一種高效檢測(cè)水稻抗性基因Pita的特異性引物、分子標(biāo)記及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種高效檢測(cè)水稻抗性基因 Pita關(guān)鍵抗病位點(diǎn)的特異性引物、分子標(biāo) 記及其檢測(cè)方法，屬于水稻遺傳改良與農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 稻攝病是造成水稻嚴(yán)重減產(chǎn)的主要病害之一，每年因稻攝病導(dǎo)致的生產(chǎn)損失約占 總產(chǎn)量的10~15%。目前，發(fā)掘廣譜稻攝病抗性基因，通過(guò)育種培育廣譜持久抗病的水稻品 種是控制稻攝病的主要措施。因此，稻攝病抗性基因的檢測(cè)W及稻攝病抗性水稻種質(zhì)篩選 就顯得尤為重要。
[0003] 抗病基因相關(guān)的分子標(biāo)記在遺傳育種方面具有重要的意義，分子標(biāo)記輔助育種 (marker-assisted selection,MAS)對(duì)于幼苗的篩選和基因型的確定具有簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì) 節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，適合在大樣本中篩選、分析具抗性基因的個(gè)體和品種。
[0004] 水稻對(duì)稻攝病的抗性符合基因?qū)驅(qū)W說(shuō)。目前在基因?qū)驅(qū)W說(shuō)中水稻的抗性 基因 Pi化和稻攝菌的無(wú)毒基因 AVR-Pita是研究得最為詳盡的一對(duì)互作關(guān)系。AVR-Pita編碼 223個(gè)氨基酸的金屬蛋白酶，能與抗性基因 Pi化產(chǎn)物直接作用。Pita是第一個(gè)被克隆的抗性 基因。Pita基因編碼一個(gè)長(zhǎng)度為928氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，該蛋白含核巧酸結(jié)合位點(diǎn) 結(jié)構(gòu)域(NBS)和富亮氨酸結(jié)構(gòu)域(LRD)。
[000引Pi化基因抗病/感病兩種基因型的編碼產(chǎn)物僅有一個(gè)氨基酸的差異，即第918氨基 酸由抗病型的丙氨酸突變?yōu)楦胁⌒偷慕z氨酸，抗病型的Pita基因編碼產(chǎn)物的LRD(包含918 氨基酸位點(diǎn)）能與稻攝病菌無(wú)毒基因 AVR-Pita編碼產(chǎn)物相互作用，引起水稻防衛(wèi)響應(yīng)和細(xì) 胞程序性死亡，從而免受稻攝病菌侵染。而感病型的Pita基因編碼產(chǎn)物則不能與AVR-Pita 編碼產(chǎn)物相互作用，導(dǎo)致感病(B巧an et al.，2000;Jia et al.，2000)。
[0006] Pita 918氨基酸的改變是由于Pita基因 DM序列的6640位點(diǎn)（GenBank No. AF207842)的突變引起的，當(dāng)該位點(diǎn)核巧酸為G時(shí)，所在密碼子編碼丙氨酸，抗??；當(dāng)該位 點(diǎn)為T時(shí)，所在密碼子編碼絲氨酸，感病(Jia et曰1.，2003)。運(yùn)種由DNA堿基的一個(gè)差異所 造成抗/感病差異，為使用PCR引物進(jìn)行帶有抗病位點(diǎn)的品種的篩選提供了有利條件，是分 子標(biāo)記輔助育種的經(jīng)典應(yīng)用。
[0007] Jia等人曾根據(jù)Pita基因 DNA位點(diǎn)的變異W及6640位點(diǎn)與6276位點(diǎn)的連鎖，設(shè)計(jì)了 檢測(cè)6640位點(diǎn)核巧酸變異的特異性引物(YL100/YL102)(Jia et al. ,2002)。但是發(fā)明人也 發(fā)現(xiàn)原設(shè)計(jì)特異性引物識(shí)別具有假陽(yáng)性的現(xiàn)象，也就是說(shuō)有時(shí)候不管6640位點(diǎn)是G還是T， 該引物都能擴(kuò)增出相應(yīng)的DNA片段，運(yùn)就導(dǎo)致該分子標(biāo)記不具有嚴(yán)格的特異性，要進(jìn)一步確 認(rèn)6640位點(diǎn)的狀況還需要通過(guò)DNA測(cè)序的方式進(jìn)行確認(rèn)，顯得耗時(shí)、耗力、昂貴;此外，Jia等 人的引物所基于的兩個(gè)變異位點(diǎn)（6640和6272)在世界范圍內(nèi)其它地區(qū)水稻樣本中連鎖率 很低，導(dǎo)致他們的引物不可用于其它地區(qū)水稻的Pi化抗性基因型檢測(cè)。
