作用分析獲取。類(lèi)似地，不可降解的條件也呈現(xiàn)這樣的非線(xiàn)性效應(yīng)，但Ecad條件在高度降解條件的存在下具有正影響(參見(jiàn)圖5d)。同樣，ECad在一種更硬的條件具有更明顯的正效應(yīng)(參見(jiàn)圖5e)。
[0117]篩選的條件為理解神經(jīng)上皮的形態(tài)和極性的機(jī)理提供基礎(chǔ)
[0118]高通量篩選，例如這里提出的可以作為用于更有針對(duì)性的研究的假說(shuō)工具。例如，通過(guò)因子相互作用分析確定的假定的FGF4的非線(xiàn)性效果顯示為細(xì)胞密度介導(dǎo)的:在相對(duì)高的細(xì)胞密度(3百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)下，向培養(yǎng)基添加FGF4幾乎沒(méi)有效果，而在較低的細(xì)胞密度(1百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞/ml)下，缺乏FGF4導(dǎo)致增殖和GFP強(qiáng)度減少(參見(jiàn)圖6a)，突出了這種生長(zhǎng)因子作為神經(jīng)分化的自分泌調(diào)節(jié)劑的作用。
[0119]來(lái)自這樣的篩選的圖像集的分析還輸出超出作為增殖量度的平均集落面積和作為分化量度的Soxl-GFP表達(dá)的額外度量，其中特別相關(guān)的形態(tài)學(xué)度量與觀察到的表型相關(guān)聯(lián)以輸入細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境。通過(guò)使用聚類(lèi)方法將多維輸出組合成關(guān)聯(lián)的形態(tài)學(xué)、增殖和分化的簇(未示出)，可以構(gòu)造表型信號(hào)，其提供細(xì)胞行為的更全面的圖像。因此，可以確定以平滑、圓形為特點(diǎn)的集落幾乎僅在不可降解的條件下生成，而維持高GFP表達(dá)，但具有大量奇怪的和星形形狀的集落在可降解基質(zhì)中存在(參見(jiàn)圖6b)。在進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)中(未示出)使用寬頻MMP抑制劑，可以確定這種現(xiàn)象確實(shí)是蛋白酶介導(dǎo)的。因此，通過(guò)將感興趣的度量擴(kuò)大到包括形態(tài)特征，能夠確定誘導(dǎo)不同形態(tài)的特定微環(huán)境條件，其可能與特定形態(tài)發(fā)生通路關(guān)聯(lián)。
[0120]神經(jīng)囊腫形成的一個(gè)標(biāo)志是內(nèi)腔的發(fā)育。共聚焦3D重建清楚地示出，集落確實(shí)很好地貫穿凝膠的厚度分布，并且沒(méi)有表現(xiàn)出特別的平面偏置(參見(jiàn)圖6b)。在不可降解的凝膠的3D結(jié)構(gòu)中的集落緊密靠近生長(zhǎng)而沒(méi)有融合，但是彼此之間保持薄的水凝膠邊界(參見(jiàn)圖6b)，表明在這樣的基質(zhì)中的生長(zhǎng)通過(guò)對(duì)基質(zhì)向外的力完成，并且沒(méi)有通過(guò)任何重塑過(guò)程。最顯著地，在以不可降解基質(zhì)和FGF4為特征的選擇的條件中觀察到頂-底極性(apico-basal polarity)的測(cè)量值(參見(jiàn)圖6c)和可能的退化的開(kāi)始。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)顯示，雖然在單一 ECM因子存在的條件中僅證實(shí)了不頻繁的囊腫極性，但是當(dāng)所有三種ECM組分(層粘連蛋白，IV型膠原蛋白和纖連蛋白)均引入基質(zhì)中時(shí)，建立了穩(wěn)健的和頻繁的極性(參見(jiàn)圖6d) ο
