鐵和α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)體系和方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本申請(qǐng)屬于生物技術(shù)檢測(cè)領(lǐng)域，具體設(shè)及雙加氧酶活性的通用檢測(cè)方法，更具體 地，設(shè)及所有W α-酬戊二酸和鐵離子作為輔助因子的雙加氧酶（即鐵和α-酬戊二酸依 賴性雙加氧酶）活性的通用檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 雙加氧酶，是使氧分子中的兩個(gè)氧原子全部與底物相結(jié)合的氧化酶的總 稱。鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶[α -0x0glutarate/F'e(II)-dependent dio巧genases( α -0孤s)]屬于廣泛分布于自然界中的非血紅素鐵蛋白，是一種參與多 種氧化還原反應(yīng)的重要酶類，其反應(yīng)底物種類多樣，可W是蛋白質(zhì)，例如脯氨酷徑化酶 (P皿），低氧誘導(dǎo)因子化ypoxia induced factor)和膠原脯氨酷徑化酶（collagen prolyl hy化oxylase)等；也可W是小分子化合物，例如核酸，如A化B、FTO,因而在動(dòng)物、植物和微 生物的初生及次生代謝產(chǎn)物的合成方面起著重要作用。例如，該酶類參與植物激素乙締、赤 霉素和黃酬類化合物等的合成等。最近的研究表明，鐵和α-酬戊二酸依賴性雙加氧酶是 最全能且極其重要的氧化生物催化劑。
[0003] 鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶在反應(yīng)中存在一個(gè)共同的機(jī)制，即亞鐵離子 和α -酬戊二酸作為輔助因子，在反應(yīng)中氧分子的兩個(gè)氧原子，一個(gè)進(jìn)入底物，另一個(gè)參與 α-酬戊二酸脫簇基反應(yīng)生成班巧酸。
[0004] 目前此類酶活性的檢測(cè)一般利用同位素標(biāo)記分析（radioactive assay)、質(zhì)譜、核 磁共振（NMR)和大分子產(chǎn)物對(duì)應(yīng)底物結(jié)構(gòu)與物理特性的改變等等。運(yùn)些檢測(cè)方法繁瑣，不 適用于大通量藥物篩選。此外，現(xiàn)有的檢測(cè)方法僅適用于一種特定的鐵和α-酬戊二酸依 賴性雙加氧酶，不具備通用性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝髓F和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)體系，其包 括：鐵離子、α -酬戊二酸、輔酶Α，ΝΤΡ，班巧酷輔酶A合成酶。
[0006] 在上述酶活檢測(cè)體系中，還包括用于起始酶促反應(yīng)的鐵和酬戊二酸依賴性雙加氧 酶的作用底物，W及用于終止酶促反應(yīng)的鋼酸錠溶液和用于顯色的孔雀綠溶液。
[0007] 在一實(shí)施方案中，所述酶活檢測(cè)體系中的輔酶A，NTP和班巧酷輔酶A合成酶Ξ者 的濃度為過(guò)量，例如，班巧酷輔酶A合成酶的濃度為過(guò)量，而輔酶A和NTP的濃度相同，可為 班巧酷輔酶A合成酶的對(duì)應(yīng)底物Km值的5-10倍W上。在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶活檢測(cè) 體系中的鋼酸錠溶液和孔雀綠溶液均為強(qiáng)酸性的。
[000引另一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝藱z測(cè)鐵和酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活的試劑盒或微 陣列，其包括鐵離子、α-酬戊二酸、輔酶A、NTP、班巧酷輔酶A合成酶。在本申請(qǐng)?zhí)峁┑脑?劑盒或微陣列中，還包括用于起始酶促反應(yīng)的鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的作用底 物和用于終止酶促反應(yīng)的鋼酸錠溶液和用于顯色的孔雀綠溶液。
[0009] 在一實(shí)施方案中，所述試劑盒或微陣列中的輔酶A, ΝΤΡ和班巧酷輔酶A合成酶Ξ 者的濃度為過(guò)量，例如，班巧酷輔酶A合成酶的濃度為過(guò)量，而輔酶A和ΝΤΡ的濃度相同，可 為班巧酷輔酶A合成酶的對(duì)應(yīng)底物Km值的5-10倍W上。
[0010] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，所述酶活檢測(cè)體系中的鋼酸錠溶液和孔雀綠溶液均為強(qiáng)酸性 的。
[0011] 又一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝髓F和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)方法。
[0012] 在一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)方 法包括W下步驟：a)在待測(cè)樣品中，加入α-酬戊二酸依賴性雙加氧酶作用底物、鐵離子、 α -酬戊二酸來(lái)起始反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)I ;b)在步驟a)中的反應(yīng)I終止之后，再加入輔酶Α、ΝΤΡ、 MgClz和班巧酷輔酶A合成酶進(jìn)行反應(yīng)II ;c)加入鋼酸錠溶液來(lái)終止步驟b)中的反應(yīng)II， 最后加入孔雀綠溶液來(lái)顯色，并在620-640nm處讀取吸光度，由此確定鐵和酬戊二酸依賴 性雙加氧酶的酶活。
[0013] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟a)中的反應(yīng)I于100°C下加熱來(lái)終止，加熱時(shí)間為，例如 30分鐘。
[0014] 在優(yōu)選實(shí)施方案中，步驟b)中的反應(yīng)II加入溶解于硫酸的鋼酸錠溶液來(lái)終止。
