，用酸或 堿調(diào)節(jié)抑至6.5，無菌條件下通過0.22WI1濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0029] 實(shí)施例2 一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液(該憐酸緩沖液 由氯化鋼6g，氯化鐘0.05g，憐酸氨二鋼Ig，憐酸二氨鐘0.05g，氯化巧0.05g，含6個結(jié)晶水的 氯化儀0.05g溶于1000ml雙蒸水中得到）中含有:氨基酸組合1.5g(其中脫氨酸0.75g、鄉(xiāng)氨 酸〇.3g、異亮氨酸0.45g)、維生素組合1.5g(其中維生素 B1 0.3g、維生素 C 0.7g、維生素 D 〇.5g)、復(fù)方中藥多糖14g(由旋復(fù)花20份、白芥子5份、白附子10份、澤蘭5份提取得到）、亞砸 酸鋼12mg，該稀釋液抑為7.0。
[0030] -種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液的制備方法，其步驟同實(shí)施例1。
[0031] 實(shí)施例3 一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，該病毒稀釋液每1000ml憐酸緩沖液(該憐酸緩沖液 由氯化鋼lOg，氯化鐘〇.5g，憐酸氨二鋼1.2g，憐酸二氨鐘0.5g，氯化巧0.2g，含6個結(jié)晶水的 氯化儀〇.2g溶于1000ml雙蒸水中得到）中含有：氨基酸組合2g(其中脫氨酸0.7g、鄉(xiāng)氨酸 〇.5g、異亮氨酸0.8g)、維生素組合3g(其中維生素 B1 1.2g、維生素 C 0.6g、維生素 D 1.2g)、 復(fù)方中藥多糖20g(由旋復(fù)花40份、白芥子20份、白附子30份、澤蘭20份提取得到）、亞砸酸鋼 2〇111邑，該稀釋液抑為7.2。
[0032] -種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液的制備方法，其步驟同實(shí)施例1。
[0033] 實(shí)施例4: 一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液的使用方法 1)稀釋液及其配制，方法同實(shí)施例1。
[0034] 2)雞傳染性法氏囊病毒的雞胚接種與培養(yǎng)繁殖 (1)接種雞胚的選擇 選擇發(fā)育良好的9日齡SPF雞胚，1000枚。
[0035] (2)接種 取生產(chǎn)用毒種，用本發(fā)明稀釋液進(jìn)行100倍稀釋，稀釋后4°C解育30分鐘，每胚尿囊膜接 種0.2ml。接種后密封針孔，置36~37°C繼續(xù)解育，不必翻蛋。
[0036] (3)解育和觀察 雞胚接種后，每日照蛋一次，將在36小時前死亡的雞胚棄去。36小時后，每4~8小時照 蛋一次，隨時取出，48-168小時死亡雞胚，置于2~8°C冷卻。
[0037] (4)收獲 將冷卻4~24小時的雞胚取出，用艦町消毒氣室部位，然后W無菌手術(shù)去除卵殼，收取 胎兒和尿囊膜，分組置于無菌容器內(nèi)，留樣后，置-i〇°cw下冷凍保存。在收獲胚液的同時， 逐個檢查雞胚，如胎兒腐敗、胚液混濁及有任何污染可疑者棄去不用。
[0038] 巧)病毒含量測定 無菌檢驗(yàn):每組分別剪取組織取樣，按《無菌檢驗(yàn)或純粹檢驗(yàn)操作規(guī)程》進(jìn)行無菌檢驗(yàn)， 應(yīng)無細(xì)菌生長。
[0039] 病毒含量測定：將剪取組織按1:10加入滅菌生理鹽水中進(jìn)行研磨，后用滅菌生理 鹽水作10倍系列稀釋至10- 8,取3個適宜稀釋度各尿囊膜內(nèi)接種10日齡SPF雞胚5個，每胚 0.2ml，置36~37°C繼續(xù)解育7日。計(jì)算ELDsq，每0.2ml病毒含量應(yīng)不低于10 5'吃LDso。
[0040] 比較例1:采用上述稀釋液稀釋病毒接種雞胚與常用稀釋液稀釋病毒接種雞胚各 項(xiàng)指標(biāo)的比較。
[0041] 1)取實(shí)施例1得到的雞傳染性法氏囊病毒稀釋液。
