一株特異性抗頭孢噻呋單克隆抗體雜交瘤細胞株2e5及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一株特異性抗頭抱嚷巧單克隆抗體雜交瘤細胞株2E5及其應(yīng)用，屬于 食品安全免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 頭抱嚷巧化FT)，英文名稱為cef tio化r，分子式為Cl訊17化0巧3，分子量為523.56， 化學名稱為(6R，7R)-7-[2-(2-氨基嚷挫-4-基）（甲氧基亞胺基）乙酷胺基]-3-[(2-巧喃基 幾基)硫甲基]-8-氧代-5-硫雜-1-氮雜雙環(huán)[4.2.0]辛-2-締-2-甲酸。CAS登錄號為80370-57-6。頭抱嚷巧為抗微生物藥，是頭抱菌素類半合成的第Ξ代動物專用頭抱菌素。
[0003] 頭抱嚷巧是第一個動物專用的頭抱菌素類抗生素。其母核是由頭抱菌素 C裂解而 獲得的7-氨基頭抱燒酸(7-ACA)。具廣譜殺菌作用，對革蘭氏陽性，革蘭氏陰性包括產(chǎn)內(nèi)酷 胺酶菌株均有效?？咕钚员劝惫?jié)西林強，對鏈球菌的活性也比哇諾酬類抗菌藥強。由于其 優(yōu)良的抗菌活性和藥動力學特點，陸續(xù)被美國、加拿大、日本及歐洲一些國家正式批準用于 肉牛、奶牛、馬、豬、羊的呼吸道疾病的治療，顯示了其在獸醫(yī)臨床應(yīng)用的廣闊前景。
[0004] -般來說，頭抱嚷巧對各種動物的毒副作用較為輕微，大多數(shù)動物多可耐受，無需 停藥。少數(shù)動物可能出現(xiàn)皮疹、痊癢等不良癥狀，偶見極度過敏現(xiàn)象。另一方面，長期食用頭 抱嚷巧殘留的動物性食品還可引起細菌耐藥性，造成人體微生物環(huán)境平衡素亂和失調(diào)。由 于頭抱嚷巧被廣泛用于治療牛乳腺炎和其它乳牛疾病，該藥物在乳汁中的殘留也會給乳制 品的質(zhì)量帶來嚴重影響。此外，頭抱嚷巧主要排泄途徑為腎臟，所W腎毒性較強。歐盟頒布 頭抱嚷巧最大殘留限量在牛奶中最低，限量不得超過l(K)yg/kg。所W有必要建立頭抱嚷巧 的快速檢測方法。
[000引目前頭抱嚷巧的檢測方法主要是儀器檢測方法和免疫分析檢測方法，儀器檢測方 法儀器成本高，操作復雜，需要專職人員操作，而免疫分析方法具有低成本、高通量、高靈 敏、對技術(shù)人員相對要求低等特點，因此適用于大量樣品的快速篩查。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的提供一株特異性抗頭抱嚷巧單克隆抗體雜交瘤細胞株，由該細胞株 制備的抗體對頭抱嚷巧具有較好的親和力和檢測靈敏度，可W用來建立頭抱嚷巧酶聯(lián)免疫 檢測方法，或建立膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案，一株特異性抗頭抱嚷巧單克隆抗體雜交瘤細胞株2E5,已保藏 于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No.10873。
[000引抗頭抱嚷巧單克隆抗體，它由所述保藏編號為CGMCC No. 10873的特異性抗頭抱 嚷巧單克隆抗體雜交瘤細胞株沈5分泌產(chǎn)生。
[0009]所述抗頭抱嚷巧單克隆抗體的應(yīng)用，其在食品安全中頭抱嚷巧殘留檢測中的應(yīng) 用。
