離散的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的陣列、制備該陣列的方法及其用圖
【專利說(shuō)明】離散的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的陣列、制備該陣列的方法及其用途
[0001]本發(fā)明涉及具有影響細(xì)胞的表型和命運(yùn)，即增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移的不同性質(zhì)，即不同的機(jī)械和/或生化性質(zhì)(即細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、降解性等)的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的離散體積的陣列，制備該陣列的方法，制備該陣列的組件試劑盒和測(cè)試水凝膠制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)行為，特別是難以培養(yǎng)的細(xì)胞類型，例如干細(xì)胞的影響的組合方法。
【背景技術(shù)】
[0002]多年來(lái)已知的是，將二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)以及天然來(lái)源的三維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)作為模型以闡明復(fù)雜的細(xì)胞行為，尤其是在癌癥或干細(xì)胞研究的領(lǐng)域。
[0003]二維細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)具有的缺點(diǎn)是不能實(shí)現(xiàn)與在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的那些很類似的基因表達(dá)模式和細(xì)胞表型。進(jìn)一步地，不能期望它們忠實(shí)地復(fù)制體內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的某些關(guān)鍵的生理學(xué)特性，尤其是空間約束、蛋白水解重構(gòu)、剛性介導(dǎo)(stiffness-mediated)的力學(xué)轉(zhuǎn)導(dǎo)和配體呈遞的適當(dāng)模式。
[0004]天然來(lái)源的3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的組成未明確確定并且顯示出批次間差異，使得以系統(tǒng)的方法改變它們的性質(zhì)并且獨(dú)立地控制它們的關(guān)鍵基質(zhì)參數(shù)是不可能的。
[0005]因此，本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，尤其是提供能夠快速識(shí)別控制希望的細(xì)胞行為的細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的工具和方法。
[0006]發(fā)曰月概沐
[0007]本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的離散體積的陣列，所述微環(huán)境(優(yōu)選地各自)具有影響包封的細(xì)胞的行為的不同性質(zhì)。
[0008]如本文所理解的，術(shù)語(yǔ)“包封在細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中”或類似的表達(dá)指細(xì)胞(或多種細(xì)胞)以如下的方式被包埋在基質(zhì)中:它們被所述基質(zhì)完全地包圍，從而模擬天然存在的細(xì)胞生長(zhǎng)條件。
[0009]如本文所理解的，術(shù)語(yǔ)“微環(huán)境”或“微環(huán)境的體積”分別指適于高通量測(cè)試設(shè)備，尤其是多孔板的體積。在多孔板中被分析的典型體積的范圍為約lOOnl至約500 μ 1，優(yōu)選為約200nl至約20 μ Ιο
[0010]術(shù)語(yǔ)“離散的體積”涉及在陣列內(nèi)空間上分離的點(diǎn)或區(qū)域。分離的點(diǎn)或區(qū)域可以相互接觸或通過(guò)例如塑料屏障相互分離。在這些離散的體積的每一個(gè)之中或之上，希望的細(xì)胞類型的細(xì)胞可以以這樣的方法放置，以使它們相互分離。它們從試驗(yàn)開(kāi)始就不相互接觸，并且隨著時(shí)間保持，從而獨(dú)立于鄰近的體積生長(zhǎng)并且僅僅受它們的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的影響。
