改善藥代動(dòng)力學(xué)的具有跨pH范圍差異結(jié)合的抗TFPI抗體變體的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】改善藥代動(dòng)力學(xué)的具有跨pH范圍差異結(jié)合的抗TFPI抗體變體
[0001] 對(duì)相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求享有于2013年3月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/798,261的權(quán)益，所 述申請(qǐng)通過(guò)引用并入本文。
【背景技術(shù)】
[0003] 目前的血友病A和B患者的預(yù)防性管理是替代FVIII或FIX(重組的或血漿衍生的產(chǎn) 品）。這些治療每周施用兩次或三次，為遵守其預(yù)防方案給患者造成了沉重負(fù)擔(dān)。盡管?chē)?yán)格 管理和嚴(yán)格堅(jiān)持，患者通常會(huì)經(jīng)歷偶發(fā)的突破性出血(breakthrough bleed)并需要按需治 療。如果沒(méi)有適當(dāng)?shù)墓芾?，頻繁和嚴(yán)重出血導(dǎo)致顯著發(fā)病率，特別是血友病性關(guān)節(jié)病 (hemarthropathy)。盡管用于治療血友病A和B患者的現(xiàn)有藥物有確切療效，大多數(shù)青年、青 少年和老年人決定通過(guò)減少在常規(guī)基礎(chǔ)上采取的注射次數(shù)來(lái)減輕預(yù)防負(fù)擔(dān)。該做法進(jìn)一步 損害了對(duì)充分管理出血所需的保護(hù)。
[0004] 因此，顯著提供保護(hù)并需要相對(duì)不頻繁施用的試劑是最期望的。最優(yōu)的治療應(yīng)通 過(guò)每周或較少頻繁的給藥提供保護(hù)。鑒于目前的競(jìng)爭(zhēng)環(huán)境，靜脈內(nèi)地（i.v.)或皮下地 (s. c.)施用的每周一次的治療可在接下來(lái)的3-4年內(nèi)實(shí)現(xiàn)。因此，i . v.或s. c.施用的試劑應(yīng) 提供具有相當(dāng)保護(hù)的優(yōu)秀施用概況。在可以實(shí)現(xiàn)皮下施用的事件中，由于該方法減少的侵 入性，每周一次給藥還可以對(duì)未來(lái)治療前景提供顯著的價(jià)值。
[0005]目前血友病治療的另一個(gè)主要問(wèn)題是針對(duì)因子VIII或因子IX的抑制性抗體的開(kāi) 發(fā)。約25%的FVIII治療的患者產(chǎn)生針對(duì)FVIII的抑制劑或中和抗體。雖然較不頻繁，也在 FIX治療的患者中發(fā)現(xiàn)了抑制劑。抑制劑的發(fā)展顯著地降低替代治療的有效性并對(duì)用于在 血友病患者中管理出血提出了挑戰(zhàn)。目前對(duì)具有對(duì)FVIII或FIX抑制劑的患者的出血的治療 是使用重組因子Vila或血漿衍生的FEIBA的旁路治療(bypass therapy) jFVIIa的半衰期 相當(dāng)短（-2小時(shí)）且因此在這些患者的預(yù)防性治療是不常見(jiàn)的[Blanchette，Haemophilia 16 (supplement 3):46-51，2010]〇
[0006] 為了解決這些未被滿足的醫(yī)療需求，已開(kāi)發(fā)了作為長(zhǎng)效劑針對(duì)組織因子途徑抑制 物（TFPI)的抗體。見(jiàn)WO 2010/017196;W0 2011/109452;W0 2012/135671JFPI是啟動(dòng)凝血 途徑的組織因子的主要抑制劑，其在血友病患者(Persons with Hemophilia，PWH)中是完 整的，并因此抑制TFPI可以在展示對(duì)FVIII或FIX的抑制性抗體的PWH中恢復(fù)止血。除了允許 達(dá)到該目標(biāo)，單克隆抗體(mAb)療法的治療劑已顯示比重組置換替代因子具有顯著更長(zhǎng)的 循環(huán)半衰期（長(zhǎng)達(dá)3周）。抑制TFPI的抗體還具有隨皮下注射的顯著生物利用度。因此，抗 TFPI單克隆抗體治療將滿足對(duì)PWH和具有抑制劑的PWH的皮下注射的、長(zhǎng)效止血保護(hù)的重要 的未滿足的醫(yī)學(xué)需求。