[0008] 因此，為了更加準(zhǔn)確和更加廣泛地利用特異性引物檢測(cè)Pita基因關(guān)鍵抗病位點(diǎn) 6640的變異，本發(fā)明擬通過(guò)大規(guī)模實(shí)驗(yàn)篩選和數(shù)據(jù)分析，對(duì)識(shí)別該位點(diǎn)的特異性PCR引物、 實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系和實(shí)驗(yàn)反應(yīng)條件進(jìn)行設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)和優(yōu)選，提供一種快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的檢 測(cè)Pi化基因抗病基因型的專用引物。
[0009] 參考文獻(xiàn)；
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【發(fā)明內(nèi)容】

[001引針對(duì)上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明意在克服現(xiàn)有檢現(xiàn)版術(shù)中出現(xiàn)假陽(yáng)性、耗時(shí)、昂貴從及 不具有廣泛適用性等缺陷。其目的是提供一種快速、準(zhǔn)確、特異性強(qiáng)的檢測(cè)Pita基因抗病基 因型的特異性專用引物、分子標(biāo)記和檢測(cè)方法。
[0016] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題和實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：
[0017] -種高效檢測(cè)水稻抗性基因 Pi化關(guān)鍵抗病位點(diǎn)的特異性引物，所述引物由前引物 (6640巧和后引物(7415R)組成，所述的引物序列：
[0018] 前引物6640F: 5 ' -GTGGCTTCTATCTTTACCTG-3 '
[0019] 后引物7415R: 5 ' -CGAACTCCTTCGCATACTCA-3 '
[0020] -種高效檢測(cè)水稻抗性基因 Pi化抗病基因型的分子標(biāo)記，所述的分子標(biāo)記為根據(jù) 權(quán)利要求1所述的特異性引物在Pita基因序列及其3'端調(diào)控區(qū)擴(kuò)增出來(lái)的核巧酸序列，核 巧酸序列長(zhǎng)度為814bp。
[0021] -種利用分子標(biāo)記檢測(cè)水稻抗性基因 Pi化抗病基因型的方法，包括W下步驟：
[0022] (1)待測(cè)樣品水稻植株基因組DNA提??；
[0023] (2) W步驟(1)中得到的樣品DNA為模板，構(gòu)建專用PCR反應(yīng)體系，利用權(quán)利要求1所 述特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0024] (3)利用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)PCR產(chǎn)物為陽(yáng)性時(shí)，也即能獲 得條帶長(zhǎng)度為814bp的PCR產(chǎn)物，該水稻品種對(duì)稻攝病菌(含AVR-Pita)具有抗性;反之，當(dāng) PCR產(chǎn)物為陰性時(shí)，即不能獲得條帶長(zhǎng)度為814bp的PCR產(chǎn)物，該水稻品種對(duì)稻攝病菌（含 AVR-Pita)具有感病性。