[0042] 2)常用病毒稀釋液及其配制，即生理鹽水，按常規(guī)技術(shù)進(jìn)行配制。
[0043] 3)雞胚接種與培養(yǎng)繁殖 (1) 接種雞胚的選擇:選擇發(fā)育良好的10日齡SPF雞胚，2000枚； (2) 接種:將本例（1)中的2000枚10日齡SPF雞胚分為2組，第一組采用本發(fā)明病毒稀釋 液進(jìn)行操作接種，第二組采用常規(guī)技術(shù)配制的病毒稀釋液進(jìn)行病毒稀釋和接種，兩組稀釋 倍數(shù)相同。
[0044] (3)解育和觀察、收獲、病毒懸液檢驗(yàn)。
[0045] 4)兩組方法接種雞胚后死亡集中時間與數(shù)量，見表1。
[0046] 第一組:為本發(fā)明組，采用10日齡雞胚接種。
[0047] 第二組:為常規(guī)技術(shù)稀釋液組，采用10日齡雞胚接種。
[0048] 5)兩組方法接種雞胚后病毒收獲量及其病毒含量，見表2。
[0049] 對實(shí)施例2和3獲得的雞傳染性法氏囊病毒稀釋液進(jìn)行比較例1相同的試驗(yàn)，最終 也能達(dá)到比較例1相同的技術(shù)效果，其病毒收獲量和病毒含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于常規(guī)技術(shù)稀釋液組。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量 配比的組分:氨基酸組合1~2g、維生素組合1~3g、亞硒酸鈉10~20mg和復(fù)方中藥多糖10~ 20g，所述的氨基酸組合包括胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸，所述的維生素組合包括維生素 B1、 維生素 C和維生素 D，所述的復(fù)方中藥多糖由旋復(fù)花、白芥子、白附子和澤蘭提取得到。2. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于該稀釋液的pH為 6 · 2~7 · 2。3. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于所述的磷酸緩沖 液由氯化鈉6~10g，氯化鉀0.05~0 · 5g，磷酸氫二鈉1~1 · 2g，磷酸二氫鉀0.05~0 · 5g，氯化 鈣0.05~0.2g和含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中得到。4. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于所述的每1000ml 磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分:氨基酸組合1.2~1.6g、維生素組合1.5~2.5g、亞 硒酸鈉14~16mg和復(fù)方中藥多糖14~16g。5. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于所述的氨基酸組 合含有以下重量百分比含量的氨基酸：胱氨酸20~50%、纈氨酸20~40%和異亮氨酸30~ 60%，優(yōu)選為胱氨酸20~35%、纈氨酸25~35%和異亮氨酸40~50%。6. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于所述的維生素組 合含有以下重量百分比含量的維生素:維生素 B1 15~40%、維生素 C 20~50%和維生素 D 20 ~40%，優(yōu)選為維生素 B1 20~35%、維生素 C 30~45%和維生素 D 30~35%。7. 如權(quán)利要求1所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液，其特征在于所述的復(fù)方中藥 多糖按以下步驟制得： a、 按旋復(fù)花20~40份、白芥子5~20份、白附子10~30份、澤蘭5~20份稱取各中藥原 料，切碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90 °C，熬制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)lOOOOrpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解， 溶解后，按〇. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)lOOOOrpm離心10分鐘，棄去沉淀，收 集上清； e、 將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉。8. -種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液制備方法，其特征在于包括以下工藝步驟： 1) 磷酸緩沖溶液的配制 按氯化鈉6~10g，氯化鉀0· 05~0 · 5g，磷酸氫二鈉1~1 · 2g，磷酸二氫鉀0.05~0 · 5g，氯 化鈣0.05~0.2g和含6個結(jié)晶水的氯化鎂0.05~0.2g溶于1000ml雙蒸水中，無菌條件下通 過0 · 22μπι濾膜，過濾除菌備用； 2) 復(fù)方中藥多糖的制備 a、按旋復(fù)花20~40份、白芥子5~20份、白附子10~30份、澤蘭5~20份稱取各原料，切 碎、洗凈后用冷水浸泡過夜，再加入原料重量15倍的純化水，水浴至90°C，并保持在90°C，熬 制2小時，熬制過程中每10分鐘攪拌一次； b、 棄去a中藥渣，收集藥液，室溫冷卻后經(jīng)lOOOOrpm離心10分鐘，棄去沉淀，收集上清； c、 將b中上清進(jìn)行醇沉，沉淀得到粗制中藥多糖； d、 用滅菌純化水洗滌c中粗制中藥多糖，洗滌后用20倍量的42°C滅菌純化水進(jìn)行溶解， 溶解后，按〇. 5%比例加入活性炭4°C吸附過夜，吸附后經(jīng)lOOOOrpm離心10分鐘，棄去沉淀，收 集上清； e、 將d中上清液進(jìn)行10倍濃縮，制得中藥多糖濃縮液； f、 將e中中藥多糖濃縮液進(jìn)行真空冷凍干燥制得復(fù)合中藥多糖凍干粉； 3)接種雞胚用病毒稀釋液配制：按氨基酸組合1~2g、維生素組合1~3g、亞硒酸鈉10~ 20mg和復(fù)方中藥多糖10~20g，溶解于步驟1)制得的磷酸緩沖溶液中，充分混勻，用酸或堿 調(diào)節(jié)pH至6.2~7.2之間，無菌條件下通過0.22μπι濾膜，過濾除菌后置4°C保存?zhèn)溆谩?. 如權(quán)利要求8所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液制備方法，其特征在于所述的 步驟3)中氨基酸組合含有以下重量百分比含量的氨基酸:胱氨酸20~50%、纈氨酸20~40% 和異亮氨酸30~60%，優(yōu)選為胱氨酸20~35%、纈氨酸25~35%和異亮氨酸40~50%。10. 如權(quán)利要求8所述的一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液制備方法，其特征在于所述的 步驟3)中維生素組合含有以下重量百分比含量的維生素：維生素 B1 15~40%、維生素 C 20 ~50%和維生素 D 20~40%，優(yōu)選為維生素 B1 20~35%、維生素 C 30~45%和維生素 D 30~ 35%〇
【專利摘要】一種雞傳染性法氏囊病毒稀釋液及其制備方法，屬于獸用生物制品技術(shù)領(lǐng)域。該稀釋液每1000ml磷酸緩沖液中含有以下重量配比的組分：氨基酸組合1～2g、維生素組合1～3g、亞硒酸鈉10～20mg和復(fù)方中藥多糖10～20g，所述的氨基酸組合包括胱氨酸、纈氨酸和異亮氨酸，所述的維生素組合包括維生素B1、維生素C和維生素D，所述的復(fù)方中藥多糖由旋復(fù)花、白芥子、白附子和澤蘭提取得到。本發(fā)明所制備的稀釋液接種雞胚后，可提高雞胚耐受病毒的能力，延長死亡時間，即延長了病毒增殖時間，與現(xiàn)有技術(shù)相比提高了病毒滴度5倍以上。
【IPC分類】C12R1/93, C12N7/00
【公開號】CN105505888
【申請?zhí)枴緾N201511006412
【發(fā)明人】沈建軍, 張秀文, 李陽
【申請人】浙江美保龍生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2015年12月29日