[0011]具體地，可以使用三維水凝膠的陣列，所述三維水凝膠具有離散的體積并且具有影響細(xì)胞的增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移的不同性質(zhì)。使用的水凝膠通過(guò)交聯(lián)水凝膠前體分子獲得，優(yōu)選為親水聚合物，例如基于聚(乙二醇)(PEG)的聚合物，最優(yōu)選為通過(guò)與細(xì)胞相容的交聯(lián)反應(yīng)交聯(lián)的多臂的基于PEG的聚合物。
[0012]如本文所理解的，“通過(guò)細(xì)胞相容的反應(yīng)(或多種反應(yīng))可交聯(lián)的”(或類似術(shù)語(yǔ))包括基于以下兩者的反應(yīng):(i)共價(jià)鍵形成，選自a)酶催化的反應(yīng)，優(yōu)選其依賴于活化的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶因子X(jué)llla ;以及b)非酶催化的反應(yīng)和/或非催化的反應(yīng)，優(yōu)選為邁克爾加成反應(yīng)；和/或ii)非共價(jià)鍵形成(例如基于疏水相互作用、Η鍵、范德華力或靜電相互作用；特別是通過(guò)溫度變化或緩沖液的離子強(qiáng)度的變化誘導(dǎo)的)。
[0013]在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇基于PEG的前體分子，以使通過(guò)詳述于2007年Ehrbar等人的交聯(lián)機(jī)制在生理?xiàng)l件下使用凝血酶活化因子X(jué)llla，或通過(guò)詳述于2003年Lutolf等人的交聯(lián)機(jī)制通過(guò)溫和化學(xué)反應(yīng)是可交聯(lián)的。
[0014]在所述陣列的離散的體積中，水凝膠前體分子的交聯(lián)在將被研究的細(xì)胞類型的存在下以這樣的方式實(shí)現(xiàn)，將細(xì)胞通過(guò)水凝膠基質(zhì)包封，即細(xì)胞處在不同的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中。
[0015]在3D中，來(lái)自細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的各種力學(xué)和生化因子在增殖/自我更新、分化、迀移和/或集落形成方面影響細(xì)胞的行為。在根據(jù)本發(fā)明的陣列中，這些因子可以在體積與體積之間不同，并且因此能夠在許多，優(yōu)選為數(shù)百或數(shù)千的獨(dú)特細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中同時(shí)研究單個(gè)因子或因子的組合對(duì)細(xì)胞類型的影響。這樣，可以系統(tǒng)地剖析在細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中個(gè)體因子對(duì)細(xì)胞命運(yùn)的作用，尤其是可以快速地確定控制難以培養(yǎng)的細(xì)胞類型，例如干細(xì)胞的行為的水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境。
[0016]根據(jù)本發(fā)明的三維水凝膠基質(zhì)的力學(xué)性質(zhì)可以通過(guò)改變細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的聚合物含量以及聚合物凝膠前體的分子量和/或官能度(可以用于交聯(lián)的位點(diǎn)的數(shù)目)而變化。因此，例如由楊氏模量(E)表示的基質(zhì)的剛度可以在300到5400pa之間變化。
[0017]進(jìn)一步地，通過(guò)將對(duì)細(xì)胞分泌的蛋白酶例如基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)或纖溶酶具有不同敏感性(即krat/Kj的肽引入基質(zhì)，賦予凝膠基質(zhì)降解特性，使得基質(zhì)的物化性質(zhì)可以隨著時(shí)間變化。當(dāng)?shù)鞍酌竿ㄟ^(guò)細(xì)胞分泌時(shí)，基質(zhì)對(duì)蛋白酶的敏感性和所產(chǎn)生的物化性質(zhì)的變化實(shí)現(xiàn)了在三維基質(zhì)中高效的細(xì)胞增殖和迀移。為了匹配對(duì)蛋白質(zhì)降解具有不同敏感性的水凝膠基質(zhì)的力學(xué)性質(zhì)，基質(zhì)的前體含量可以通過(guò)改變基質(zhì)的聚合物前體的含量、聚合物凝膠前體的分子量和/或官能度(可用于交聯(lián)的位點(diǎn)的數(shù)目)進(jìn)行微調(diào)。如在以下更詳細(xì)概述的，在基于PEG的水凝膠基質(zhì)中，對(duì)蛋白酶的敏感性可以例如通過(guò)將對(duì)細(xì)胞分泌的蛋白酶具有不同敏感性的不同肽序列引入基質(zhì)前體分子而改變。