[0007] 然而，雖然TFPI的抑制在血友病血漿和血友病動(dòng)物中已顯示出促進(jìn)凝血，由于稱(chēng) 為革巴介導(dǎo)藥物處置(target mediated drug disposition)(TMDD)的現(xiàn)象（由于抗體與迅速 清除的靶的相互作用將抗體從循環(huán)中移除，或由于其與靶的共定位(抗體:抗原復(fù)合物)而 從血漿中隔絕的過(guò)程），針對(duì)TFPI的抗體具有相對(duì)短的、非線性的半衰期。因此，避免TFPI介 導(dǎo)的TMDD并且具有延長(zhǎng)的半衰期的抗體會(huì)導(dǎo)致較不頻繁的給藥且減少每劑量所需要的材 料量。另外，較少劑量的要求還使得給藥量成為限制步驟的皮下注射給藥變得可行。例如， 在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中，優(yōu)化的抗TFPI抗體2A8-g200(W0 2011/109452)在當(dāng)以5mg/kg給藥時(shí) 具有28小時(shí)的半衰期，當(dāng)以20mg/kg給藥時(shí)具有67小時(shí)的半衰期。
[0008] 這種相對(duì)短的半衰期、和為克服TMDD的較大劑量的需要增加了患者的注射負(fù)擔(dān)， 限制了用于皮下注射給藥的制劑，并增加了產(chǎn)品的成本。在非人靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中的這些抗體 的藥代動(dòng)力學(xué)分析證實(shí)循環(huán)半衰期不隨劑量呈線性關(guān)系，且特別在較低劑量下，其短于抗 體藥物特征。類(lèi)似的藥代動(dòng)力學(xué)概況在對(duì)于另一個(gè)抗TFPI抗體的US2011/0318356 A1中描 述。這種在較低劑量下具有顯著縮短的T1/2的差異是TMDD的特征，其中在較高劑量下的較 慢的清除是由于靶的飽和。
[0009] 因此，存在對(duì)用于中度至重度血友病A和B(特別地對(duì)具有針對(duì)FVIII或FIX抑制劑 的那些患者）的更好的預(yù)防性治療的未滿足的醫(yī)學(xué)需求。該需求將通過(guò)可以靜脈內(nèi)地或皮 下地，并且以較低頻率，優(yōu)選地每周一次或更少的施用的具有改善特征的抗-TFPI抗體滿 足。
[0010] 發(fā)明概述
[0011] 為了增加抗TFPI抗體的半衰期和減小注射負(fù)擔(dān)，生產(chǎn)出無(wú)效力損失的更長(zhǎng)效的抗 TFPI抗體，且經(jīng)測(cè)試以確認(rèn)相比其它已證明具有TFPI結(jié)合特征且被證明對(duì)治療凝血缺陷有 效的抗TFPI抗體具有改善的性能。（見(jiàn)W0 2011/109452)。特別地，通過(guò)生成在PH 6.0下相對(duì) 于在pH 7.4下具有減少的親和力的變體抗TFPI抗體減少了TMDD。通過(guò)參與TFPI清除的受 體，可以將抗TFPI抗體與其靶(TFPI)復(fù)合，一同被細(xì)胞攝取。由Narita等人(JBC270(42): 24800-4,1995)鑒定的一種受體為L(zhǎng)RP(LDL受體相關(guān)蛋白），其靶向TFPI以將其在核內(nèi)體中 降解。然而，如果該抗原:抗體復(fù)合物可在低pH值下（其是核內(nèi)體的特征)被破壞，所述抗體 可以通過(guò)FcRn結(jié)合再循環(huán)，從而增加在循環(huán)中的暴露。該原理已通過(guò)Chapparo-Riggers等 人JBC 287(14) :110-7(2012)對(duì)針對(duì)PSCK9的抗體顯示。