[002引優(yōu)選地，所述的專用PCR反應(yīng)體系為：10XPCR反應(yīng)緩沖液2.祉l;2.5mM dNTP Ι.ομ 1; BSA 1.0μ1;前引物0.祉1;后引物0.祉1; r-taq酶0.2扣1;~20ngAU DM為1.0μ1;加水至 總體積為25μ1。
[0026] 優(yōu)選地，所述的專用PCR反應(yīng)條件為:94°C預(yù)變性3min，94°C變性30sec，53°C~60 °C退火30sec，72°C延伸Imin，共運(yùn)行33個(gè)循環(huán)，72°C后延伸lOmin
[0027] 本發(fā)明的原理：
[0028] 基于不同突變位點(diǎn)的連鎖情況，選擇適合特異性引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)（6640和7415)。 根據(jù)引物3'末端需高度匹配的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)區(qū)分6640位點(diǎn)抗/感病的特異性引物，利用該引物 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作為分子標(biāo)記檢測(cè)水稻Pita基因6640位點(diǎn)抗/感病分布情況。即W水稻樣本 DNA為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若獲得條帶長(zhǎng)度為814bp的PCR產(chǎn)物，則說(shuō)明該水稻品種對(duì)于稻攝 病菌(含AVR-Pita)具有抗性;若未獲得相應(yīng)的PCR產(chǎn)物帶，則說(shuō)明該水稻品種感病。
[0029] 本發(fā)明的有益效果：
[0030] 1.本發(fā)明具有簡(jiǎn)單、快捷、經(jīng)濟(jì)節(jié)約的優(yōu)點(diǎn)，適合在大樣本中篩選、分析具抗性基 因型的個(gè)體和品種。
[0031] 2.本發(fā)明特異性專用引物的特異性強(qiáng)，檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確，正確率可達(dá)100%。
[0032] 3.本發(fā)明利用基于特異性引物的分子標(biāo)記檢測(cè)水稻抗性基因 Pita的關(guān)鍵抗病位 點(diǎn)時(shí)，只需要進(jìn)行一次PCR擴(kuò)增，可提高Pita基因的檢測(cè)效率，適合用于水稻改良分離群體 的分子標(biāo)記輔助育種，提高育種效率，滿足大規(guī)模分子育種的需求。
【附圖說(shuō)明】
[0033] 圖1為鑒定抗病位點(diǎn)的特異性引物應(yīng)用設(shè)計(jì)流程圖；
[0034] 圖2為Pi化基因關(guān)鍵抗病位點(diǎn)區(qū)域DNA序列比對(duì)圖；
[0035] 圖3為特異性引物退火溫度篩選電泳圖；其中第1和18泳道為DNA Marker 2000,第 2,3,6,7，10，11，14，15泳道為？11日抗性位點(diǎn)66406，第4,5,8,9，12，13，16，17泳道為？1化感 病位點(diǎn)6640T，其中圖（A)本發(fā)明利用Pita基因6640與7415位點(diǎn)連鎖設(shè)計(jì)特異性引物，退火 溫度依次為第2-5泳道60°C，第6-9泳道58°C，第10-13泳道55°C，第14-17泳道53°C;圖（B)為 已有發(fā)明引物的退火梯度，退火溫度依次為第2-5泳道64.5°C，第6-9泳道60°C，第10-13泳 道58°(3，第14-17泳道55°(3;
[0036] 圖4為水稻總DNA凝膠電泳檢測(cè)圖；其中第1泳道為空白對(duì)照，第2-11泳道為水稻幼 苗DNA提取檢測(cè)圖，第12泳道為DNA Marker(Trans2K Plus DNA Marker),從上到下的條帶 依次為 5000、3000、2000、1000、750、500、250、1 OObp;
[0037] 圖5為擴(kuò)增水稻Pita抗病基因型電泳檢測(cè)圖，目的是大樣本量驗(yàn)證特異性引物的 可靠性，其中第巧日22泳道為DNA Marker 2000,第2-11泳道為含Pi化感病位點(diǎn)6640T的水稻 樣本，第12-21泳道為含Pi化抗性位點(diǎn)