r>[0091] 氯化膽堿濃度越高，培養(yǎng)基的成本越高。因此，從成本角度看，太高的氯化膽堿濃 度是不利的。此外，氯化膽堿含量有助于培養(yǎng)基的重量摩爾滲透壓濃度。太高的氯化膽堿 濃度可W是不利的，因為它們可W與其他培養(yǎng)基成分一起導致高于所希望的重量摩爾滲透 壓濃度的總重量摩爾滲透壓濃度。尤其是在補料分批方法中，不希望使用太高的起始重量 摩爾滲透壓濃度，因為運可W對流加策略（feedingstrategy)施加限制。
[0092] 由于W上原因，發(fā)明人認為最適氯化膽堿濃度在本文所示的極限之內(nèi)。
[0093] 如果使用氯化膽堿之外的膽堿化合物，則W等同濃度利用它們。等同濃度意指達 到與按W上范圍內(nèi)的濃度使用氯化膽堿時所達到的膽堿濃度范圍相同的范圍內(nèi)的膽堿摩 爾濃度。
[0094]根據(jù)本發(fā)明的第一方面，細胞培養(yǎng)基僅包含表示為總氨基酸濃度的有限含量的氨 基酸。更具體而言，本發(fā)明的第一方面的細胞培養(yǎng)基的特征在于20至57mmol/L的總氨基酸 濃度?？偘被釢舛瓤蒞高于25mmol/X、高于30mmol/X、高于35mmol/L或甚至高于40mmol/ L。此外，總氨基酸濃度可W低于54mmol/L。總氨基酸濃度可W是例如約51mmol/L。
[0095] 同時，氯化膽堿濃度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選的范圍 和值也如上文所述。
[0096] 本發(fā)明的第一方面的細胞培養(yǎng)基尤其可W用作生產(chǎn)培養(yǎng)基來在生產(chǎn)期期間達到 高細胞生長、高活細胞密度和高多膚效價。此外，達到重組產(chǎn)物的更高的產(chǎn)物質(zhì)量，尤其是 就更少的聚集和/或更好的翻譯后修飾而言，如改善的糖基化模式。
[0097] 近年已對氨基酸谷氨酷胺對細胞培養(yǎng)物的生長和得到的多膚生產(chǎn)率的作用進行 了廣泛的研究。已發(fā)現(xiàn)，谷氨酷胺不僅是用于多膚合成的重要構(gòu)件，還代表了哺乳動物細胞 的初級能源。因此，通常在用于多膚產(chǎn)生的細胞培養(yǎng)基中包含高濃度的谷氨酷胺。尤其是 在工業(yè)規(guī)模，細胞培養(yǎng)基中高量的谷氨酷胺對細胞生長和多膚表達很重要。
[0098] 然而，谷氨酷胺代謝導致谷氨酷胺的分解和錠離子的累積，已知錠離子對細胞生 長和多膚產(chǎn)生是有毒性的副產(chǎn)物。因此，希望限制細胞培養(yǎng)物中谷氨酷胺的量。現(xiàn)有技 術(shù)中已提出了幾種谷氨酷胺替代劑，例如谷氨酸。但是，已描述了在補料分批方法中用 谷氨酸替代谷氨酷胺導致較少的副產(chǎn)物形成，但也導致較低的生產(chǎn)力值overskog等，J. Biotechnol.，1997, 59, 103-115)。因此，希望得到包含降低量的谷氨酷胺，同時仍允許高細 胞生長和高多膚生產(chǎn)力的細胞培養(yǎng)基。
[0099] 已發(fā)現(xiàn)，高量氯化膽堿的加入允許尤其是在生產(chǎn)期期間使用與一些已知培養(yǎng)基相 比包含降低量的谷氨酷胺的培養(yǎng)基，同時細胞的生產(chǎn)力保持基本不受影響。
[0100] 因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供進一步包含最適量的谷氨酷胺的細胞培養(yǎng)基， 與來自現(xiàn)有技術(shù)的培養(yǎng)基相比，該最適量顯著降低。該細胞培養(yǎng)基還可W無谷氨酷胺替代 劑，如谷氨酸等。該細胞培養(yǎng)基任選W500至1400mg/L、800至1400mg/L或900至1200mg/ L的濃度包含谷氨酷胺。
[010。 同時，氯化膽堿濃度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選的范圍 和值也如上文所述。此外，同時細胞培養(yǎng)基中的總氨基酸濃度為20至5711111101/1，優(yōu)選的范 圍和值也如上文所述。
