〇 [0052]
[0054]通過使CDR域和殘基兩者接觸TFPI以分析選擇的位點在誘變后的結(jié)合特征來產(chǎn)生 2A8-g200和4B7-gB9 · 7的pH敏感變體。圖2顯示了可能的His突變的位置對:A· 2A8-g200 (圖 2A中命名為A200)可變重鏈可變區(qū)；B.2A8-g200(圖2B中命名為A200)可變輕鏈；C.4B7-gB9.7可變重鏈;和D. 4B7-gB9.7可變輕鏈的可能的His突變的位置。一個組氨酸殘基是對在 1)在圖2中帶下劃線的指示與TFPI相接觸的氨基酸的殘基或2)在圖2中的星號指示用于對 抗TFPI抗體2A8-g200和4B7-gB9.7的CDR 1-3的殘基中的各氨基酸的取代。如圖2A和2B所 示，來自重鏈的40個殘基和來自輕鏈的29個殘基被鑒定為在2A8-g200中的誘變位置。如圖 2C和2D所示中顯示的，在4B7-gB9.7中鑒定了 40個重鏈和32個輕鏈變體。
[0055] 合成2A8-g200Fab組氨酸掃描文庫。該文庫含有69個成員。將2A8-g200Fab組氨酸 文庫克隆至細菌表達載體并且驗證氨基酸序列。
[0056] 將來自His掃描文庫的69個克隆體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(E.coli)ATCC菌株9637中且在 含有羧芐青霉素（l〇〇yg/mL)的選擇性培養(yǎng)基上生長。使用單一集落接種至LB-羧芐青霉素-100培養(yǎng)基。在37°C下將培養(yǎng)物生長至0D600 = 0.5,使用0.25mM IPTG誘導(dǎo)，并且在30°C下過 夜培育。通過在4°C下在5,000Xg離心15min來收獲細菌表達培養(yǎng)物。將表達介質(zhì)從團塊中 傾析。將團塊和經(jīng)清理的表達培養(yǎng)基在_20°C下冷凍。用蛋白A(Protein A)從表達培養(yǎng)基中 純化His突變蛋白。通過SDS-PAGE分析純化的突變蛋白且通過A280得到濃度。
[0057] 使用lμg/ml的人TFPI包覆MaxisorbTM微量滴定板。將來自His掃描文庫的各成員 的1〇〇μ1的表達培養(yǎng)基以成對的方式添加到板上的兩個孔中。在室溫下將板在振蕩器上溫 育1小時。將板使用TOST洗滌三次。將PBS(pH 7.0)添加到一對孔中的一個，將100mM ΡΗ6.0 的檸檬酸緩沖液添加到同一對孔中的另一個。在37°C下將板在振蕩器上溫育1小時。將板使 用TOST洗滌三次并用amplex red顯色。建立pH 7.0/ρΗ 6.0的比率來排列敏感突變蛋白。野 生型2A8-g200Fab的比率為1.0。在下文表2中顯示了在pH 7.0和pH 6.0之間具有大于1.78 比率的10個克隆。
[0058] 表2:pH6.0TFPI 解離 ELISA
[0059]
[0061 ] 使用表面等離子體共振(Biacore)測試Fab形式(指表1中的wt gA200Fab)的純化 的2A8-g200變體。表面等離子體共振(Biacore T200)被用于測量抗體的解離速率。使用由 Biacore建議的方法將人TFPI(American Diagnostica)胺偶聯(lián)在CM4或CM5芯片上，造成100 至300RU固定化的TFPI。注射純化的2A8-g200變體，隨后在pH7.4或pH6.0緩沖液下解離40分 鐘。將抗體以不同濃度在HBS-P緩沖液中稀釋，且將流速設(shè)置在50μ1/分鐘。每一輪抗體注入 后，通過注入90μ1的pH 1.5的甘氨酸再生芯片。使用BIAevaluation軟件評估數(shù)據(jù)組。
[0062]利用具有以下公式的模型確定各個2A8_g200變體抗體的解離常數(shù)(kd):
[0063] R = R〇e-kd(t-10)+偏移
[0064] 其中R為在時間t的應(yīng)答，Ro為在時間to的應(yīng)答(離解開始），偏移(offset)允許在解 離完全結(jié)束時的殘余應(yīng)答。對各個2A8-g200變體計算在pH 6.0上的kd與在pH 7.4上的kd的 比率。觀察到的具有比率為2的突變被認為是pH-敏感突變且可被用于建構(gòu)2A8-g200的IgG 變體。
[0065] 例如，參照圖3,顯示了兩個示例性2A8-g100 輕鏈組氨酸取代突變:A.L-L27H和 8.1^31!1在1^〇(3〇^測定中在兩種不同?!1(?!16.0和?!17.4)下的解離常數(shù)應(yīng)答中觀察的變 化。
[0066]在向HemA小鼠以2mg/kg靜脈內(nèi)（i . v.)推注施用后確定抗體的藥代動力學(xué)參數(shù)。使 用WinNonLin軟件5·3· 1版本（Pharsight Corporation，Mountain View，CA)非分段模型計 算所有的藥代動力學(xué)參數(shù)。在小鼠血漿中所觀察到的組氨酸突變對抗TFPI單克隆抗體的半 衰期的效果在圖4中顯示。相比于沒有任何組氨酸取代的相應(yīng)的2A8-g200的pK概況，具有組 氨酸突變 TPP2256(L-Y31H/Y49H)和 TPP2259(L-Y31H)的 2A8-g200 在 500 小時的時間跨度上 增加了觀察到的PK概況。表3量化了在圖4數(shù)據(jù)中觀察到的增加的半衰期。
