 瘤是一種罕見的（占全部惡性腫瘤的0.2%)高致癌惡性腫瘤，其發(fā)病率約每年每一百萬人 里有Ξ例。骨肉瘤主要出現(xiàn)在較長的骨骼W及少部分的軟組織。其主要發(fā)病人群集中在10 ~20歲青少年，具有發(fā)病率高，早期轉(zhuǎn)移率高，治愈生存率低等特點。X-射線，斷層攝影技 術(shù)，核磁共振，血管造影技術(shù)W及動態(tài)骨閃爍攝影技術(shù)等廣泛應(yīng)用于該病的診斷、腫瘤發(fā)生 的程度及手術(shù)類型判斷等等。但是利用上述臨床手段進(jìn)行骨肉瘤的診斷，常常導(dǎo)致患者的 病情延誤，錯過最佳治療時期。因此尋找一種骨肉瘤早期診斷標(biāo)志物是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的之一在于提供一種可用于早期診斷骨肉瘤的微小RNA標(biāo)記物。
[0006] 本發(fā)明的目的之二在于提供上述微小RNA的用途。
[0007] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：
[000引本發(fā)明提供了一種微小RNA在制備骨肉瘤診斷工具中的應(yīng)用，所述微小RNA選自W 下組：初始miRNA、前體miRNA、成熟miRNA;初始miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟 miRNA;前體miRNA能在人細(xì)胞內(nèi)被剪切并表達(dá)成成熟miRNA;所述微小RNA是miR-4753-化。
[0009] 應(yīng)當(dāng)知道，本發(fā)明的微小RNA包括組成型核酸分子的功能等同物，即變體，其顯示 完整微小RNA核酸分子相同的功能，盡管它們通過核巧酸殘基的缺失、置換或者插入而突 變。
[0010] 本領(lǐng)域人員應(yīng)該了解，為了保證微小RNA的穩(wěn)定性，可W在微小RNA的一端或者兩 端增加保護(hù)性堿基，如TT，也可對微小RNA堿基進(jìn)行修飾，但是上述修飾不影響微小RNA的功 能。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知，在不影響miR-4753-3p功能的條件下，對miR-4753-3p進(jìn)行 堿基修飾或者在兩端增加堿基獲得的序列同樣包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0011] 在本發(fā)明的一些具體的實施方式中，所述miR-4753-化是成熟miR-4753-化。
[0012] 雖然在某些【具體實施方式】中所使用的是成熟miRNA，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員可W預(yù) 期，初始miRNA、前體miRNA將可W獲得與成熟miRNA同樣的技術(shù)效果，因為細(xì)胞有能力進(jìn)一 步將初始miRNA、前體miRNA加工為成熟miRNA。
[0013] 本發(fā)明的微小RNA核酸分子可單鏈或雙鏈的形式存在。成熟miRNA主要呈單鏈 形式，而前體miRNA是部分自互補(bǔ)的，W形成雙鏈結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的核酸分子可W是RNA、DNA、 PNA、LNA的形式。
[0014] 進(jìn)一步，上述診斷工具包括但不限于，忍片、試劑盒、試紙、高通量測序平臺。所述 診斷工具包括用于檢測樣本中miR-4753-化的表達(dá)水平的試劑。
[0015] 進(jìn)一步，所述樣本的來源包括但不限于血液、尿液、淚液、唾液、組織液、腦脊液、汗 液。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本的來源是血液。
[0016] 進(jìn)一步，所述試劑盒包括針對miR-4753-化的引物和/或探針;所述忍片包括固相 載體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應(yīng) 于miR-4753-3p的部分或全部序列;所述試紙包括針對miR-4753-3p的引物和/或探針;所述 高通量測序平臺包括針對miR-4753-化的引物和/或探針。
[0017] 本發(fā)明提供了一種骨肉瘤的診斷工具，所述診斷工具包括檢測樣本中miR-4753-化表達(dá)水平的試劑。
[0018] 進(jìn)一步，所述樣本的來源包括但不限于血液、尿液、淚液、唾液、組織液、腦脊液、汗 液。在本發(fā)明的具體實施方案中，所述樣本的來源是血液。
[0019] 進(jìn)一步，所述診斷工具包括試劑盒、忍片、試紙、高通量測序平臺。
[0020] 進(jìn)一步，所述試劑盒包括針對miR-4753-化的引物和/或探針;所述忍片包括固相 載體；W及固定在所述固相載體上的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括特異性地對應(yīng) 于miR-4753-3p的部分或全部序列;所述試紙包括針對miR-4753-3p的引物和/或探針;所述 高通量測序平臺包括針對miR-4753-化的引物和/或探針。