[0018]細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的生化性質(zhì)可以通過(guò)將一種或多種生物活性分子添加到所述基質(zhì)調(diào)整。如本文所使用的，這些生物活性分子可以選自，例如以下的組:
[0019]i)源于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的因子；
[0020]ii)細(xì)胞間相互作用因子；和/或
[0021]iii)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子。
[0022]使用的源于細(xì)胞外基質(zhì)的因子i)可以是，例如ECM蛋白，例如層粘連蛋白、膠原蛋白、多種彈性蛋白(elastins)、纖連蛋白或彈性蛋白(elastin)，蛋白聚糖，例如硫酸肝素或硫酸軟骨素，非蛋白聚糖的多糖例如透明質(zhì)酸，或基質(zhì)細(xì)胞蛋白，例如蛋白質(zhì)CN家族的那些、微管蛋白、骨橋蛋白、骨膜蛋白、SPARC家族成員、腱糖蛋白或血小板反應(yīng)蛋白。這些ECM因子可以以全長(zhǎng)形式或者作為更小的功能結(jié)構(gòu)單元例如肽和低聚糖使用。
[0023]使用的細(xì)胞間相互作用蛋白ii)大多數(shù)為跨膜蛋白，可以是參與細(xì)胞間粘附的蛋白質(zhì)，例如鈣粘素、選擇蛋白或?qū)儆贗g超家族(ICAM和VCAM)的細(xì)胞粘附分子(CAM)或跨膜細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的組分例如S樣和Jagged Notch配體。
[0024]使用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子iii)可以是生長(zhǎng)因子或發(fā)育形態(tài)因子，例如以下家族的那些:腎上腺髓質(zhì)素(AM)、血管生成素(Ang)、自分泌運(yùn)動(dòng)因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、促紅細(xì)胞生成素(ΕΡ0)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、生長(zhǎng)分化因子-9(GDF9)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)、肝癌源性生長(zhǎng)因子(HDGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)、白血病抑制因子(LIF)、迀移刺激因子、肌肉生長(zhǎng)抑制素(⑶F-8)、神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)和其它神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白、血小板源性生長(zhǎng)因子(TOGF)、血小板生成素(ΤΡ0)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α (TGF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)、腫瘤壞死因子a (TNF-a)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(P1GF)或細(xì)胞因子或趨化因子的大類的成員。
[0025]在交聯(lián)之前或過(guò)程中，源于細(xì)胞外基質(zhì)的因子i)和細(xì)胞間相互作用的因子ii)可以位點(diǎn)特異性地附著到水凝膠基質(zhì)。使用生物活性分子對(duì)凝膠的官能化可以通過(guò)在生物分子上的自由官能團(tuán)(例如胺基或巰基)之間直接形成共價(jià)鍵，或用于交聯(lián)酶(例如谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶)和凝膠網(wǎng)絡(luò)的肽底物，或者通過(guò)嵌合/標(biāo)記蛋白上的結(jié)構(gòu)域和連接到所述凝膠的輔助蛋白之間的親和結(jié)合實(shí)現(xiàn)。標(biāo)記蛋白包括具有Fc標(biāo)記、生物素標(biāo)記或His標(biāo)記的那些，從而能夠結(jié)合到蛋白質(zhì)A(或蛋白質(zhì)G、蛋白質(zhì)A/G)、鏈霉親和素(或抗生物素蛋白)或ΝΤΑο