[0121]在該高通量方法中，在3D細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的陣列中的ESC的響應(yīng)形成了對(duì)神經(jīng)上皮分化調(diào)節(jié)的新見(jiàn)解。正如在ESC自我更新的研究中，可溶性因子發(fā)揮了主導(dǎo)作用，特別是在測(cè)定增殖中，并且在促進(jìn)或阻礙分化中具有明顯的效果?；|(zhì)的影響，特別是基質(zhì)MMP敏感性，在指定細(xì)胞命運(yùn)中起同樣顯著的作用。事實(shí)上，球形上皮集落僅在不可降解基質(zhì)中觀察到，而在可降解基質(zhì)中，分化的程度和集落形態(tài)顯著改變。此外，參與細(xì)胞間相互作用的蛋白損害神經(jīng)上皮分化，而ECM蛋白對(duì)建立只有以組合方式呈現(xiàn)的頂-底極性起重要作用。因此，高通量平臺(tái)，如在這里使用的，不僅被視作理解細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)發(fā)育途徑影響的工具，還可以作為可以使得更復(fù)雜的機(jī)制被闡明的巨大的假說(shuō)方法。
[0122]陣列平臺(tái)適合多種檢測(cè)和細(xì)胞類(lèi)型
[0123]本發(fā)明的另外的實(shí)施方案包括進(jìn)行迀移和形態(tài)檢測(cè)的可能性。此外，這種檢測(cè)可以從單一細(xì)胞(如先前看到的)或從體外形成的細(xì)胞團(tuán)(如胚體)或直接從活組織分離的細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始進(jìn)行。作為實(shí)例，將間充質(zhì)干細(xì)胞聚集到300個(gè)細(xì)胞的尺寸，引入組合的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境，并在16小時(shí)后評(píng)估它們的迀移(在培養(yǎng)基中存在作為可溶性因子的TOGF)?；|(zhì)-連接ECM-模擬肽(源于纖粘連蛋白的RGD基序)，以及基質(zhì)MMP敏感性調(diào)節(jié)從簇向外的細(xì)胞迀移響應(yīng)(參見(jiàn)圖7a)?？梢詫⒏鞣N上皮細(xì)胞簇，包括例如胰腺的，子宮內(nèi)膜的，腸的或乳腺的，引入篩選平臺(tái)，并評(píng)估干細(xì)胞標(biāo)志物，極性或其它形態(tài)特性(參見(jiàn)圖7b)。
[0124]實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)
[0125]水凝膠前體合成
[0126]制備PEG乙烯砜(PEG-VS)，其性質(zhì)如別處所描述(Lutolf和Hubbell, 2003)。在第二步中，使用因子X(jué)llla-肽底物通過(guò)邁克爾加成將PEG-VS官能化。使用含有谷氨酰胺的肽(NQEQVSPL-ERCG-NH2)和具有各種MMP敏感性序列的不同類(lèi)型的含有賴(lài)氨酸的肽:
[0127]AcFKGG-GPQGIWGQ-ERCG-NH2 (肽 W)，
[0128]AcFKGG-GDQGIAGF-ERCG-NH2 (肽 A)，
[0129]AcFKGG-PQGIAGQ-ERCG-NH2 (肽 G)，
[0130]AcFKGG-VPMSMRGG-ERCG-NH2 (肽 V)。因此，得到一種谷氨酰胺-PEG前體(Q-PEG)和四種不同的賴(lài)氨酸-PEG前體:W-PEG、A-PEG、V-PEG、G-PEG。如在別處(Ehrbar等人，2007)所描述的進(jìn)行這些前體的官能化和表征。簡(jiǎn)言之，在37°C下，在0.3M三乙醇胺(pH 8.0)中，將肽以超過(guò)VS基團(tuán)1.2倍的摩爾過(guò)量加入到PEG-VS中2小時(shí)，然后在4°C下，用超純水透析(Snake Skin, MWCO 10k, PIERCE) 4 天。透析后，將無(wú)鹽產(chǎn)品(Q-PEG、W-PEG、A-PEG、V-PEG, G-PEG)凍干，得到白色的粉末。
[0131]水凝膠制備
[0132]在水中將因子X(jué)III (Fibrogammin P, CSL Behring)從凍干粉復(fù)溶到濃度為200U/ml ο 在 37 °C 下，使用 100 yL 的凝血酉每(20U/mL, Sigma-Aldrich, Switzerland)將lml因子X(jué)llla活化30分鐘。將等份的已活化的因子X(jué)llla儲(chǔ)存在_80°C下用于進(jìn)一步使用。通過(guò)Q-PEG的化學(xué)計(jì)量平衡([Lys]/[Gln] = 1)溶液制備最終干質(zhì)量含量為