[0067]表3:ρΚ參數(shù) 「00681
[0070] 因此，減少TFPI介導(dǎo)的TMDD且具有延長Τ1/2的上文指定的抗體會導(dǎo)致較不頻繁的 給藥且減少每劑量所需材料量。此外，低劑量需求還使得給藥體積成為限制步驟（由于抗體 與快速清除對象的相互作用而通過處理或由于其與其靶的對象共定位而被從等離子體隔 離的將抗體從循環(huán)中移除的過程)的皮下給藥變得可行。
[0071] 在此將有本公開發(fā)明的多種修飾、改善和應(yīng)用，其將對本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易 見的，并且本申請包括那些法律允許范圍內(nèi)的實施方案。盡管本發(fā)明已經(jīng)在某些優(yōu)選的實 施方案背景下進行了描述，但是本發(fā)明的完整范圍是不受其限制的，而是根據(jù)以下權(quán)利要 求的范圍。全部引用、專利或其它出版物通過引用特別地并入本文。
【主權(quán)項】
1. 一種治療組合物，包含分離的人單克隆IgG抗體，其特異地結(jié)合人組織因子途徑抑制 劑(TFPI)并具有增加的血漿半衰期，其中所述抗體包括在人重鏈或者人輕鏈上的CDR區(qū)中 的至少一個組氨酸取代，并且抗體以在pH7.4下是pH6.0下至少兩倍的親和力結(jié)合TFPI。2. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO:5。3. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO:6。4. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO:7。5. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO:8。6. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO:9。7. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO: 10。8. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 11。9. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 12。10. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 13。11. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 14。12. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 15。13. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 16。14. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 17。15. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 18。16. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述重鏈包括SEQIDNO: 10,且所述組氨酸 取代選自Y102H、Y32H和Y100H及其組合。17. 權(quán)利要求1所述的分離的人抗體，其中所述輕鏈包括SEQIDNO: 17,且所述組氨酸 取代選自 ￥3111小48!1、550!1、￥49!1、1^7!1、￥45!1、190!1及其組合。18. 權(quán)利要求1所述的分離的單克隆抗體，其具有選自VL-Y31H、VH-Y102H、VH-Y100H、 ￥!1-￥32!1、￥1^448!1、￥1^-550!1、￥1^-￥49!1、￥1^-1^27!1、￥1^，45!1、￥1^-190!1及其組合的至少兩個組氨 酸取代。
【專利摘要】公開的抗體結(jié)合TFPI并且抑制其抗凝血功能，并且在pH6.0下比pH7.0下具有對TFPI更低的親和力。由于減少了靶介導(dǎo)的清除，將抗體/抗原復(fù)合物內(nèi)吞并且運輸至溶酶體(在此兩種組分均被降解)的過程，在pH6下較低的親和力改善了循環(huán)半衰期(T1/2)。在pH6.0下較低的親和力導(dǎo)致溶酶體靶向前復(fù)合物的破壞，并且允許所述抗體的再循環(huán)。根據(jù)使用的方法公開了通過組氨酸取代對抗體結(jié)合的特異性修飾。
【IPC分類】C07K16/36
【公開號】CN105452298
【申請?zhí)枴緾N201480016248
【發(fā)明人】王卓智, J·E·默菲, R·溫特
【申請人】拜爾健康護理有限責(zé)任公司
【公開日】2016年3月30日
【申請日】2014年3月14日
【公告號】CA2906128A1, EP2970497A1, US20140275493, US20160009818, WO2014144577A1