[0026]生物分子可能需要不同的對(duì)水凝膠網(wǎng)絡(luò)的凝膠連接(gel-tethering)策略。較大的源自ECM或ECM模擬蛋白和肽優(yōu)選通過(guò)使用線性、異源雙官能連接體的非特異性連接附著到水凝膠。這樣的連接體的一個(gè)官能團(tuán)對(duì)連接到聚合物鏈末端的官能團(tuán)，優(yōu)選巰基有反應(yīng)性。所述連接體的其它官能團(tuán)能夠通過(guò)其胺基非特異性連接到感興趣的生物分子。后者的官能團(tuán)選自:琥珀酰亞胺活性酯，如N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、琥珀酰亞胺a-甲基丁酸酯、琥珀酰亞胺丙酸酯；醛；硫醇；巰基選擇性基團(tuán)如丙烯酸酯、馬來(lái)酰亞胺或乙烯砜；吡啶硫酯和吡啶二硫化物。優(yōu)選地，NHS-PEG-馬來(lái)酰亞胺連接體連接到生物分子。
[0027]細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子iii)可以在空間上分離的區(qū)域中以可溶的形式添加到包封細(xì)胞的交聯(lián)的水凝膠基質(zhì)，從而能夠自由地?cái)U(kuò)散進(jìn)入基質(zhì)以到達(dá)所述細(xì)胞。供選擇地，它們可以以與如上所述的用于源于細(xì)胞外基質(zhì)的因子i)和細(xì)胞間相互作用因子ii)的相同方式連接到基質(zhì)。
[0028]本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及制備本文所概述的陣列的方法。具體地，所述方法包括以下步驟:
[0029]a)提供一種或多種不同的水凝膠前體分子；
[0030]b)將根據(jù)步驟a)的水凝膠前體分子的不同組合結(jié)合并分配到基底的離散的體積之上/之中，所述基材優(yōu)選為多孔板；
[0031]c)向所述離散的體積添加一種或多種生物活性分子并且將所述分子連接到存在的所述水凝膠前體分子或在步驟e)形成的水凝膠中的至少一種或允許它們自由地?cái)U(kuò)散；
[0032]d)將細(xì)胞添加到所述基底的離散的體積之上/之中，和
[0033]e)將所述水凝膠前體分子交聯(lián)以形成水凝膠基質(zhì)。
[0034]在以上描述的方法的步驟a)中，使用的水凝膠前體分子優(yōu)選為經(jīng)化學(xué)或酶促反應(yīng)聚合的基于PEG的前體，生物分子可以連接到其上并且其可以通過(guò)不損害細(xì)胞活力的機(jī)制交聯(lián)。如果基于PEG的前體包括用于谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶例如因子X(jué)llla的(具有谷氨酰胺和賴氨酸的)肽底物，交聯(lián)可以借助該酶實(shí)現(xiàn)。最優(yōu)選地，前體分子還包括不同蛋白水解敏感性的肽序列以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞介導(dǎo)的水凝膠降解，即基質(zhì)隨著時(shí)間在結(jié)構(gòu)和力學(xué)性質(zhì)上的局部變化。
[0035]以上描述的方法的步驟b)優(yōu)選使用用于凝膠制造和微型化樣品的自動(dòng)方法實(shí)現(xiàn)，以實(shí)現(xiàn)在配制具有大量不同的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的3D含細(xì)胞的基質(zhì)所需的多樣性水平，并且還實(shí)現(xiàn)所需的重復(fù)。為了這個(gè)目的，優(yōu)選使用市售的液體處理機(jī)器人，以完全自動(dòng)的方式將根據(jù)步驟a)的前體分子的每種獨(dú)特混合物的低至100至500納升的體積精確地合成到基底例如載玻片上，或優(yōu)選的多孔板例如標(biāo)準(zhǔn)的1536多孔板中，優(yōu)選一式三份。優(yōu)選后一種形式，因?yàn)樗峁┧x的水凝膠滴的理想表面體積比并且代表了可以適用于各種實(shí)驗(yàn)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)形式。一旦生成3D水凝膠基質(zhì)，系統(tǒng)可以充當(dāng)多模式檢測(cè)平臺(tái)，其中可以平行獲得多個(gè)讀數(shù)。
[0036]在以上描述方法的步驟c)中，生物活性分子如在上文中所概述的進(jìn)行選擇。
[0037]在步驟e)中，將水凝膠前體分子交聯(lián)以形成三維水凝膠基質(zhì)可以通過(guò)使用至少一種交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)。當(dāng)使用基于PEG的前體分子時(shí)，選擇的交聯(lián)劑是凝血酶活化因子X(jué)llla或具有MMP-敏感底物的化學(xué)反應(yīng)性雙官能寡肽(詳述于Lutolf等人，2003)。然而，還可以想到的是，當(dāng)兩種彼此之間容易反應(yīng)的不同前體分子組合時(shí)，交聯(lián)可能會(huì)立刻發(fā)生(例如通過(guò)高選擇性的所謂的點(diǎn)擊化學(xué)或其它化學(xué)的而不是酶催化的反應(yīng)，例如邁克爾型加成反應(yīng))Ο