[0015] 在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明提供的鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè) 方法包括W下步驟：a)在待測(cè)樣品中，加入α-酬戊二酸依賴性雙加氧酶作用底物、鐵離 子、α -酬戊二酸來(lái)起始反應(yīng)進(jìn)行反應(yīng)I，同時(shí)加入輔酶Α、ΝΤΡ、MgClz和班巧酷輔酶A合成 酶進(jìn)行反應(yīng)II ;b)加入鋼酸錠溶液來(lái)終止反應(yīng)，再加入孔雀綠溶液來(lái)顯色，并在620-640nm 處讀取吸光度，由此確定鐵和酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活。此外，本申請(qǐng)還提供了上述 的酶活檢測(cè)體系，上述的試劑盒或微陣列，W及上述的方法在檢測(cè)鐵和α -酬戊二酸依賴 性雙加氧酶的酶活中的應(yīng)用。
[0016] 可見(jiàn)，本申請(qǐng)利用鐵和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶運(yùn)一類酶催化不同反應(yīng)后都 產(chǎn)生班巧酸的特性，通過(guò)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)生的班巧酸的量的方法，來(lái)檢測(cè)鐵和α -酬戊二酸依 賴雙加氧酶的活性。與現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)鐵和α-酬戊二酸雙加氧酶檢測(cè)底物的消耗和首要 產(chǎn)物的產(chǎn)生，W及由此產(chǎn)生需要依賴層析、質(zhì)譜或同位素標(biāo)記等耗時(shí)耗力的方法不同，本申 請(qǐng)所提供的鐵和α-酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)體系和方法僅通過(guò)檢測(cè)副產(chǎn)物 班巧酸的產(chǎn)生來(lái)檢測(cè)酶活，測(cè)量依賴簡(jiǎn)單儀器讀取可見(jiàn)光光吸收，因而省時(shí)省力。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為本申請(qǐng)?zhí)峁┑蔫F和α -酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活檢測(cè)方法的示例性 原理圖。 陽(yáng)01引圖2為本申請(qǐng)實(shí)施例1中編碼班巧酷輔酶A合成酶β，α鏈的sucC和sucD基因 的基因圖譜。
[0019] 圖3為本申請(qǐng)實(shí)施例1中班巧酷輔酶A合成酶的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果圖。
[0020] 圖4為本申請(qǐng)實(shí)施例1中班巧酷輔酶A合成酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化電泳驗(yàn)證結(jié)果圖。
[0021] 圖5為本申請(qǐng)實(shí)施例1中班巧酷輔酶A合成酶的蛋白純化電泳結(jié)果圖。
[0022] 圖6為本申請(qǐng)實(shí)施例1中班巧酷輔酶A合成酶的活性驗(yàn)證，其中1為沒(méi)有班巧酸 (黃色）；2為50 μΜ班巧酸（沒(méi)有酶，黃色）；3為500 μΜ班巧酸（沒(méi)有酶，黃色）；4為 5 μ Μ班巧酷輔酶A合成酶和50 μ Μ班巧酸（淺綠色）；5為0. 5 μ Μ班巧酷輔酶A合成酶和 500 μ Μ班巧酸（綠色）。
[0023] 圖7為本申請(qǐng)實(shí)施例1中制作的憐酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0024] 圖8為本申請(qǐng)實(shí)施例1中不同抑條件下，根據(jù)不同班巧酸濃度（10-100 μ Μ)建立 的班巧酸輔酶A合成酶反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，反應(yīng)時(shí)間為45min。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 提供W下定義和方法用W更好地界定本申請(qǐng)W及在本申請(qǐng)實(shí)踐中指導(dǎo)本領(lǐng)域普 通技術(shù)人員。除非另作說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)按照相關(guān)領(lǐng)域普通技術(shù)人員的常規(guī)用法理解。
[00%] 在本文中所使用的"NTP"，是核巧Ξ憐酸（nucleoside tri地OS地ate)的縮寫(xiě)，指 一種含有Ξ個(gè)憐酸基團(tuán)的核巧酸，包括腺巧Ξ憐酸（ATP)、鳥(niǎo)巧Ξ憐酸（GTP)、胞巧Ξ憐酸 (CTP)、胸腺巧Ξ憐酸燈TP) W及尿巧Ξ憐酸扣T巧等，其經(jīng)水解可生成相應(yīng)的核巧二憐酸 NDP并釋放出無(wú)機(jī)憐酸Pi。在具體實(shí)施方案中所使用的核巧Ξ憐酸種類，取決于所使用的 班巧酸輔酶A合成酶的來(lái)源和種類。
[0027] 在本文中所使用的"強(qiáng)酸性"，是指一種物質(zhì)在溶劑中能向其它物質(zhì)提供質(zhì)子的能 力，25°C下，當(dāng)抑《7時(shí)，溶液呈強(qiáng)酸性。在具體實(shí)施方案中使用硫酸作為溶劑來(lái)獲得強(qiáng)酸 性溶液，例如，通過(guò)將25mM鋼酸錠溶解于3. 4M硫酸來(lái)制備鋼酸錠溶液，通過(guò)將ImM孔雀綠 溶解于6mM硫酸來(lái)制備孔雀綠溶液。
[002引在本文中所使用的"酶活"，定義為單位時(shí)間內(nèi)（Imin)單位質(zhì)量的酶（mg)轉(zhuǎn)化生 成產(chǎn)物的量。就鐵和α-酬戊二酸依賴性雙加氧酶的酶活而言，指單位時(shí)間內(nèi)（Imin)單位 質(zhì)量的雙加氧酶（mg)轉(zhuǎn)化生成班巧酸的量（nmole或pmole)，即nmoles班巧酸· min iflig 待測(cè)雙加氧酶1。
[0029] 在一實(shí)施方案中，本申請(qǐng)所提供的酶活檢測(cè)方法包括W下步驟：