[0102] 根據(jù)本發(fā)明的第一方面的另一可選的修改，單種氨基酸各自的量如下文所定義。
[0103] 運類中等量的氨基酸仍然高于如DMEM或RPMI的常規(guī)細胞培養(yǎng)基中所包含的氨基 酸的量，但同時顯著低于用于大規(guī)模生產(chǎn)的典型生產(chǎn)培養(yǎng)基中所包含的氨基酸的量。
[0104] 尤其是在W大規(guī)?；蛏踔凉I(yè)規(guī)模進行多膚產(chǎn)生時，認為增加生產(chǎn)培養(yǎng)基中氨基 酸的量對高生產(chǎn)力和高產(chǎn)物質(zhì)量很重要。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)，尤其是在生產(chǎn)期期間使用的細胞培養(yǎng) 基中，高量氯化膽堿的存在允許限制單種氨基酸的量。
[0105] 本發(fā)明的第一方面的此可選的修改的細胞培養(yǎng)基中單種氨基酸的含量按W下用 mmol/L表示的量包含W下氨基酸：
[0106]精氨酸 4. 0-6. 0,優(yōu)選 4. 5-5. 5
[0107]天冬酷胺 3. 0-6. 0，優(yōu)選 4. 0-5. 5
[010引 天冬氨酸2. 5-4. 0，優(yōu)選3. 0-3.6
[0109]甘氨酸 0. 3-0.8，優(yōu)選 0. 5-0. 7
[0110]組氨酸 0. 6-1. 0,優(yōu)選 0. 7-0. 9
[0111]異亮氨酸 2. 0-5.0,優(yōu)選 3. 0-4.0
[0112] 亮氨酸3.0-7.0，優(yōu)選3.s-e.0
[0113]賴氨酸 2. 0-4. 0,優(yōu)選 2. 5-3. 5
[0114]甲硫氨酸 1. 0-1. 5,優(yōu)選 1. 2-1. 4
[0115]苯丙氨酸 1.0-2. 0,優(yōu)選 1.3-1.8
[0116]脯氨酸 2. 5-6. 0，優(yōu)選 3. 0-5. 5
[0117]絲氨酸 3. 0-8. 0,優(yōu)選 4. 0-7. 0
[0118]蘇氨酸 2.0-3. 5,優(yōu)選 2. 5-3.1
[0119]色氨酸 0. 4-1. 0,優(yōu)選 0.S-O.8
[0120] 鄉(xiāng)氨酸 2. 5-5. 0,優(yōu)選 3. 0-4. 5
[0121] 谷氨酷胺6. 0-10. 0,優(yōu)選 7.5-9. 0
[0122] 酪氨酸1.0-2.0,優(yōu)選1.2-1.8
[0123]半脫氨酸 0. 5-1. 0,優(yōu)選 0. 6-0.8
[0124] 同時，氯化膽堿濃度如上文所述，即，在60mg/L至2500mg/L的范圍內(nèi)，優(yōu)選的范圍 和值也如上文所述。此外，同時細胞培養(yǎng)基中的總氨基酸濃度為20至57111111〇1/1，優(yōu)選的范 圍和值也如上文所述。
[0125]由于高含量的氯化膽堿，各氨基酸的量可W顯著低于用于多膚的大規(guī)模產(chǎn)生的其 他細胞培養(yǎng)基中所使用的量。換言之，高量氯化膽堿的加入允許顯著降低大多數(shù)氨基酸的 量而不劣化細胞生長、細胞存活率和多膚效價。運具有運樣的技術(shù)優(yōu)勢，可W使用所包含的 大多數(shù)氨基酸的濃度較低的細胞培養(yǎng)基，從而避免溶解性較差的細胞培養(yǎng)基成分的沉淀問 題。此外，就細胞培養(yǎng)基而言可W達到顯著的成本降低，但多膚產(chǎn)物的總體質(zhì)量和產(chǎn)率未受 影響或甚至可W得到改善。如下文所述，可W通過使用本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基來減少重組多 膚產(chǎn)物的聚集。此外，還獲得了更好的翻譯后修飾（如改善的糖基化模式）或其他蛋白質(zhì) 質(zhì)量屬性（如重組多膚的更低的聚集）。在一些情況下，本發(fā)明公開的細胞培養(yǎng)基的修改甚 至有助于改善細胞存活率和細胞生長，W及得到的多膚效價。
