骨肉瘤的生物標(biāo)記物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一骨肉瘤的生物標(biāo)記物，生物標(biāo)記物為具有序列表SEQ.ID.No.1堿基序列的novel-miR-14。本發(fā)明的生物標(biāo)記物novel-miR-14，其相比現(xiàn)有的其它的骨肉瘤診斷的生理指標(biāo)上，其可以在更早的時(shí)間獲得骨肉瘤病變是否發(fā)生，且其還能根據(jù)novel-miR-14表達(dá)的水平，評估骨肉瘤的惡性程度，具有更好的時(shí)間優(yōu)勢和準(zhǔn)確性。
【專利說明】骨肉瘤的生物標(biāo)記物及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種骨肉瘤的生物標(biāo)記物及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 骨肉瘤是骨惡性腫瘤中最多見的一種，是從間質(zhì)細(xì)胞系發(fā)展而來，腫瘤迅速生長 是由于腫瘤經(jīng)軟骨階段直接或間接形成腫瘤骨樣組織和骨組織。下肢負(fù)重骨在外界因素 (如病毒）的作用下，使細(xì)胞突變，可能與骨肉瘤形成有關(guān)。
[0003] 現(xiàn)有在骨肉瘤影響預(yù)后的因素關(guān)鍵在于早診斷，術(shù)后血清堿性磷酸酶增加的變化 觀察?，F(xiàn)有的診斷均基于早期發(fā)現(xiàn)血液中骨源性堿性磷酸酶增高，與該腫瘤的成骨作用有 關(guān)而進(jìn)行；檢測的手段多采用Gomori鈣鈷法、偶氮偶聯(lián)法、堿性磷酸酶染色試劑盒法，檢測 骨源性堿性磷酸酶的表達(dá)水平。但是，酶的表達(dá)依然存在滯后性，且檢測時(shí)酶的含量會(huì)隨著 組織分離出現(xiàn)變化，而與原始基體中的表達(dá)的含量有差異，而無法最真實(shí)準(zhǔn)確地反應(yīng)骨肉 瘤的情況。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明實(shí)施例的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，提供一種骨肉瘤的生物標(biāo)記 物novel-miR-14及其應(yīng)用。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案如下：
[0006] 一種骨肉瘤的生物標(biāo)記物，所述生物標(biāo)記物為具有序列表SEQ. ID. No. 1堿基序列 的 novel-miR-14〇
[0007] 本發(fā)明的生物標(biāo)記物novel-miR-14,其相比現(xiàn)有的其它的骨肉瘤診斷的生理指標(biāo) 上，其可以在更早的時(shí)間獲得骨肉瘤病變是否發(fā)生，且其還能根據(jù)novel-miR-14表達(dá)的水 平，評估骨肉瘤的惡性程度，具有更好的時(shí)間優(yōu)勢和準(zhǔn)確性。
[0008] 本發(fā)明進(jìn)一步提出一種上述骨肉瘤的生物標(biāo)記物在骨肉瘤檢測中的應(yīng)用。采用本 發(fā)明的上述應(yīng)用基于方法基于novel-miR-14表達(dá)水平進(jìn)行，其表達(dá)含量可以用于骨肉瘤 的診斷分析，通過檢測出于基因的突變和病變伊始，基于novel-miR-14表達(dá)水平的檢測可 以利于骨肉瘤更早的發(fā)現(xiàn)；且檢測的結(jié)果更具準(zhǔn)確性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0009] 下面將結(jié)合附圖及實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，附圖中：
[0010] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例檢測的骨肉瘤組織和正常組織的novel-miR-14表達(dá)水平結(jié) 果對照圖；
[0011] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例檢測的骨肉瘤組織的不同惡性程度中novel-miR-14表達(dá)水 平對照圖。

【具體實(shí)施方式】
[0012] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對 本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并 不用于限定本發(fā)明。
[0013] 本發(fā)明實(shí)施例提供一種用于骨肉瘤診斷的生物標(biāo)記物，其為具有序列表SEQ. ID. No. 1 喊基序列的 novel-miR-14。