[0038]在之后的時(shí)間點(diǎn)，分配的水凝膠前體的陣列可以存儲(chǔ)和使用(即用來(lái)接觸細(xì)胞以用于篩選試驗(yàn))。存儲(chǔ)優(yōu)選在多孔板(例如96-、384_或1536-孔板)中進(jìn)行并且可以使用溶液中的前體(其中沒(méi)有交聯(lián)劑)或別的凍干前體(即粉末)實(shí)現(xiàn)。所述粉末是未反應(yīng)的并且保持未反應(yīng)狀態(tài)，意味著前體的結(jié)構(gòu)組分(如PEG)與交聯(lián)劑幾乎沒(méi)有反應(yīng)。在例如加入緩沖液時(shí)，將凍干前體溶解然后可以相互反應(yīng)。
[0039]本發(fā)明的再另一方面涉及測(cè)試水凝膠制劑對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)行為的影響的組合方法。具體地，所述組合方法包括以下步驟:
[0040]a)提供一種或多種不同的水凝膠前體分子；
[0041]b)將根據(jù)步驟a)的水凝膠前體分子的不同組合結(jié)合并分配到基底的離散的體積之上/之中，所述基底優(yōu)選為多孔板；
[0042]c)向所述基底的離散的體積進(jìn)一步添加一種或多種生物活性分子并且將所述分子連接到存在的水凝膠前體分子或在步驟e)形成的水凝膠中的至少一種或允許它們自由地?cái)U(kuò)散；
[0043]d)將(希望的細(xì)胞類型的)細(xì)胞添加到所述基底的離散的體積之上/之中，和
[0044]e)將所述水凝膠前體分子交聯(lián)以形成水凝膠基質(zhì)；
[0045]f)使所述細(xì)胞在所述水凝膠基質(zhì)的所述離散的體積中生長(zhǎng)(并改變它們的行為)；
[0046]g)在步驟f)過(guò)程中，隨時(shí)間推移監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞；
[0047]h)針對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境測(cè)定行為，其中所述行為優(yōu)選地選自:增殖程度、集落形成、分化、迀移或其組合，優(yōu)選地針對(duì)不同細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的全部陣列測(cè)定行為；
[0048]i)任選地，測(cè)定在生物活性分子和/或力學(xué)性質(zhì)彼此之間的協(xié)同和/或拮抗作用和/或所述離散的細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境對(duì)于酶降解的敏感性，優(yōu)選地通過(guò)蛋白酶測(cè)定；
[0049]j)任選地，確定指示特定細(xì)胞行為的具體水凝膠制劑，或水凝膠制劑的范圍；
[0050]k)任選地，將細(xì)胞從至少一種水凝膠細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境中分離用于進(jìn)一步分析，優(yōu)選為表型檢測(cè)，或用于連續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)或傳代。
[0051]在步驟a)中使用的不同水凝膠前體分子優(yōu)選地如本文別處所概述的進(jìn)行選擇。
[0052]上述的組合方法的步驟b)優(yōu)選使用在本文別處所概述的自動(dòng)方法進(jìn)行。
[0053]在上述的組合方法的步驟c)中，提到的所述生物活性分子可以如本文別處所概述的進(jìn)行選擇。
[0054]在步驟e)中，在步驟a中提供的所述水凝膠前體分子的交聯(lián)可以如本文別處所述的實(shí)現(xiàn)。
[0055]在組合方法步驟f)中，所述細(xì)胞能夠在水凝膠基質(zhì)的離散的體積中增殖/自我更新、形成集落、分化和/或迀移，優(yōu)選持續(xù)數(shù)天直至數(shù)周。
[0056]在組合方法步驟g)中，細(xì)胞行為的監(jiān)測(cè)可以以固定的時(shí)間間隔進(jìn)行，例如在某些天數(shù)之后，并重復(fù)。監(jiān)測(cè)例如使用自動(dòng)成像技術(shù)，常規(guī)的或共聚焦鏡檢進(jìn)行，并且可以包括實(shí)時(shí)成像。
[0057]在組合方法步驟h)中，不同細(xì)胞培養(yǎng)微環(huán)境的增殖/自我更新、集落形成、分化和/或迀移行為的測(cè)定，例如可以如下實(shí)現(xiàn):使用寬視野顯微技術(shù)或使用細(xì)胞表達(dá)熒光標(biāo)記，如綠色熒光蛋白(GFP)