[0126] 術(shù)語"細胞培養(yǎng)基"指營養(yǎng)物的水溶液，其可W用來培養(yǎng)細胞延長的時期。通常， 細胞培養(yǎng)基包含W下成分：能量來源，其通常將是糖類化合物，優(yōu)選葡萄糖；氨基酸，優(yōu)選 堿性組的氨基酸，包括所有必需和非必需氨基酸；維生素和/或W低濃度需要的其他有機 化合物；游離脂肪酸；無機化合物，包括痕量元素，無機鹽；緩沖化合物；及核巧和堿基。
[0127] 術(shù)語"生長培養(yǎng)基"指通常在總體產(chǎn)生方法的擴大期期間使用的細胞培養(yǎng)基。擴 大期是總體培養(yǎng)/產(chǎn)生方法的第一時期，其主要表征為高細胞生長和較少的多膚產(chǎn)生。擴 大期服務于擴大細胞的目的，擴大細胞意指產(chǎn)生足夠數(shù)目的處于指數(shù)生長期的細胞來接種 生產(chǎn)用生物反應器。
[012引術(shù)語"生產(chǎn)培養(yǎng)基"指通常在總體產(chǎn)生方法的生產(chǎn)期期間使用的細胞培養(yǎng)基。生 產(chǎn)期是總體培養(yǎng)/產(chǎn)生方法的第二時期，其服務于產(chǎn)生高量產(chǎn)物的目的。在生產(chǎn)期期間，應 盡可能長地將細胞維持在存活和高產(chǎn)的模式中。
[0129]由于安全性和污染問題，細胞培養(yǎng)基在制藥工業(yè)領域中，例如在產(chǎn)生治療活性重 組多膚中的用途一般不允許使用任何動物來源的材料。因此，本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基優(yōu)選是 無血清和/或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基。術(shù)語"無血清和/或無蛋白質(zhì)培養(yǎng)基"代表化學成分完全確 知的培養(yǎng)基，其不包含來自動物來源的添加劑，如組織水解物、胎牛血清等。此外，還優(yōu)選不 向本發(fā)明的細胞培養(yǎng)物中加入蛋白質(zhì)，尤其是生長因子，如膜島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白等。優(yōu)選地，本 發(fā)明的細胞培養(yǎng)基也不補充水解蛋白質(zhì)來源，如大豆、小麥或水稻蛋白腺或酵母水解物等。
[0130] 本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基可W用于多種細胞培養(yǎng)方法中?？少N壁培養(yǎng)，例如W單 層培養(yǎng)，或優(yōu)選W懸浮培養(yǎng)來進行細胞的培養(yǎng)。
[0131]可W例如通過工業(yè)生物技術(shù)中建立的多種發(fā)酵方法來使用細胞的大規(guī)模培養(yǎng)。使 用本發(fā)明的細胞培養(yǎng)基，可W利用不連續(xù)和連續(xù)的細胞培養(yǎng)方法，如灌流和恒化器。不連續(xù) 的方法（包括反復補料分批和反復分批）是一個優(yōu)選的實施方案。
[0132]分批細胞培養(yǎng)包括補料分批培養(yǎng)或簡單分批培養(yǎng)。術(shù)語"補料分批細胞培養(yǎng)"指 運樣的細胞培養(yǎng)，最初在培養(yǎng)瓶中提供細胞和細胞培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)過程中連續(xù)地或W離 散增加的形式向培養(yǎng)物中流加附加的培養(yǎng)營養(yǎng)物，在培養(yǎng)結(jié)束前定期收集或不收集細胞和 /或產(chǎn)物。術(shù)語"簡單分批培養(yǎng)"指運樣的方法，其中在起始培養(yǎng)過程時在培養(yǎng)瓶中提供包 括細胞和細胞培養(yǎng)基的所