[0014] 同時(shí)，基于上述生物標(biāo)記物，本發(fā)明進(jìn)一步還提出一種上述骨肉瘤診斷的生物標(biāo) 記物在骨肉瘤診斷中的應(yīng)用。其具體的應(yīng)用比如可以針對該生物標(biāo)記物作為骨肉瘤的生理 參數(shù)指標(biāo)輔助診斷，具體實(shí)現(xiàn)可以采用如下步驟：
[0015] S10,獲取待測組織標(biāo)樣；
[0016] S20,提取待測標(biāo)樣的RNA ;
[0017] S30,通過RT-PCR檢測待測標(biāo)樣的RNA中的novel-miR-14表達(dá)水平。
[0018] 本發(fā)明的上述方法基于novel-miR-14表達(dá)水平的差異進(jìn)行；其中novel-miR-14 具有序列表SEQ. ID. No. 1喊基序列。
[0019] 在本發(fā)明中，之前先通過生物信息學(xué)分析獲取到了一些候選miRNA與骨肉瘤表達(dá) 的潛在靶基因相關(guān)，同時(shí)進(jìn)一步在對候選miRNA進(jìn)行篩選，篩選過程中以miRNA預(yù)測的基礎(chǔ) 數(shù)據(jù)包括通過小RNA分類注釋后未注釋到任何數(shù)據(jù)庫的但可以比對到基因組的序列、比對 到內(nèi)含子區(qū)域的序列以及比對到外顯子反義鏈的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，然后以下述條件進(jìn)一步進(jìn)行 精確篩選：
[0020] (1)候選的miRNA在基因組上的前體序列可以形成頸環(huán)結(jié)構(gòu)，并且其成熟體序列 位于前體的臂上；
[0021] (2)前體折疊后miRNA/miRNA*復(fù)合體兩端有2nt的懸掛；
[0022] (3)前體臂上無較大的泡，同時(shí)沒有較多的凸起；
[0023] (4)前體折疊后總體的最小自由能應(yīng)不大于-18kcal/mol ;
[0024] (5)預(yù)測到前體的成熟體序列的比對結(jié)果中最小支持?jǐn)?shù)應(yīng)大于等于5。
[0025] 預(yù)測到的新的miRNA表達(dá)譜構(gòu)建，針對預(yù)測到的miRNA其表達(dá)量的計(jì)算是根 據(jù)比對結(jié)果，序列與成熟體序列在兩端不超過3nt的錯(cuò)配，中間需完全匹配，符合這樣 條件的序列的表達(dá)量加和作為該miRNA的表達(dá)量，之后確定骨肉瘤的分子生物標(biāo)記物 novel-miR-14〇
[0026] 上述篩選的條件可以按照設(shè)定華大基因 miRNA Mireap軟件的參數(shù)：
[0027] Minimal miRNA sequence length (18)
[0028] Maximal miRNA sequence length (26)
[0029] Minimal miRNA reference sequence length (20)
[0030] Maximal miRNA reference sequence length (24)
[0031] Minimal depth of Drosha/Dicer cutting site (3)
[0032] Maximal copy number of miRNAs on reference (20)
[0033] Maximal free energy allowed for a miRNA precursor(-18kcal/mol)
[0034] Maximal space between miRNA and miRNA*(35)
[0035] Minimal base pairs of miRNA and miRNA*(14)
[0036] Maximal bulge of miRNA and miRNA*(4)
[0037] Maximal asymmetry of miRNA/miRNA*duplex(5)
[0038] Flank sequence length of miRNA precursor (10)。
[0039] 在篩選之后，選取手術(shù)中切除的新鮮骨肉瘤組織和旁邊配對的正常骨組織，抽提 總RNA，用于高通量測序。高通量測序結(jié)果如下表：
[0040]

【權(quán)利要求】
1. 一種骨肉瘤的生物標(biāo)記物，其特征在于，所述生物標(biāo)記物為具有序列表SEQ. ID. No. 1 喊基序列的 novel-miR-14。
2. 如權(quán)利要求1所述的骨肉瘤的生物標(biāo)記物在骨肉瘤檢測中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/113GK104372007SQ201410699583
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】王大平, 張巨峰 申請人:深圳市第二人民醫(yī)院