1.5到4%的水凝膠的前體溶液，并且四種賴(lài)氨酸-PEG中的每種均在含有50mM氯化鈣的Tris-Buffer (TBS, 50mM, pH7.6)中。交聯(lián)反應(yīng)通過(guò)10U/mL凝血酶活化的因子X(jué)llla和劇烈混合引發(fā)。為了得到盤(pán)形基質(zhì)，液體反應(yīng)混合物(50 μ 1)被夾在被墊片(厚度約1_)分開(kāi)的無(wú)菌疏水性顯微載玻片(通過(guò)使用SigmaCote，Sigma處理得到的)之間并且使用長(zhǎng)尾夾夾緊。然后將基質(zhì)在37°C下孵育30min。
[0133]MMP-介導(dǎo)的降解的表征
[0134]針對(duì)4條肽序列中的每條制備PEG為3.5% w/v的三個(gè)50 μ 1凝膠盤(pán)，并使之pH7.5的50mm TrisUOOmM NaClUOmM CaCl2緩沖液中溶脹12小時(shí)。然后將它們稱(chēng)重并放到40mM MMP-1溶液中，在相同的緩沖液中溶解。在最初的12小時(shí)內(nèi)，間隔2小時(shí)記錄凝膠質(zhì)量，然后在t = 18、24、48和72時(shí)記錄。完成降解的時(shí)間直接或通過(guò)線(xiàn)性回歸(針對(duì)G肽)確定，然后轉(zhuǎn)化得到降解性的量度。
[0135]力學(xué)性質(zhì)的表征
[0136]使凝膠盤(pán)(對(duì)于每個(gè)MMP敏感性η = 3)在緩沖液中溶脹12小時(shí)，然后進(jìn)行小型應(yīng)變振蕩剪切流變測(cè)定。將1至1.4mm厚的溶脹的水凝膠盤(pán)夾在Bohlin CV 120(BohlinInstruments)流變儀的兩個(gè)板之間，并壓縮到它們的初始厚度的85%至75%以避免滑動(dòng)。然后在恒定應(yīng)變(5% )模式下進(jìn)行測(cè)量。在0.1至1Hz的頻率范圍內(nèi)記錄剪切應(yīng)力，并得到超過(guò)所述頻率范圍的平均存儲(chǔ)模量(G’)。將存儲(chǔ)模量(G’)作為針對(duì)4種MMP-敏感性的每個(gè)的水凝膠％ PEG w/v的函數(shù)繪圖。對(duì)所述G’相對(duì)于％ PEG數(shù)據(jù)點(diǎn)采用線(xiàn)性?xún)?nèi)插法。對(duì)于每種降解性，測(cè)定對(duì)應(yīng)于0、600、1200和1800Pa的％ PEG。
[0137]使用細(xì)胞間相互作用蛋白修飾基質(zhì)
[0138]為了將細(xì)胞間相互作用蛋白結(jié)合到水凝膠網(wǎng)絡(luò)，使用了 Fc-標(biāo)記/蛋白A結(jié)合策略。為了使蛋白A對(duì)于因子X(jué)llla催化的交聯(lián)具有敏感性，使用NHS-PEG-馬來(lái)酰亞胺，一種異源雙官能連接體，將含Q肽連接到蛋白A。蛋白A的修飾在兩步反應(yīng)中實(shí)現(xiàn):通過(guò)10倍摩爾過(guò)量的NHS-PEG-馬來(lái)酰亞胺的反應(yīng)用馬來(lái)酰亞胺基團(tuán)官能化，然后是通過(guò)其半胱氨酸側(cè)鏈的Q肽連接。因此，Q蛋白A官能化通過(guò)SDS-PAGE定性評(píng)估。選擇用于因子X(jué)llla的熒光計(jì)數(shù)反應(yīng)底物，含有賴(lài)氨酸的探針，Lys-Tamra用于檢測(cè)因子X(jué)llla介導(dǎo)的交聯(lián)反應(yīng)是否能夠發(fā)生。當(dāng)?shù)鞍譇和Lys-Tamra在因子X(jué)llla的存在下混合時(shí)，在SDS-PAGE和膠內(nèi)熒光掃描中將檢測(cè)到與蛋白A相對(duì)應(yīng)的熒光信號(hào)，證實(shí)了成功的生物結(jié)合。為了實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間相互作用蛋白與基于因子X(jué)llla的水凝膠的共價(jià)連接，在室溫下，將Fc標(biāo)記的鈣粘素、EpCAM和Jagged(R&D Systems)與Q蛋白A以1.66摩爾過(guò)量比率預(yù)混合30分鐘。考慮到蛋白A具有五個(gè)Fc結(jié)合位點(diǎn)的事實(shí)，我們提供了相對(duì)于Fc-蛋白3倍分子過(guò)量的每種Fc結(jié)合位點(diǎn)，這應(yīng)該確保成型素的最佳固定化。將得到的完全官能化的蛋白質(zhì)構(gòu)建體的溶液等分并在_20°C下貯存直到進(jìn)一步使用。