[0010] 本發(fā)明提供的雜交瘤細胞株沈5細胞株的制備基本步驟為： (1) 免疫原的制備與鑒定：頭抱嚷巧通過活化醋法與蛋白載體的氨基相連，反應(yīng)結(jié)束 后，通過透析分離完全抗原和未偶聯(lián)的小分子半抗原，完全抗原通過SDS-PAGE凝膠電泳表 征； (2) 小鼠的免疫:將抗原與福氏佐劑乳化完全后，通過皮下多點注射免疫BALB/c小鼠。 首次免疫采用福氏完全佐劑，加強免疫使用福氏不完全佐劑，沖刺免疫時免疫劑量為前一 次免疫劑量的一半，與生理鹽水混合均勻后直接進行腹腔注射;各次免疫間隔為Ξ周。第Ξ 次免疫后，間隔一周采血檢測血清效價和抑制； (3) 細胞融合與細胞株建立:通過聚乙二醇(PEG 4000)法，使小鼠脾細胞和小鼠骨髓瘤 細胞融合，通過HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)，利用間接化ISA檢測陽性細胞孔，并進一步利用間接競爭 ELISA法測定陽性細胞孔的抑制效果，通過有限稀釋法對有最好抑制的陽性細胞孔進行Ξ 次亞克隆，最終篩選獲得雜交瘤細胞株沈5; (4) 雜交瘤細胞株性質(zhì)的鑒定：采用小鼠單抗Ig類/亞類鑒定用酶標二抗套裝測定； IC50值、交叉反應(yīng)率和親和力的測定通過化ISA法。
[0011] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明獲得的抗頭抱嚷巧單克隆抗體雜交瘤細胞株，不僅有 較好的檢測靈敏度和親和力，且對其它頭抱類抗菌素的交叉反應(yīng)率低，可W達到特異性檢 測頭抱嚷巧的目的。本發(fā)明一種新的制備針對特定頭抱菌素特異性抗體的思路，得到很好 的特異性單克隆抗體細胞株。
[0012] 生物材料樣品保藏:一株特異性抗頭抱嚷巧單克隆細胞株沈5,已保藏于中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中屯、，簡稱CGMCC，地址為:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院 3號，中國科學院微生物研究所，保藏日期2015年5月19日，保藏編號為CGMCC No.10873。
【附圖說明】
[0013] 圖1是免疫原的505斗466凝膠電泳表征。1、854,2、6。1'斗0(：-854化。1':854摩爾比= 120:1)，3、EFT-EDC-BSA 化FT: BSA摩爾比=100:1)，4、EFT-EDC-BSA 化FT: BSA摩爾比=80: 1)。
[0014] 圖2是沈5單克隆抗體對頭抱嚷巧EFT的標準曲線。
【具體實施方式】
[0015] 本發(fā)明下面的實施例僅作為本
【發(fā)明內(nèi)容】
的進一步說明，不作為本發(fā)明的限定內(nèi)容 或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。
[0016] 本發(fā)明通過將EFT完全抗原免疫小鼠，通過細胞融合，HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)，通過 間接ELISA和間接競爭ELISA篩選細胞上清，最終得到了對EFT有較好親和力和靈敏度的單 克隆抗體雜交瘤細胞株。
[0017]實施例1雜交瘤細胞株沈5的制備 (1)完全抗原的合成:取4.5mg EFT，再加入2.0mg EDC和l.Omg NHS，使用DMF溶解，室溫 攬拌，活化地;另取5 mg BSA溶解于2mL、0.05 M、p朋.6的CB溶液中，將上述活化后的頭抱嚷 巧溶液慢速逐滴加入BSA的CB溶液中，室溫攬拌反應(yīng)過夜后，4°C透析Ξ天，得免疫原，-20°C 分裝保存。
[0018] (2)動物免疫:選擇健康的6~8周齡的BALB/c小鼠進行免疫。取頭抱嚷巧完全抗原 (Img/mL)與等量福氏佐劑乳化均勻后，通過皮下多點注射免疫BALB/c小鼠，每只l(K)yL。首 次免疫采用福氏完全佐劑，加強免疫使用福氏不完全佐劑，沖刺免疫時免疫劑量為前一次 免疫劑量的一半，與生理鹽水混合均勻后直接進行腹腔注射;各次免疫間隔為Ξ周。第Ξ次 免疫后，間隔一周采血檢測血清效價和抑制；選擇抑制最好的小鼠，在五免后21天沖刺免 疫，準備融合。
[0019] (3)細胞融合:在沖刺免疫Ξ天后，按照常規(guī)PEG(聚乙二醇，分子量為4000)方法進 行