[0021 ]進(jìn)一步，所述試劑盒中的針對miR-4753-化的引物和/或探針還可包括針對現(xiàn)有技 術(shù)中已經(jīng)報道的可用于檢測前面所述的微小RNA表達(dá)水平的引物和/或探針。將多種微小 RNA的檢測引物和/或探針放置在同一試劑盒中通過檢測多種微小RNA指標(biāo)聯(lián)合診斷骨肉瘤 的情況也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0022] 進(jìn)一步，所述忍片上固定的所述寡核巧酸探針還可包括針對現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)報道 的可用于檢測miR-4753-化的表達(dá)水平的寡核巧酸探針。將多種miRNA的檢測探針放置在同 一忍片上通過檢測多種miRNA指標(biāo)聯(lián)合診斷骨肉瘤也包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0023] 進(jìn)一步，所述固相載體包括所述固相載體可采用基因忍片領(lǐng)域的各種常用材料， 例如但不限于尼龍膜，經(jīng)活性基團(tuán)（如醒基、氨基等)修飾的玻片或娃片、未修飾的玻片、塑 料片等。
[0024] 所述的miRNA忍片的制備可采用本領(lǐng)域已知的生物忍片的常規(guī)制造方法，例如，如 果固相載體采用的是修飾玻片或娃片，探針的5'端含有氨基修飾的聚dT串，可將寡核巧酸 探針配制成溶液，然后采用點樣儀將其點在修飾玻片或娃片上，排列成預(yù)定的序列或陣列， 然后通過放置過夜來固定，就可得到本發(fā)明的miRNA忍片。如果核酸不含氨基修飾，則其制 備方法也可參照：王申五主編的《基因診斷技術(shù)-非放射性操作手冊》；J.L.erisi， V.R.Iyer，P.O.BROWN.Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale.Science, 1997;278:680和馬立人，蔣中華主編.生物忍 片.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2000，1-130。
[0025] 本發(fā)明的miR-4753-3p可W是天然的或是人工合成的，或者使用可W表達(dá)miR-4753-化的DM片段的載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞獲得。所述載體包括病毒載體、真核載體。
[0026] 病毒載體可W是任何適當(dāng)?shù)妮d體，包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載體、腺 病毒相關(guān)病毒載體、瘤疹病毒(例如單純瘤疹病毒、痘苗病毒及EB病毒)載體、甲病毒載體。
[0027] 真核表達(dá)載體可W是任何適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體，包括但不限于pCMV-Myc表達(dá)載體、 PCDNA3.0表達(dá)載體、PCDNA3.1表達(dá)載體、pEGFP表達(dá)載體、pEF Bos表達(dá)載體、pTet表達(dá)載體、 pTRE表達(dá)載體、或者在公知表達(dá)載體的基礎(chǔ)上經(jīng)改造的載體，比如pBin438、pCAMBIA1301 等。
[002引可W表達(dá)微小RNA的DNA片段可W通過如下方式獲取:從miRNA數(shù)據(jù)庫中化ttp:// mi crorna. sanger. ac.址/sequences/)尋找微小RNA在基因組上的位置及具體序列信息，根 據(jù)基因組序列確定初始miRNA的位置，在初始miRNA位置的上下游500-800bp區(qū)間內(nèi)設(shè)計特 異性引物，擴(kuò)增引物中間的序列即可獲得表達(dá)微小RNA的DNA片段。
[0029] 本發(fā)明中使用的"微小RNA"與"miRNA"、"miR"通用。
[0030] 本發(fā)明中使用的"診斷骨肉瘤"包括對骨肉瘤的預(yù)判，即判斷受試者是否存在患有 骨肉瘤的風(fēng)險，也包括對骨肉瘤的診斷，即判斷受試者是否已經(jīng)患有骨肉瘤，也包括對骨肉 瘤預(yù)后的判斷，即判斷受試者是否存在復(fù)發(fā)的可能性或者判斷受試者已經(jīng)復(fù)發(fā)。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點和有益效果：
[0032] 本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了 miR-4753-化與骨肉瘤相關(guān)，通過檢測受試者
[0033] miR-4753-化的表達(dá)，可W判斷受試者是否患有骨肉瘤、或者判斷受試者是否存在 患有骨肉瘤的風(fēng)險，從而指導(dǎo)臨床醫(yī)師給受試者提供預(yù)防方案或者治療方案。
[0034] 本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的分子標(biāo)記物-miR-4753-化，相比傳統(tǒng)的檢測手段，微小診 斷更及時、更特異、更靈敏，能夠?qū)崿F(xiàn)骨肉瘤的早期診斷，從而降低骨肉瘤的死亡率。
【附圖說明】
[0035] 圖1顯示利用高通量測序方法檢測miR-4753-3p在正常人和骨肉瘤患者血液