[0139]測(cè)定ECM蛋白對(duì)因子X(jué)llla介導(dǎo)的交聯(lián)的敏感性
[0140]基于大型ECM蛋白可能是因子X(jué)llla的天然底物并且可以連接(tether to)到水凝膠網(wǎng)絡(luò)而不用進(jìn)一步結(jié)合的假設(shè)，在溶液中使用以下感興趣的ECM蛋白:層粘連蛋白、I型膠原蛋白(BD B1sciences)、纖連蛋白(R&D Systems)。進(jìn)行焚光結(jié)合試驗(yàn)，其中在因子X(jué)llla的存在下，蛋白質(zhì)與每種熒光因子X(jué)llla底物(Q-肽_Alexa647或賴(lài)氨酸-Tamra)混合。反應(yīng)通過(guò)SDS-PAGE以及膠內(nèi)熒光掃描定性分析，證明了蛋白對(duì)于基于因子X(jué)llla的交聯(lián)確實(shí)是敏感的。所有的ECM蛋白在4°C下等分并在_20°C下儲(chǔ)存。
[0141]細(xì)胞培養(yǎng)
[0142]在所有的ESC自我更新試驗(yàn)中，0ct4_GFP鼠胚胎干細(xì)胞(mESC)(由Zandstralab提供的R1系)在明膠涂覆的培養(yǎng)皿上在含有15 %的血清(Hyclone)和106U/mlLIF(Millipore)的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。在進(jìn)行試驗(yàn)之前十二小時(shí)，將培養(yǎng)基更換為不含血清的knock-out培養(yǎng)基(K0)。
[0143]在所有的神經(jīng)上皮分化實(shí)驗(yàn)中，Soxl-GFP鼠胚胎干細(xì)胞(由Tanaka實(shí)驗(yàn)室提供的46C細(xì)胞系)在含有15%的血清(Hyclone)和106U/ml LIF (Millipore)的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰蛋白酶處理并重懸在缺乏任何誘導(dǎo)信號(hào)的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中。N2/B27制劑型在別處有報(bào)道(Ying，2003)。
[0144]在所有的間充質(zhì)干細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中，來(lái)自人體胎盤(pán)的原代多能間充質(zhì)干細(xì)胞(在傳代8次時(shí)使用的細(xì)胞，由Ehrbar實(shí)驗(yàn)室提供)在含有15%血清(Invitrogen)的培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)。使用Aggrewell板(STEMCELL Technolog SARL)生成各具有250個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)，然后收獲所述細(xì)胞團(tuán)并用于凝膠封裝試驗(yàn)。在檢測(cè)中，為了刺激迀移，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加 50ng/ml PDGF (Peprotech)。
[0145]如在別處(Debnath，2003)所描述的，采用乳腺上皮細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)使用MCF10A細(xì)胞系進(jìn)行，所述MCF10A細(xì)胞系在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)并分化。如別處(Jin，2013;Schatz, 2000 ；Li, 2012 ;分別為胰腺的、子宮內(nèi)膜的、腸的)所概述的，使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)和試劑分離并分化原代上皮細(xì)胞團(tuán)。
[0146]存活率檢測(cè)