[0012] -種在較低pH下破壞抗原:抗體復(fù)合物的方法是取代鄰近抗原:抗體相互作用表 面的組氨酸殘基。氨基酸組氨酸(His)在接近pH 6.0的低pH值下被質(zhì)子化，且因此在pH 7.4 下為中性的殘基在pH 6.0下獲得正電荷。這可以導(dǎo)致在抗原：抗體相互作用表面上與其它 氨基酸的電荷排斥和期望程度的破壞或不穩(wěn)定。
[0013] 為了鑒定pH敏感殘基，將參與抗TFPI抗體(例如2A8-g200)對(duì)TFPI抗原的抗原：抗 體結(jié)合的⑶R氨基酸和其它氨基酸個(gè)別地變?yōu)镠is。個(gè)別的His變體證明了在pH 7.4與pH 6.0下的差異結(jié)合，且具有差異結(jié)合的變體的組合已被測(cè)試用于優(yōu)化。
[0014] 經(jīng)核內(nèi)體釋放后，這些pH敏感的抗TFPI mAb變體結(jié)合至初生的FcRN受體并再循環(huán) 至血漿。因此，pH敏感的TFPI -結(jié)合位點(diǎn)與在低pH下對(duì)FcRN有增加的親和力的Fc域之間的組 合會(huì)具有協(xié)同效應(yīng)，其增加了半衰期、降低了患者的注射負(fù)擔(dān)，并且降低了產(chǎn)品成本。
[0015] 附圖描述
[0016]圖1顯示了2A8-g200和適合于組氨酸取代的突變的抗TFPI mAb的氨基酸序列的對(duì) 比（這些序列的SEQ ID N0可在表1中找到hA.可變重鏈，B.可變輕鏈。指示了⑶R區(qū)1-3。 [0017] 圖2顯示了 2A8-g200Fab組氨酸掃描文庫(kù)的合成和亞克隆。用虛線指示⑶R 1-3區(qū)。 帶下劃線的氨基酸殘基指示了與TFPI接觸的殘基的位置。星號(hào)（*)指示提出的His突變位 點(diǎn)。A) 2A8-g200 重鏈;B) 2A8-g200 輕鏈;C) 4B7-gB9 · 7 重鏈；和 D) 4B7-gB9 · 7 輕鏈。
[0018]圖3顯示了具有示例性的組氨酸突變:A.L-L27H和B.L-Y31H的改善的抗體在兩個(gè) pH值下的解離常數(shù)。使用表面等離子體共振(Biacore T200)以測(cè)量抗體的解離速率。
[0019]圖4顯示了在HemA小鼠血漿中對(duì)以2mg/kg的濃度的數(shù)種單克隆抗體隨時(shí)間觀察到 的pK概況：2A8-g200( - ·--)、組氨酸取代的單克隆抗體TPP2256(L-Y31H/Y49H)(--- ---)和TPP2259(L-Y31H)(-A-)。抗體的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)在對(duì)HemA小鼠以2mg/kg的靜脈 內(nèi)（i.v.)推注施用后確定。
[0020] 發(fā)明詳述
[0021] 如本文所用的術(shù)語(yǔ)"組織因子途徑抑制劑"或"TFPI"指的是由細(xì)胞天然表達(dá)的人 TFPI的任何變體、同種型和物種同系物。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明抗體與TFPI的 結(jié)合減少了血液凝結(jié)時(shí)間。
[0022] 如本文所使用的，"抗體"是指完整抗體及其任何抗原結(jié)合片段（8卩"抗原結(jié)合部 分"）或單鏈。術(shù)語(yǔ)包括全長(zhǎng)免疫球蛋白分子(例如IgG抗體），其是天然存在的或由正常免疫 球蛋白基因片段重組處理形成，或是免疫球蛋白分子的免疫活性部分，諸如抗體片段，其保 留了特異結(jié)合活性。無(wú)論結(jié)構(gòu)如何，抗體片段與通過(guò)全長(zhǎng)抗體識(shí)別的相同抗原結(jié)合。例如， 抗TFPI單克隆抗體片段結(jié)合TFPI的表位?？贵w的抗原結(jié)合功能可通過(guò)全長(zhǎng)抗體的片段執(zhí) 行。包括在抗體的術(shù)語(yǔ)"抗原結(jié)合部分"中的結(jié)合片段