[0147]進(jìn)行存活率檢測(cè)以比較在2D和3D條件下的細(xì)胞行為。使野生型mESC經(jīng)胰蛋白酶處理并以1M細(xì)胞/ml接種到明膠涂覆的組織培養(yǎng)皿(2D)或包封到在600pa不降解(A)的水凝膠皿(3D)中。在+LIF無(wú)血清的條件下，在37°C ,5% C02下孵育4小時(shí)，然后根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用活/死細(xì)胞存活率檢測(cè)進(jìn)行染色。對(duì)三種獨(dú)立的樣品進(jìn)行常規(guī)(2D)或共聚焦(3D)熒光成像，然后人工計(jì)數(shù)活(綠色)與死(紅色)細(xì)胞的比例。
[0148]機(jī)械混合和分配
[0149]為了實(shí)現(xiàn)該方法的組合復(fù)雜度，使用具有納米移液器頭的Hamilton MicrolabStarPlus自動(dòng)液體處理機(jī)器人。所有的自動(dòng)化步驟使用4.1.1版MicroLab Vector軟件(HAMILTON Bonaduz AG, Switzerland)程序化。通過(guò)將谷氨酰胺-PEG 前體(Q-PEG)與四種不同的賴(lài)氨酸-PEG前體:W-PEG、A-PEG, V-PEG、G-PEG混合，制備與四種肽相對(duì)應(yīng)的預(yù)混合的化學(xué)計(jì)量平衡的PEG溶液的儲(chǔ)備液。這四種儲(chǔ)備液各自稀釋到實(shí)現(xiàn)匹配的目標(biāo)剛度所需的流變學(xué)確定的四種相應(yīng)濃度。稀釋和過(guò)程的所有隨后的步驟由機(jī)器人進(jìn)行，優(yōu)化用于每種材料類(lèi)別的流體處理參數(shù)并通過(guò)在天平上進(jìn)行質(zhì)量測(cè)量來(lái)檢查(數(shù)據(jù)未示出)。重要的，使最終的總體積的30%是空的(備用體積)用于隨后添加蛋白、細(xì)胞和因子X(jué)llla(每種組分為總體積的10% )。將這16種組合等分到384-孔板的256個(gè)孔中。將EC和CC蛋白在冰上解凍，稀釋到500nM的濃度并置于冷卻的384孔板的孔中。以正交的方式將四種EC蛋白(包括空白對(duì)照)分配到256個(gè)充滿(mǎn)凝膠前體的孔中，然后是四種CC蛋白，以在該步驟的最后獲得MP、DG、EC和CC的256個(gè)獨(dú)特的組合(4x4x4x4)。使用含以下三種可溶性因子和空白對(duì)照的培養(yǎng)基制備96孔板:10ng/ml的FGF4、BMP4 (R&D Systems)和106U/ml的LIF (Mi 11 ipore) ο將細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶處理并以lx 106個(gè)細(xì)胞/ml的濃度重懸在無(wú)血清的培養(yǎng)基中并保持在冰上。同時(shí)將冰凍的等份的因子X(jué)llla解凍并也保持在冰上。然后以順序的方式將細(xì)胞分配到混合凝膠前體的八個(gè)孔中，然后將因子X(jué)llla迅速分配并經(jīng)機(jī)器人混合。在添加因子X(jué)llla后，并且在膠凝開(kāi)始之前(大約2-3分鐘)，緊接著使用八通道納米移液器從每個(gè)孔中吸12.5 μ 1并在1536孔板的12個(gè)孔中分配1 μ 1。該過(guò)程重復(fù)共八次/1536板(12χ 8通道X 8次χ12滴/ (通道.次)=768滴)以充滿(mǎn)1536孔板的一半。在整個(gè)過(guò)程中，1536孔板冷卻至4°C以阻止蒸發(fā)。在凝膠分配輪次的最后，將96孔板中的4種不同的培養(yǎng)基分配到1536實(shí)驗(yàn)板中。培養(yǎng)基的分配步驟也順序進(jìn)行并同步，從而使所有的凝膠交聯(lián)約30分鐘。從胰蛋白酶處理到完成培養(yǎng)基分配的整個(gè)過(guò)程耗費(fèi)兩個(gè)小時(shí)，并且整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了四次(4x 4個(gè)二分之一板的1536個(gè)孔=3072個(gè)孔)。
[0150]對(duì)于神經(jīng)上皮分化實(shí)驗(yàn)，在第一陣列中使用除了細(xì)胞間相互作用蛋白以外的所有其它組合進(jìn)行可溶性因子調(diào)節(jié)。在第二陣列中，所有的細(xì)胞間相互作用蛋白針對(duì)除了可溶性因子以外的所有其它條件測(cè)試，其被